专利名称：一种格尔德霉素脂质体的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药学领域，涉及一种药物格尔德霉素的新剂型，具体涉及一种格尔德霉素脂质体及制备方法。本发明还涉及格尔德霉素脂质体作为抗肿瘤剂的应用。
背景技术：
Hsp90抑制剂格尔德霉素(geldanamycin，GA)为我国开发的一种新型强效的苯醌安莎类抗生素，它是由土壤中的吸水链霉菌格尔德变种产生的，通过竞争性结合Hsp90N末端ATP/ADP结构域，特异性的抑制Hsp90所必需的ATP酶活性，从而抑制了 Hsp90分子伴侣功能，从而改变Hsp90构象，使其不能与其靶蛋白(即客户蛋白)结合，抑制其行使正常的分子伴侣功能，最终导致靶蛋白降解，继而阻断肿瘤赖以生存的信号通路网络。对细胞增殖、凋亡和癌症发生都具有重要影响。研究表明，格尔德霉素对乳腺癌，结肠癌，胃癌，恶性胶质瘤，前列腺癌，肺癌，肝癌等都有作用。但由于格尔德霉素有以下几方面限制1 在动物模型推荐的剂量下，表现严重的肝毒性，存在有效剂量限制。2 它在体内的代谢很不稳定并且水溶性极差，因此在临床研究中受到限制。如果对药物进行设计，在提高药效的同时并且降低毒副作用，具有靶向性的给药系统就是一个很好的选择。脂质体是一种最常见的比较成熟的靶向给药系统。脂质体药物静脉注射动物或人体后，可以成功的到达原发性肿瘤抑制其生长和转移，显示出较强的治疗效果，轻微的副作用。脂质体药物载体大多是由磷脂，胆固醇等物质作为膜材而构成双分子层的封闭囊泡结构，膜材对所包裹的药物作用体现在不仅可以有效的防治药物被体内酶的分解破坏和体液稀释，延长药物的作用时间，还可以提高药物的生物相容性，使其生物利用度增加，增强治疗效果。肿瘤的发生是细胞的恶性增殖与细胞凋亡之间平衡失调的结果，目前已经证实多种抗癌药物的作用机制是通过诱导细胞凋亡而发挥抗癌效果。因此特异性地诱导肿瘤细胞凋亡的药物和治疗方法已成为当今肿瘤学研究的热点之一。格尔德霉素抗癌的作用机制不仅在于抑制细胞增殖，还在于诱发肿瘤细胞凋亡，但是由于细胞凋亡是一个多阶段，多系统参与极其复杂的过程，格尔德霉素诱导凋亡的机制有待进一步研究，格尔德霉素新的剂型格尔德霉素脂质体在抑制细胞增殖方面是否会显示出更好的效果，未见研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗肿瘤药物脂质体，其包含抗肿瘤活性剂，磷脂，根据需要还可以加入除磷脂以外的其他辅料。本发明所述的抗肿瘤活性剂为Hsp90抑制剂，所述的Hsp90抑制剂为格尔德霉素或其衍生物，优选格尔德霉素。本发明所述的磷脂选自卵磷脂，大豆磷脂，脑磷脂或人工合成磷脂中的一种或多种。本发明所述的脂质体，其中的抗肿瘤活性剂与磷脂的比例，按摩尔比计算，为抗肿瘤活性剂2-10 磷脂90-98。本发明的脂质体中的抗肿瘤活性剂浓度为0. 5-4mg/L0本发明的另一目的在于提供制备格尔德霉素脂质体的方法。本发明的目的还在于将格尔德霉素脂质体应用于制备抗肿瘤药物。本发明的格尔德霉素脂质体的制备方法是，将格尔德霉素与磷脂用氯仿溶解后， 旋转真空蒸发成膜，加入PBS，超声水化，得到格尔德霉素脂质体。优选的，本发明的制备格尔德霉素脂质体的具体方法，如下按摩尔百分比取各组分抗肿瘤活性剂格尔德霉素2-10份；磷脂90-98份，将上述各组分置于茄形瓶中并用氯仿溶解，旋转真空蒸发成脂膜(37°C)。置于干燥器中避光放置池左右，充分挥去有机溶剂。将在37°C温浴好的PBS (PH = 7. 