一种利用果蝇细胞生产病毒样颗粒的方法及应用的制作方法

专利名称：一种利用果蝇细胞生产病毒样颗粒的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种利用果蝇细胞生产病毒样颗粒的方法及应用。
背景技术：
含有完整且具备生化活性包膜蛋白抗原的病毒样颗粒(VLP)往往在没有任何佐剂的情况下，能诱导出很好的免疫反应。此外，因VLP不具有遗传物质因此不具有复制能力和感染性，与减毒和灭活疫苗相比，VLP的生产和接种更具安全性。事实上，在许多动物模型上的试验中发现VLP已经是一种极具发展潜力的新型疫苗，目前，已有人类的HPV的及乙肝病毒的VLP疫苗上市。在这里需要指出HPV是非包膜病毒，而HBV的VLP仅含有HBV表面蛋白而不含有病毒的核心，因此，由它们衍生出的VLP与包膜病毒所衍生出的VLP相比更 易于大量生产。目前，包膜病毒如流感和HIV的VLP均是由重组杆状病毒载体转染的昆虫细胞、编码病毒包膜蛋白和核心蛋白的DNA质粒共转染的酵母细胞或哺乳动物细胞(239T细胞、COS细胞和Veix)细胞)所产生。释放在细胞上清液中的VLP在形态上与野生流感和HIV病毒非常相似。然而，目前有关用哺乳或酵母细胞生产VLP的大量研究均依赖于瞬转系统，所产生的VLP仅能满足于小动物研究，而不足以用于大动物或者人类研究。为克服这种局限性，用于VLP生产的稳定哺乳动物细胞转染子随之产生。尽管此法比瞬转系统产量高，但仍无法满足对大动物及人类研究的需求量。采用重组杆状病毒载体转染的昆虫细胞可产生出HIV和流感病毒的VLP，所生产出的VLP可诱导体液和细胞免疫反应，并且流感病毒VLP可以保护小鼠免受流感病毒攻毒。同时也尝试将HA、NA和Ml同时构建到单一的重组杆状病毒载体中，其转染昆虫细胞后产生出的VLP同样可诱导出很好的免疫反应和免疫保护性。然而，用重组杆状病毒载体转染昆虫细胞的方法所生产VLP有三大缺陷。首先，细胞上清液中既含有VLP又存在重组杆状病毒。尽管蔗糖密度梯度法显示重组杆状病毒颗粒密度低于流感VLP，但很难将两者分离开，所以制备出的VLP中混杂着很多重组杆状病毒，这会严重影响VLP的免疫原性，并干扰了对VLP的质量控制。其次，在哺乳动物细胞中流感HA和HIV包膜蛋白的最初合成是先在内质网上初步形成HAq和gPl60的前体，然后再分别由细胞内源性蛋白酶剪切成HAl和HA2或者gpl20和gp41。然而迄今为止，所有相关研究显示重组杆状病毒载体转染的昆虫细胞所产生的VLP含有HAtl和gpl60前体，说明在这种转染细胞中HAtl和gpl60不能得到正常剪切。尽管现在还不是十分清楚未剪切的HAtl前体的存在对VLP的免疫原性和免疫保护性是否有影响，但在HIV研究中已确定gpl60前体对HIV的感染性和免疫原性的影响是至关重要的。最后，在细胞被重组杆状病毒感染后，这些细胞只能在有限的时间(通常5到7天)内存活并表达病毒样颗粒。因此,每当需要生产表达病毒样颗粒时,就需要新的重组杆状病毒去感染细胞，这样，就会造成每一批表达的病毒样颗粒在数量和质量上有差异。根据有无包膜，从形态学上病毒可分为有包膜病毒和无包膜病毒。有包膜病毒主要通过2种方式获得包膜。大部分的包膜病毒在从宿主细胞细胞膜(plasma membrane)上芽生时获得包膜，包括但不限于流感病毒(Influenzavirus)、人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus)、负黏液病毒(paramyxoviruses)、博尔纳病病毒(BornaDisease Virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)等。目前公认的此类包膜病毒获得包膜过程包括以下四步，首先，细胞核或细胞浆里形成病毒核衣壳粒子(viral nucleocapsid),其次,病毒跨膜糖蛋白大量的聚集在细胞膜上,第三步,这些跨膜的病毒糖蛋白胞浆部分与病毒核衣壳粒子相互作用，可能直接作用，或间接作用，或通过中间的细胞骨架蛋白作用，最后，携带跨膜病毒糖蛋白的细胞膜逐渐包裹病毒核衣壳粒子，当病毒核衣壳粒子被脂质双层完全包裹时，病毒颗粒离开感染细胞芽生形成。另一类病毒在胞质膜(cytoplasmic membrane)如内质网膜或高尔基复合体膜上获得他们的包膜,包括但不限于黄病毒(flaviviruses)、DNA肝病毒(hepadnaviruses),风疫病毒(rubellavirus),冠狀病毒(coronaviruses)、裂谷热病病毒(Rift Valley fever virus)和布尼亚病毒(Bunyaviridae)等。