专利名称：翼首草总苷提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种翼首草总苷提取物及其制备方法和用途，属于药物领域。
背景技术：
类风湿关节炎(Rheumatiod Arthritis,简称RA)是一种常见的以慢性多关节炎病变为主要表现的全身性免疫性疾病，全世界共有上亿病人。据统计，RA国外的患病率为 I 2%，个别地区高达5% ;我国发病率约为O. 74%，现有病人1000万人左右。据调查表明，在正常人群中，类风湿性关节炎的发病率占正常人群的O. 35%左右。本病致残率高，未及时诊治的类风湿性关节炎患者二年致残率50%，三年致残率达70%。而已经患类风湿性关节炎的患者，平均寿命缩短10 15年，所以RA严重影响劳动能力，研制RA的治疗药物， 对于缓解该类疾病的临床症状，提高病人的生存质量，保障生产力，具有积极的意义。藏药翼首草，为川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri (C. B. Clarke) Hoeck的干燥全草，具有清热解毒、祛风湿、止痛功效。翼首草为藏医常用藏药，又名“榜姿毒乌”，为藏药特征明显的典型民族药物，用药历史悠久，藏医历来将其主要用于治疗风湿性等疾病，除藏医及其密切相关的蒙医外，中医药和其它传统医药基本没有应用翼首草的历史。在藏医药理论指导下，以翼首草的临床应用为依据，对翼首草提取物抗风湿性关节炎作用及机理进行了试验研究，结果表明翼首草提取物抗RA作用是肯定的，对于实验性佐剂关节炎动物模型原发性炎症及继发性关节炎均有较好的抗炎效果，并能减轻滑膜的病理改变，同时也有明显的镇痛作用，这与藏医临床以翼首草治疗风湿、类风湿关节炎应用相吻合。(沈芄，藏药翼首草抗类风湿性关节炎作用与机理研究，成都中医药大学，2002年.)对翼首草的化学成分研究表明，翼首草中主要含有齐墩果烷型三萜类皂苷、环烯醚萜苷类化合物、生物碱、多糖等成分。对翼首草有效成分的研究表明，采用大鼠急性足肿胀实验、小鼠棉球肉芽肿实验、小鼠急性耳肿胀实验和小鼠急性渗出实验等方法，证明了翼首草正丁醇部位总皂苷具有显著的抗炎活性[关昕璐，等.翼首草的抗炎作用与急毒实验研究.北京中医药大学学报.2004,27 (2) :71 73]。翼首草中环烯醚萜苷类的主要成分马钱素，具有明显的抗炎药理作用，但其结构类似物具有免疫增强作用。[庞伟.藏药翼首草的研究与应用·中国民族医药杂志.2007，(5) :63-65]。专利申请号200910196870. X， 该发明中提供了翼首草总皂苷有效部位提取物，其主要成分为齐墩果烷型五环三萜皂苷， 总皂苷含量50-90%，该总皂苷提取物能显著抑制肿瘤细胞增殖，该总皂苷提取物中直接采用大孔树脂分离得到，提取物中含有环烯醚萜苷。综合现有文献可知，目前仅有翼首草中总皂苷及马钱素具有抗炎镇痛作用、以及总皂苷抗肿瘤的报道，还未见翼首草总苷提取物治疗类风湿性关节炎的活性成分的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种翼首草总苷提取物及其制备方法和用途。本发明的另一目的在于提供了一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物。本发明提供了一种翼首草总苷提取物，它来源于川续断科植物匙叶翼首草 Pterocephalus hookeri (C. B. Clarke)Hoeck的干燥全草,该提取物中，总阜苷和总环烯醚萜苷的总含量不低于50% w/w，其中，含有马钱苷O. 45-0. 78% w/w，齐墩果酸O. 2-0. 45% w/w,熊果酸 O. 65-1. I % w/w。进一步地，该提取物中，含有马钱苷O. 6-0. 7% w/w，齐墩果酸O. 3-0. 4% w/w，熊果酸 O. 8-1. 0% w/w。本发明还提供了上述翼首草总苷提取物的制备方法，它包括如下步骤取翼首草，加水煎煮提取，滤过，滤液浓缩后，采用非极性或弱极性大孔吸附树脂上样，先以水洗去杂质后，弃去洗脱液；以60-85% v/v乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液后，回收溶剂，干燥，即得翼首草总苷提取物。其中，大孔吸附树脂为D101、AB-8或HPD-300 ;洗脱用乙醇为65-75% v/v。进一步地，选用DlOl型大孔吸附树脂；以70% v/v乙醇洗脱。更进一步地，大孔吸附树脂洗脱的具体操作步骤如下将上样液的浓度配制为O. 1-0. 2g生药/ml，采用DlOl型大孔吸附树脂上样，上样流速为l_3BV/h，上样量以药材计为药材树脂=(O. 5-1. 5) I w/w,以3-5BV水洗脱，流速为l_3BV/h，弃去洗脱液；以2-4BV的70%乙醇洗脱，洗脱流速为2_4BV/h。进一步优选地，将上样液的浓度配制为O. Ig生药/ml，采用DlOl型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量为树脂用量的I倍(药材树脂=I 1)，以4BV 水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70%乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h。本发明还提供了上述翼首草总苷提取物在制备抗炎、镇痛或治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，它是由上述的翼首草总苷提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。本发明翼首草总苷提取物具有良好的抗炎镇痛作用，对机体特异性细胞免疫有一定的抑制效果，并且能够通过降低类风湿性关节炎的促炎症因子水平和提高机体抗氧化能力，有效地治疗类风湿性关节炎，疗效确切，为临床用药提供了一种新的选择。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图I本发明翼首草提取物有效部位筛选工艺；图2AA大鼠后肢原发性和继发性肿胀(左上A :正常组；中上B :模型对照组；右上 C :尼美舒利组；左下D :翼首草总苷提取物高剂量组；中下E :翼首草总苷提取物中剂量组; 右下F :翼首草总苷提取物低剂量组)图3AA大鼠前肢继发性肿胀(分组如上图2)