4)的缓冲溶液加入到脂膜中，先水浴超声(30°C超声分散15min)，并不时振摇。然后探头超声(冰浴，超声:3min)。 即得格尔德霉素脂质体。上述涉及到的磷脂可以选用卵磷脂，大豆磷脂，脑磷脂或人工合成磷脂中的一种或多种。上述所制备的格尔德霉素脂质体中的抗肿瘤活性剂浓度为0. 2-10mg/L，优选为 0. 5-4mg/L。所制备的脂质体溶液经检测，粒径为150-200nm，Zeta电位为-20 _50mV，包封率达80%以上。本发明还包括所制备的格尔德霉素脂质体具有缓释功能，优选的各组分的配比为格尔德霉素0. 01-10% (W/V)，磷脂1-30% (W/V)，其余为ρΗ7· 4的等渗PBS，最优选的本发明的脂质体，制备如下格尔德霉素10摩尔；磷脂90摩尔，将上述各组分置于茄形瓶中并用氯仿溶解，旋转真空蒸发成脂膜(37°C)。置于干燥器中避光放置池左右，充分挥去有机溶剂。将在37°c温浴好的PBS (PH = 7. 4)的缓冲溶液加入到脂膜中， 先水浴超声(30°C超声分散15min)，并不时振摇。然后探头超声(冰浴，超声:3min)。即得格尔德霉素脂质体。其粒径为150_200nm，Zeta 电位在-20—50mV 之间。本发明以荷肉瘤S180小鼠为模型，采用尾静脉给药的治疗方案体内评价了本发明实施例1所制备的格尔德霉素脂质体的抗肿瘤活性，并与原料药格尔德霉素作比较，结果显示格尔德霉素脂质体在更低的剂量情况下比原料药物格尔德霉素具有更优异的抗肿瘤效果。同时也显示了格尔德霉素在低剂量时就达到了原料药物格尔德霉素在高剂量时的抗肿瘤效果。本发明选用肝癌HepG2细胞为模型，考察了格尔德霉素脂质体对肝肿瘤细胞增殖的影响，通过与格尔德霉素的比较来显示所制备的格尔德霉素脂质体具有更好的抗肿瘤效^ ο本发明提供了所制备的格尔德霉素脂质体，特别是优选方法制备的，经检测其质量外观均一，性质稳定，制备方法简单，具有缓释，靶向效果，改善了原料药物在体内的代谢不稳定且水溶性极差的限制。在动物模型中，所制备的格尔德霉素脂质体在较低剂量表现出优异的抗肿瘤效果，在肝肿瘤细胞模型中，格尔德霉素脂质体抑制肿瘤细胞的生长，显示出比格尔德霉素更强的抑制肿瘤细胞增殖的效果。本发明首次将格尔德霉素制成脂质体，目前，在国内外均未见格尔德霉素脂质体的报道，更没有相关制剂的上市，因此本发明具有实际应用前景与潜在经济价值。以下通过实验数据来说明本发明的有益结果，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。1、格尔德霉素脂质体的形态及稳定性观察通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜呈像观察其微观结构，其呈圆形球状，见附
图1，图2。具体操作方法1.透射电子显微镜呈像将制备好的脂质体，用三蒸水稀释一定倍数，取IOyL置于铜网表面，下衬滤纸，自然挥干后，准备透射电镜观察。调整电镜电子束电压为80KV，移动坐标，放大倍数，寻找观察粒子并拍照(见附图1)2.扫描电子显微呈像将制备好的脂质体，用三蒸水稀释一定倍数，取20 μ L于盖玻片上，自然挥干后，喷金， 准备扫描电镜下观察。调整电镜电子束电压为20KV，移动坐标，放大倍数，寻找观察粒子并拍照(见附图2)。通过随机选取三个剂型观察其稳定性。在4°C放置半个月，观察样品随时间延长粒径，电位，包封率的变化。通过对脂质体稳定性的考察发现，格尔德霉素脂质体在4°C条件下保存半个月，其粒径，电位，包封率都没有发生明显的变化，见附图3，图4。