主要过程为，首先，细胞核或细胞浆里形成病毒核衣壳粒子(viral nucleocapsid),其次,病毒跨胞质膜糖蛋白大量的聚集在胞质膜上,第三步,携带跨胞质膜病毒糖蛋白的胞质膜逐渐包裹病毒核衣壳粒子，当病毒核衣壳粒子被完全包裹时，带包膜的病毒在内质网内芽生形成，第四，带包膜的病毒芽生出内质网，进入转移小泡(transport vesicle),转移小泡带着带包膜的病毒进入高尔基复合体(Golgi complex),带包膜的病毒通过高尔基复合体，第五，高尔基复合体将病毒包裹在胞吐空泡(exocyticvesicles)内，第六,包膜病毒通过胞吐作用(exocytosis)被释放到细胞外。再如，疱疫病毒(herpesvirus)可能在细胞核内膜(inner nuclear membrane)上获得包膜,包膜与细胞核外膜(outer nuclear membrane)融合并被释放入细胞衆,后续过程与上述过程类似。还有一些病毒获得包膜的机制不清，如鱼类虹彩病毒(iridovirus)和痘病毒(poxvirus),但研究发现它们的包膜可能不来源于任何已经存在的细胞膜(pre-existing membrane)。本世纪70年代，科学家初次发现感染病人的血清中不止存在病毒颗粒还存在与之相似的病毒样颗粒，经研究表明这些是病毒在复制组装过程中发生缺陷的病毒，这些病毒样颗粒未能包裹关键的病毒整合于宿主基因组的遗传物质。截至目前，对于VLP的自组装机制的了解完全基于对病毒感染后本身的复制组装成熟过程的了解，反之，VLP的模型也为科学家们了解病毒的天然复制过程提供了很好的工具。因此，科学家们对于三类病毒的VLP生产方法的了解认识也基于它们的天然复制成熟的过程。。综上所述，本领域还需要进一步优化生产VLP的系统或方法，以期获得免疫原性强，产量高，生产稳定的VLP，用于工业化生产和临床应用。

发明内容
本发明的目的在于提供一种利用果蝇细胞生产病毒样颗粒的方法及应用。在本发明的第一方面，提供一种生产包膜病毒的病毒样颗粒的方法，所述方法包括将编码包膜病毒抗原蛋白的核酸转化果蝇细胞，获得重组病毒样颗粒生产细胞；培养该重组病毒样颗粒生产细胞，从而表达获得病毒样颗粒。另一优选例中该果蝇细胞为黑腹果蝇S2细胞。在一个优选例中，所述的核酸包括编码病毒核心蛋白的核酸和编码包膜病毒抗原、蛋白的核酸。在另一优选例中，所述方法包括 (A)提供表达构建物I，其包括编码病毒核心蛋白的核酸序列；(B)提供表达构建物2，其包括编码包膜病毒抗原蛋白的核酸序列；(C)将(A)和(B)的构建物转化黑腹果蝇S2细胞，获得重组病毒样颗粒生产细胞；和(D)培养(C)的重组病毒样颗粒生产细胞，从而表达获得病毒样颗粒。在另一优选例中，所述的病毒核心蛋白选自人类免疫缺陷病毒Gag蛋白、流感病毒Ml蛋白、猴免疫缺陷病毒Gag蛋白、小鼠白血病病毒Gag病毒核心蛋白、水疱性口炎病毒M病毒核心蛋白、埃博拉病毒VP40病毒核心蛋白、冠状病毒M和E蛋白、布尼亚病毒N蛋白、 丙型肝炎病毒核心蛋白C、乙型肝炎病毒核心蛋白、SARS冠状病毒核心蛋白和其组合物。在另一优选例中，所述的包膜病毒为从宿主细胞的细胞膜上芽生时获得包膜的病毒。在另一优选例中，所述的病毒包括流感病毒、人类免疫缺陷病毒、负黏液病毒、博尔纳病病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒。在另一优选例中，所述的表达构建物I和表达构建物2位于一个表达载体上；或所述的表达构建物I和表达构建物2位于不同表达载体上。在另一优选例中，所述的表达载体为非病毒载体。在另一优选例中，所述的表达载体中所用的启动子为果蝇细胞启动子,选自MT启动子或Ac5启动子。在另一优选例中，所述的非病毒载体选自pMT/V5-His、pMT/BiP/V5_His、PMT-DEST48 或 pMT/V5-His_T0P0。在另一优选例中，所述的方法还包括将编码病毒颗粒蛋白表达调节因子蛋白的核酸转化该黑腹果蝇S2细胞。在另一优选例中，所述的方法还包括将抗性筛选基因转化该黑腹果蝇S2细胞。在另一优选例中，所述的病毒样颗粒是流感病毒来源的病毒样颗粒，所述方法包括(Al)提供表达构建物I，其包括编码人类免疫缺陷病毒Gag蛋白的核酸序列或编码流感病毒Ml蛋白的核酸序列；(BI)提供表达构建物2，其包括编码流感病毒神经氨酸酶抗原的核酸序列和/或编码流感病毒的血凝素抗原的核酸序列；(Cl)将(Al)和(BI)的构建物转化黑腹果蝇S2细胞，获得重组病毒样颗粒生产细胞；和(Dl)培养(Cl)的重组病毒样颗粒生产细胞，从而表达获得病毒样颗粒；附加条件是所述的表达构建物I和表达构建物2位于一个表达载体上；或所述的表达构建物I和表达构建物2位于不同表达载体上。在另一优选例中，步骤(BI)所述的表达构建物2中，所述的编码流感病毒神经氨酸酶抗原的核酸序列和编码流感病毒的血凝素抗原的核酸序列位于同一个表达载体上或者位于不同表达载体上。
