专利名称：一种靶向银杏内酯b固体脂质纳米粒及其制备方法
技术领域：
本发明属医药领域，具体涉及一种靶向血脑屏障的银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法。
背景技术：
阿尔兹海默症(AD)是一种常见的老年慢性退行性神经疾病，患者脑组织萎缩，特别是海马和基底前神经元脱失。阿尔兹海默症患者具有两大病理特征形成了核心成分为 β-淀粉蛋白(Αβ)的细胞外老年斑(SP)，形成以过度磷酸化的Tau蛋白为主要成分的病变神经元内纤维缠结(NFTs)。病理学家推测两种病理特征最终引起神经元/轴突障碍或轴突死亡，从而导致脑细胞凋亡最终产生痴呆症状。目前被FDA和欧洲医药评价署批准用于治疗AD的药物只有5种。其中4种是乙酰胆碱酯酶抑制药(AChEI)，这类药物的作用是可以弥补AD患者脑中丢失胆碱能神经元所造成的功能性后果。银杏内酯是从银杏中提取出的一类萜类内酯类活性化合物，主要成分包括银杏内酯Α、B、C、J、M、K、L，白果内酯等，其中以银杏内酯B (GB)的活性最强。银杏内酯B是通过提高乙酰胆碱酯酶(AChE)活性从而促进乙酰胆碱合成，而提高脑中乙酰胆碱含量，弥补AD 患者脑中丢失胆碱能神经元所造成的功能性后果，达到抵抗AD的功效，银杏内酯还具有以下作用一是具有类似于脑源性神经营养因子的作用，可以促进胚基底前脑胆碱能神经元发育。二是具有类似于神经生长因子的作用，可有效抑制基底前脑胆碱能神经元凋亡及对皮层神经元凋亡的保护作用。本发明设想使用银杏内酯B作为治疗阿尔兹海默症的药物，但是要将GB有效运输至脑细胞内有以下两大障碍首先银杏内酯B为脂溶性药物，不溶于水的特性限制了其体内吸收分布特性，并且GB在体内的半衰期只有2 3小时，如果单纯以口服或溶液剂注射给药方式，药物无法大量有效的到达并且蓄积在脑组织。其次血脑屏障(BBB)是大脑的天然屏障，其细胞间特有的紧密连接有效的阻止了外源性物质进入脑细胞，包括药物或包裹了药物的药物递送系统。而物质透过BBB主要通过以下5中途径(I)亲水小分子通过紧密连接的被动转运；(2)亲脂物质的跨胞转运；(3)转运蛋白介导转运葡萄糖、氨基酸、胆碱等小分子营养物质；(4)受体介导转运蛋白质等大分子多肽；(5)通过静电作用力吸附阳离子物质后胞吞入脑。为解决上述所描述的问题，本专利发明一种靶向BBB的银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法，优势在于固体脂质纳米粒的骨架内核为脂质材料，可有效与银杏内酯B融合，且生物相容性佳，解决药物吸收差问题。固体脂质纳米粒外壳选用泊罗沙姆 (Pluronic)等表面活性剂，Pluronic长链中含有聚氧乙烯基团,其柔性亲水特性能避免载药固体脂质纳米粒被体内网状内皮系统吞噬，延长其在体循环中的时间，解决药物在体内停留时间短的问题。血脑屏障上有介导叶酸以及其体内活性形态四氢叶酸的受体存在，选择叶酸作为靶向配基修饰泊罗沙姆两端，利用其和大脑内皮细胞上叶酸受体的亲和力，使整个固体脂质纳米粒可以通由大脑细胞表面叶酸受体介导作用胞吞入脑。
发明内容
本发明针对由于血脑屏障对外源性物质的抵御作用而导致的药物无法进入脑组织，从而脑部疚病无法得到有效治疗的问题，设计了一种叶酸靶向材料修饰的载药固体脂质纳米粒，利用大脑内皮细胞表面的叶酸受体特异性识别叶酸配基和受体介导的吞噬作用，以及脂性的纳米粒材料与大脑细胞膜亲和力强和纳米粒吞噬透膜途径，帮助载药固体脂质纳米粒有效进入脑内发挥药效。本发明提供了以叶酸修饰的乳化剂作为靶向材料(或靶向乳化剂)，脂质材料作为载体的一种载银杏内酯B的固体脂质纳米粒及其制备方法，具体制备过程是(I)将脂质材料与靶向乳化剂混合，水浴加热至50 80°C至熔融。(2)将药物完全溶解在适量的甲醇、二氯甲烷、丙酮、氯仿之一或任意组合的有机溶剂中。(3)将药物溶液倾倒入(I)中，保温搅拌，直至溶剂挥发完全，此时药物已经很好的融合在液态脂质中。(4)将水溶性物质(如普通乳化剂)溶解在注射用水中，加热至50 80°C(5)将(4)倾倒入等温(3)中，50 80°C条件下搅拌2 4小时，形成初乳。(6)将(5)形成的初乳进行高速分散，得到熔融的固体脂质纳米粒，迅速将熔融的固体脂质纳米粒用冰水浴冷却，继续搅拌5 50min直至完全固化。(7)将(6)的固体脂质纳米粒挤压通过O. 8 μ m微孔滤膜5遍,得粒径80 200nm 的革巴向银杏内酯B固体脂质纳米粒溶液。药物是银杏内酯B，但不局限于此，药物还可以是银杏内酯A、C、J、M、K、L和白果内酯以及它们的组合物。靶向乳化剂为合成的叶酸-泊罗沙姆(FA-Pluronic)，叶酸-磷脂或其他叶酸修饰的具有表面活性的乳化剂。脂质材料可以是单取代、双取代、三取代的脂肪酸(硬脂酸、棕榈酸、山嵛酸、月桂酸等)甘油酯，脂肪酸或其他脂质中的一种或几种混合物。