2、格尔德霉素脂质体的体外释放度考察格尔德霉素的体外释放通过以下方式实现制备载药量为100mg/L格尔德霉脂质体，精密吸取2mL于处理好的透析袋中，两端用透析夹加紧，置于含有50mL透析介质的广口瓶中。将广口瓶放入37°C空气恒温震荡器中，100次/分振荡，于lh，2h，4h，6h，8h，12h， Mh，36h，4 i取样并更换50mL新鲜透析介质。取出的介质用0. 45 μ m微孔滤膜过滤后，取滤液进样，HPLC分析格尔德霉素药物的浓度。见附图5。3、格尔德霉素脂质体的抗肿瘤活性观察取腹腔接种S18tl腹水瘤第八天的昆明种小鼠一只，脱颈椎处死，用75%酒精消毒后置于超净台内，用镊子夹起腹部中线偏右的皮肤并用小剪刀剪一小口至可见乳白色腹水流出。将吸管由开口处轻轻插入腹腔吸出腹水。吸得的腹水加到装有约3mL灭菌生理盐水的15mL的离心管中，使体积增至约10mL。用吸管轻轻吹气，使腹水与生理盐水混勻。试管加盖，1000转/分离心5分钟。弃去上清液后，加9mL灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均勻浮起，试管加盖，1000转/分离心5分钟，弃去上清液。试管底部有的乳白色的胶状物。往试管底部的乳白色胶状物中加9mL灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均勻浮起。取100 μ L该悬浮液加至9. 9mL灭菌生理盐水中，混勻，得100倍稀释液，混勻，加盖， 放入冰中待用。取100 μ L上述瘤细胞稀释液置入Eppendoff小管中，加100 μ L台盼兰染液，混勻。取少许该混勻液加至计数板的计数池内，于显微镜下计算4个大格中被染上蓝色的存活瘤细胞的个数。将原液中的存活瘤细胞稀释成1. OX IO7个/mL，用于接种。用2% 碘酒棉球和75%酒精棉球在小鼠右侧腋下消毒，并注入0. 2mL瘤细胞液，缓缓抽出针头。按此方法给每批ICR种小鼠接种，随机分组，放入动物室饲养。药物分组及制备本实验共设9组1. N. S组2.空白脂质体组3. 0. 5 % CMC-Na组4. GA低剂量组 (0. 5mg/kg) 5. GA中剂量组(lmg/kg) 6. GA高剂量组(％ig/kg) 7. GA脂质体低剂量组(0. 5mg/ kg) 8. GA脂质体中剂量组(lmg/kg) 9. GA脂质体高剂量组(％ig/kg)药物混悬液液制备精密称取药物并研碎，加入两滴吐温80润湿，然后用0. 5 %CMC-Na制成混悬液。阳性对照为格尔德霉素的CMC-Na溶液，阴性对照为CMC-Na溶液；脂质体的分散体系为高温高压灭菌后的PBS缓冲溶液的，阳性对照为格尔德霉素脂质体，阴性对照为空白脂质体。设给药剂量分别为低(0. 5mg/kg)，中(lmg/kg)，高(％ig/kg)三个剂量，相对应的药物浓度0. 05mg/mL, 0. lmg/mL, 0. %ig/mL。脂质体制备方法采用薄膜分散法。将右侧腋下接种有腹水瘤的小鼠随机分组，每组10只，共9组。各组小鼠在动物部正常饲养，从接种后，于1，3，5，7天尾静脉给药。每次尾静脉注射各组药物O.aiil。第8 天将各组荷瘤小鼠处死，解剖，取瘤。并称体重和瘤重，按抑瘤率=[(阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]X 100%计算抑瘤率。将格尔德霉素脂质体的抑瘤率与原料药格尔德霉素的抑瘤率作比较见附图6。获得的数据以(X±SD)表示，并做t检验。