具体实施例方式实施例I本发明翼首草总苷提取物的制备取翼首草原药材IOOOg切段，加1600ml水润湿，6000ml水煎煮提取2次，每次
I.5h，滤过，滤液浓缩后，离心除去沉淀，水提物稀释至O. Ig生药/ml药液，采用DlOl型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量为树脂用量的I倍(药材树脂= I I)，以4BV水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70%乙醇洗脱，洗脱流速为 3BV/h，洗脱液减压回收乙醇至稠膏状，低温干燥或冷冻干燥，粉碎，过四号筛，即得总苷提取物。实施例2翼首草总苷提取物的含量检测一、提取物中总苷的含量测定照比色法(《中华人民共和国药典》2010版一部附录VA)测定。对照品溶液的制备取马钱苷对照品适量，精密称定，加蒸馏水制成每IOOml中含 6mg的溶液，即得。标准曲线的制备取马钱苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成60μ g/ml的溶液。 分别精密量取对照品溶液O. 6ml, O. 8ml, I. 0ml, I. 2ml, I. 4ml, I. 6ml至比色管中，挥去溶剂，放冷。依次精密加入新鲜配制的5%香草醛-冰乙酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，于60°C 水浴中加热显色15min后，冰浴冷却5min，分别精密加入冰乙酸5ml混匀，备用。空白溶液的制备同上法。照比色法(《中华人民共和国药典》2010版一部附录VA)在535nm的波长处分别测定吸光度，以吸光度做纵坐标，浓度做横坐标，绘制标准曲线，得回归方程。测定法精密称取实施例I制备的提取物O. 15g，置IOOml于量瓶中，甲醇溶解，精密吸取100 μ I至比色管中，挥去溶剂，放冷。依次精密加入新鲜配制的5%香草醛-冰乙酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，于60°C水浴中加热显色15min后，冰浴冷却5min，分别精密加入冰乙酸5ml混匀，作为供试品溶液。空白溶液的制备同上法。按上文方法测定实施例I制备的3批翼首草提取物中总苷的含量，结果见表I。
表I样品含量测定结果(η = 2)批号 I23总苷含量(％) 52.66251 04252.052由上述结果可知，本提取物按干燥品计算，含总皂苷和总环烯醚萜苷总量以马钱苷(C21H22O11)计，不得少于50%。二、提取物中有效成分的含量测定(一 )马钱苷的测定照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水 (12 88)为流动相；检测波长为240nm;理论塔板数按马钱苷峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备精密称取马钱苷对照品适量，加甲醇制成每Iml含60 μ g的溶液，即得。供试品溶液的制备取实施例I制备的提取物约O. lg，精密称定，置25ml量瓶中，加入甲醇适量使溶解，再加甲醇至刻度，摇匀。置3000r/min离心机中离心20min，微孔滤膜滤过，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含马钱苷(C21H22O11)不得少于O. 30%。表2样品含量测定结果(η = 2)
批号I23马钱苷含量(％)0.620.640.60( 二 )熊果酸和齐墩果酸的含量测定色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-O. Imol/ L乙酸铵溶液(85 15)作为流动相；检测波长为210nm ;理论塔板数按熊果酸峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备精密称取齐墩果酸对照品、熊果酸对照品适量，加甲醇制成每 Iml含齐墩果酸O. lmg、熊果酸O. Img的溶液，即得。供试品溶液的制备取实施例I制备的提取物约O. lg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇溶液各50ml，再精密加入盐酸O. 15ml，称定重量，80°C水浴回流 30min,放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含齐墩果酸(C3tlH48O3)、熊果酸(C3tlH48O3)的总量不得少于 I. 00%。表3样品含量测定结果(η = 2)