药物与脂质材料的质量比在I : 10 I : 50之间，优选I : 20;祀向乳化剂与普通乳化剂的质量比在I : 2 I : 5之间，优选2 3 ;脂质材料与全部乳化剂的质量比在 I : 2 2 : I之间，优选2 I ;药物与注射用水的用量的质量体积比为I : 2 2 : 1， 优选I : 2。高速分散的转速可以在5000 100000转/分钟之间，时间在4 10分钟之间， 优选7500转/分钟，时间4 6分钟。本发明提供了一种靶向血脑屏障的银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法，其中使用合成的叶酸修饰的乳化剂为靶向乳化剂，制得的靶向固体脂质纳米粒用光散射粒度仪测得粒径在80 200nm之间，用原子力显微镜观察结果显示为类球形或椭圆形(见附图 I)。该固体脂质纳米粒被含有聚氧乙烯链段的泊罗沙姆包裹，能避免被网状内皮系统吞噬， 有效延长药物在体内循环时间。纳米粒外侧的叶酸配基可被脑上皮细胞的叶酸受体识别， 包裹药物的脂性材料与细胞膜亲和力强，帮载药纳米粒通过受体介导吞噬和纳米粒吞噬途径透膜进入细胞内，从而达到治疗脑部疾病的目的。
图I是一种靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒原子力显微镜图。图2是叶酸修饰的泊罗沙姆的核磁1H图谱图3是图I中化学位移在4. 5ppm-8. 5ppm局部峰位放大图
具体实施例方式通过下面实施例说明本发明的具体实施方式
，但本发明的保护范围，不局限于此。实施例IFA-PluronicF68的合成⑴I. 15g对甲苯磺酰氯(TsCl)和800 μ I三乙胺置于三颈烧瓶中，加入适量无水二氯甲烷溶解。将溶有5. 00gPluronicF68的二氯甲烷溶液逐滴加入其中，室温氮气保护条件下磁力搅拌反应12小时。产物浓缩之后沉淀于适量冰乙醚中， 抽滤得沉淀物。重复溶解沉淀两次，沉淀物真空干燥24小时，得到F68-0TS。(2)取邻苯二甲酰亚胺钾(PI)O. 91g置于三口烧瓶中，加适量无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，120°C， 搅拌分散溶解；向其中滴加入溶有4. 00gF68-0Ts的DMF溶液，120°C，氮气保护下反应6小时。产物旋蒸除去DMF之后，加适量无水二氯甲烷超声溶解，离心除去其中的不溶物质，重复三次，合并上清液。浓缩之后沉淀于适量冰乙醚中，抽滤得沉淀物。重复溶解-沉淀两次，沉淀物室温下真空干燥24小时得到F68-PI。(3)取250 μ I水合肼置于三颈烧瓶中，用适量无水乙醇溶解，向其中逐渐滴加溶有2. 61gF68-PI的乙醇溶液，80°C、氮气保护下反应 12小时。浓缩产物，将其沉淀于适量无水冰乙醚中，抽滤得沉淀物。重复乙醇溶解-乙醚沉淀两次，沉淀物室温下真空干燥24小时得到F68-NH2。(4)取叶酸O. 30g, N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)O. 115g，二环己基碳二亚胺(DCC)O. 15g置于三颈烧瓶中，用适量二甲基亚砜溶解，氮气保护避光条件，室温下反应2小时对叶酸进行活化。加入2. 00gF68-NH2，避光反应 12小时。产物用拦截分子量3500Da的透析袋透析I天，初始I小时换水一次，3次之后改为3小时换水一次。I天之后将透析液离心，舍弃沉淀物(包括未被透出的叶酸以及二环己脲)，取上清液再透析一天，4小时换水一次。直接冷冻干燥即得，经核磁1H表征产物为 FA-PluronicF68(见附图 2，附图 3)。实施例2靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备取150mg单硬脂酸甘油酯、 30mgFA-PluronicF68水浴加热至60°C至熔融，将溶有7. 5mg银杏内酯B的甲醇溶液逐渐滴加进去，保持60°C，磁力搅拌2h，使得药物与脂质材料混合均匀，直到甲醇挥尽。加入15ml 加热至60°C的溶解有45mgPluronicF68的水溶液，磁力搅拌2h得到初乳，60°C，7500r/min 高速分散初乳6min,立即放置到4°C的冰水浴中固化5min成型,挤压过O. 8 μ m滤膜5遍, 得到靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒溶液。粒径大小为125. 8nm,多分散系数O. 380。实施例3靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备取150mg单硬脂酸甘油酯、 30mgFA-PluronicF68水浴加热至80摄氏度至熔融，将溶有7. 5mg银杏内酯B的甲醇溶液逐渐滴加进去，保持80°C，磁力搅拌2h，使得药物与脂质材料混合均匀，直到甲醇挥尽。加入15ml加热至80°C的溶解有45mgPluronicF68的水溶液，磁力搅拌2h得到初乳，80°C，7500r/min高速分散初乳6min，立即放置到4°C的冰水浴中固化5min成型，挤压过O. 8 μ m 滤膜5遍，得到靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒溶液。