结果见表2。由表2可以看出GA脂质体在小剂量时抑瘤率已达到70%以上，表现出优越的抗肿瘤活性，高于原料药GA小剂量组，有显著性差异(P < 0. 05)。GA脂质体中，高剂量组与低剂量组虽有差异，但无统计学意义，说明GA脂质体给药剂量在0. 5mg/kg时已经有很好的抗肿瘤效果。原料药GA组中，抗肿瘤率随着给药剂量的增加而增大，中，高剂量与低剂量比有显著性差异，但高剂量与中剂量比虽有差异，但无统计学意义。给药剂量在細g/kg时抑瘤率才达到70%以上。同样的抗肿瘤效果，脂质体的给药剂量比原料药降低了 8倍。充分说明了脂质体的优势。药物被包封于脂质体中，能降低药物毒性，增强药理作用。表2原料药格尔德霉素(GA)及格尔德霉素脂质体对荷肉瘤S180小鼠的作用(η =10)
权利要求
1.一种抗肿瘤药物脂质体，其特征在于其包含抗肿瘤活性剂，磷脂和除磷脂外的其他辅料。
2.权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述的抗肿瘤活性剂为Hsp90抑制剂。
3.权利要求2所述的脂质体，其特征在于，所述的Hsp90抑制剂为格尔德霉素或其衍生物。
4.权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述的磷脂选自卵磷脂，大豆磷脂，脑磷脂或人工合成磷脂中的一种或多种。
5.权利要求1-4任一项所述的脂质体，其特征在于，所述的抗肿瘤活性剂与磷脂的比例，摩尔比为抗肿瘤活性剂2-10 磷脂90-98。
6.权利要求5所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体中的抗肿瘤活性剂浓度为0. 5-4mg/L。
7.一种制备权利要求1-6任一项所述格尔德霉素脂质体的制备方法，其特征在于，采用的方法为薄膜分散法，逆向蒸发法，冷冻干燥法，注入法或者超声分散法中的其中一种。
8.权利要求7中所述的制备方法，其特征在于，所述的薄膜分散法为精密称取抗肿瘤活性剂和磷脂，将上述各组分置于茄形瓶中并用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜。置于干燥器中避光放置池左右，将在37°C温浴好pH = 7. 4的PBS缓冲溶液加入到脂膜中，先水浴超声，并不时振摇，然后探头超声，即得脂质体。
9.权利要求1-6任一项的所述脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述脂质体在制备抗肝肿瘤以及抗腹水肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种格尔德霉素脂质体的制备及应用，本发明中格尔德霉素脂质体由格尔德霉素与磷脂按一定的摩尔百分比组成，采用薄膜分散法制备，本发明所制备的脂质体性质稳定，具有缓释和靶向作用，本发明以S180腹水瘤小鼠为模型评价了格尔德霉素脂质体的抗肿瘤活性，结果表明格尔德霉素脂质体在更低的剂量情况下比格尔德霉素具有更优异的抗肿瘤效果，本发明以肝肿瘤细胞HepG2为模型评价了格尔德霉素脂质体抗肝肿瘤效果，结果显示格尔德霉素脂质体抑制肝肿瘤细胞生长，而且显示出比格尔德霉素更好的抗肝肿瘤效果。
文档编号A61K31/395GK102552150SQ201210053990
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者崔国辉, 崔纯莹, 董税田 申请人:首都医科大学