批号齐墩果酸熊果酸总量I0.341%0.919%1.260%20.315%0.892%1.207%30.333%0.872%1.205%以下通过药理、药效试验证明本发明翼首草提取物的有益效果。试验例I本发明翼首草有效提取部位的筛选按图I的提取路径，制备出A、B、C三种不同的翼首草提取部位，考察各部位的抗炎镇痛作用。其中，大孔树脂纯化方法参见实施例I。I. I、对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响翼首草提取部位B、C及翼首草水提液对角叉菜胶致小鼠足肿胀均有显著抑制作用。其中B部位作用最强，但稍弱于消炎痛。I. 2、对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响翼首草提取部位B及翼首草水提液对二甲苯致小鼠耳廓肿胀均有抑制作用。其中 B部位作用较强，但稍弱于消炎痛。I. 3、对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响
翼首草提取部位B、C及翼首草水提液对醋酸致小鼠腹腔通透性增强均有抑制作用。其中B部位作用较强，但稍弱于消炎痛。I. 4、对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响翼首草提取部位A、B、C及翼首草水提液对醋酸致小鼠扭体反应均有抑制作用，延长扭体潜伏期，减少扭体次数。其中B部位作用相对较强，但稍弱于消炎痛。I. 5、翼首草各提取部位抗炎镇痛作用比较由表4可知，B、C及翼首草水提液具有抗炎镇痛作用，而B部位作用相比更明显。 拟将B部位作为今后抗类风湿性关节炎药效实验的受试药物。表4翼首草各提取物药效筛选比较
权利要求
1.一种翼首草总苷提取物，其特征在于它来源于川续断科植物匙叶翼首草 Pterocephalus hookeri (C. B. Clarke)Hoeck的干燥全草,该提取物中，总阜苷和总环烯醚萜苷的总含量大于50% w/w ;其中，含有马钱苷O. 45-0. 78% w/w，齐墩果酸O. 2-0. 45% w/ w,熊果酸 O. 65-1. I % w/w。
2.根据权利要求2所述的翼首草总苷提取物，其特征在于该提取物中，含有马钱苷O.6-0. 7% w/w，齐墩果酸 O. 3-0. 4% w/w，熊果酸 O. 8-1. 0% w/w。
3.权利要求I或2所述的翼首草总苷提取物的制备方法，其特征在于它包括如下步骤取翼首草，加水煎煮提取，滤过，滤液浓缩后，采用非极性或弱极性大孔吸附树脂上样， 先以水洗去杂质后，弃去洗脱液；以60-85% v/v乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液后，回收溶剂， 干燥，即得翼首草总苷提取物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于大孔吸附树脂为D101、AB-8或 HPD-300 ;洗脱用乙醇为65-75% v/v。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于选用DlOl型大孔吸附树脂；以70% v/v乙醇洗脱。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法，其特征在于大孔吸附树脂洗脱的具体操作步骤如下将上样液的浓度配制为O. 1-0. 2g生药/ml，采用DlOl型大孔吸附树脂上样，上样流速为l_3BV/h，上样量以药材计为药材树脂=(O. 5-1. 5) I w/w,以3-5BV水洗脱，流速为 l-3BV/h，弃去洗脱液；以2-4BV的70%乙醇洗脱，洗脱流速为2_4BV/h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于将上样液的浓度配制为O.Ig生药/ ml，采用DlOl型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量以药材计为药材树脂=I 1，以4BV水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70%乙醇洗脱，洗脱流速为 3BV/h0
8.权利要求I或2所述的翼首草总苷提取物在制备抗炎、镇痛或治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。
9.一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于它是由权利要求I或2所述的翼首草总苷提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。
全文摘要
本发明提供了翼首草总苷提取物，它来源于川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，该提取物中，总皂苷和总环烯醚萜苷的总含量不低于50％w/w，其中，含有马钱苷0.45-0.78％w/w，齐墩果酸0.2-0.45％w/w，熊果酸0.65-1.1％w/w。本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。本发明翼首草总苷提取物具有良好的抗炎镇痛作用，对机体特异性细胞免疫有一定的抑制效果，并且能够通过降低类风湿性关节炎的促炎症因子水平和提高机体抗氧化能力，有效地治疗类风湿性关节炎，疗效确切，为临床用药提供了一种新的选择。
文档编号A61K36/185GK102579519SQ20121006115
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者古锐, 孟宪丽, 张艺, 赖先荣 申请人:成都中医药大学