粒径大小为125.4nm，多分散系数 O.319。实施例4靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备取150mg单硬脂酸甘油酯、 30mgFA-PluronicF68水浴加热至80摄氏度至熔融，将溶有5. Omg银杏内酯B的甲醇溶液逐渐滴加进去，保持80°C，磁力搅拌2h，使得药物与脂质材料混合均匀，直到甲醇挥尽。加入IOml加热至80°C的溶解有40mgPluroniCF68的水溶液，磁力搅拌2h得到初乳，80°C， 10000r/min高速分散初乳4min，立即放置到4°C的冰水浴中固化5min成型，挤压过O. 8 μ m 滤膜5遍，得到靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒溶液。粒径大小为146.5nm，多分散系数 O. 279。
权利要求
1.一种靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法，其特征在于该靶向脂质纳米粒处方包含药物、脂质材料、普通乳化剂、叶酸修饰的乳化剂(靶向乳化剂)及注射用水；制备工艺包括①将脂质材料和靶向乳化剂，搅拌加热至50 80°C熔融，在保温搅拌条件下加入溶于少量有机溶剂的药物溶液，直至溶剂挥发完全，形成均匀药物脂质溶液，②将普通乳化剂溶解在注射用水中，加热至50 80°C，③将②倾倒入等温的①中，50 80°C条件下继续搅拌2 4小时，形成初乳，再进行高速分散，得到熔融的固体脂质纳米粒，④迅速将上述熔融的固体脂质纳米粒在搅拌下用冰水浴冷却5 50min，直至完全固化，⑤将固化的脂质纳米粒挤压过O. 8 μ m滤膜5遍,得到祀向银杏内酯B固体脂质纳米粒溶液。
2.根据权利要求I所述一种靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法，其特征在于药物是银杏内酯8，但不局限于此，药物还可以是银杏内酯么、(、1、1、1(、1^和白果内酯以及它们的组合物。
3.根据权利要求I所述一种靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法，其特征在于脂质材料可以是单取代、双取代、三取代的脂肪酸(硬脂酸、棕榈酸、山嵛酸、月桂酸等) 甘油酯，脂肪酸或其他脂质(如胆固醇)中的一种或几种混合物。
4.根据权利要求I所述一种银杏内酯B靶向固体脂质纳米粒及其制备方法，其特征在于普通乳化剂可以是各种型号泊罗沙姆，磷脂和其他具有表面活性的乳化剂(如吐温、胆酸钠)中的一种或几种组合物。
5.根据权利要求I所述一种靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法，其特征在于叶酸修饰的乳化剂为靶向材料，具体为合成的叶酸-泊罗沙姆(FA-Pluronic)、叶酸-磷脂或其他叶酸修饰的具有表面活性的乳化剂。
6.根据权利要求I所述一种靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法，其特征在于处方中药物与脂质材料的质量比在I : 10 I : 50之间，优选I : 20;祀向乳化剂与普通乳化剂的质量比在I : 2 I : 5之间，优选2 3 ;脂质材料与全部乳化剂的质量比在I: 2 2 : I之间，优选2 I ;药物与注射用水的用量的质量体积比为I : 2 2 : 1， 优选I : 2。
7.根据权利要求I所述的一种靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法，其特征在于制备工艺①中的有机溶剂可以是甲醇、二氯甲烷、丙酮、氯仿之一或任意组合。
8.根据权利要求I所述的一种靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于制备工艺③中高速分散的转速可以在5000 100000转/分钟之间，时间在4 10分钟之间，优选7500转/分钟，时间4 6分钟。
全文摘要
本发明公布了一种靶向银杏内酯B固体脂质纳米粒及其制备方法。以银杏内酯B为治疗药物，固体脂质材料为载体，叶酸修饰的表面活性剂作为靶向材料，表面活性剂和叶酸修饰的表面活性剂以一定比例混合物作为乳化剂，用水包油乳化法制得靶向血脑屏障的银杏内酯B固体脂质纳米粒。粒径为80～200nm，多分散系数0.30±0.10。该固体脂质纳米粒利用脑细胞表面的叶酸受体介导的吞噬作用和纳米粒吸附脑细胞膜的吞噬途径，达到脑靶向的作用。
文档编号A61P25/28GK102579342SQ20121003450
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者栾立标, 胡娟 申请人:中国药科大学