在另一优选例中，所述的病毒样颗粒是人类免疫缺陷病毒来源的病毒样颗粒，所述方法包括(A2)提供表达构建物I，其包括编码人类免疫缺陷病毒Gag蛋白的核酸序列；(B2)提供表达构建物2，其包括编码人类免疫缺陷病毒的包膜蛋白前体Gpl60的核酸序列；(C2)将(A2)和(B2)的构建物转化黑腹果蝇S2细胞，获得重组病毒样颗粒生产细胞；和(D2)培养(C2)的重组病毒样颗粒生产细胞，从而表达获得病毒样颗粒；
附加条件是所述的表达构建物I和表达构建物2位于一个表达载体上；或所述的表达构建物I和表达构建物2位于不同表达载体上。在另一优选例中，还包括提供表达构建物3，其包括编码人类免疫缺陷病毒的rev的核酸序列；将表达构建物3同表达构建物I和2 —起转化黑腹果蝇S2细胞。在本发明的另一方面，提供由前面任一所述的方法获得的病毒样颗粒。在本发明的另一方面，提供所述的病毒样颗粒在制备预防、控制或治疗下述疾病、病症或状况的药物中的用途流感、艾滋病、麻疹、呼吸道合胞体病毒感染、腮腺炎、肺炎病毒感染、博尔纳病、狂犬病、埃博拉出血热。在本发明的另一方面，提供一种具有免疫原性的组合物，所述的组合物包含(a)所述的病毒样颗粒；和(b)药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的组合物中还包括免疫佐剂。在本发明的另一方面，提供一种疫苗组合，所述组合包括(i)抗原蛋白；或表达抗原蛋白的构建物，其中含有编码该抗原蛋白的抗原核酸序列；(ii)病毒样颗粒，所述的病毒样颗粒由前面任一所述的方法获得。在本发明的另一方面，提供一种用于生产病毒样颗粒的试剂盒，包括(I)表达载体,包括表达构建物I，其包括编码病毒核心蛋白的核酸序列；和表达构建物2，其包括编码包膜病毒抗原蛋白的核酸序列；和(2)果蝇S2细胞。在另一优选例中，所述的试剂盒的(I)中，表达载体还包括表达构建物3，其包括编码调节病毒颗粒蛋白表达的蛋白质(regulator of exPression of virion Protein)的核酸序列的；和/或表达构建物4，其包括抗性筛选基因的序列；附加条件是所述的表达构建物I和/或表达构建物2和/或表达构建物3和/或表达构建物4位于一个表达载体上或位于不同表达载体上。在本发明的另一方面，提供一种果蝇细胞，该果蝇细胞包含用于生产包膜病毒的病毒样颗粒的载体。该果蝇细胞优选黑腹果蝇S2细胞。在另一优选例中，所述的生产包膜病毒的病毒样颗粒的载体包括编码病毒核心蛋白的核酸和编码包膜病毒抗原蛋白的核酸。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图I、制备 HIV VLP (pDOL)所用的质粒示意图。其中，Gpl60 (HIVenv),rev (HIVrev)和Gag(HIVgag)分别代表编码HIV_lGpl60 (pDOL)蛋白的基因、编码Rev蛋白的基因和编码全长的Gag蛋白的基因。Selection Marker表示用于阳性克隆筛选的质粒(含有Hygromycin B抗性基因的载体质粒)。图2、在 CdCl2 诱导和不诱导的情况下，pMT-bip-HIVenv pAC-HIVgag, pMT-rev 和pCoBlast共转染的S2细胞在细胞裂解液和上清中的HIV gpl20和gag表达检测。S. P.上清；44 :稳转的果蝇S2克隆#44 ；1 :诱导的；NI :非诱导的；M :分子量标记；PC :阳性对照(被转染相同质粒的293T细胞裂解液)；6D或3D :诱导后6或3天收集的上清。其中gpl20为gpl60经剪切获得的片段，P55gag为全长的gag。检测P55gag和gpl20的第一抗体分别为抗 HIV-1 gag p24 的特异性抗体(购自 AIDS Reagents and Depositary program,NIAID, NIH ；clone 183-H12)和抗 HIV_lgpl20 的特异性抗体(购自 Advanced BioScienceLaboratories, Inc.公司货号4317)。二抗为AP偶联的抗小鼠抗体(购自Promega公司货、号 s3721)。图3、蔗糖梯度后HIV VLP(pDOL)样本的Western Blot鉴定。其中，P.C.:阳性对照(被转染相同质粒的293T细胞裂解液);marker :分子量标记物；unfraction :浓缩但没有经蔗糖梯度离心分离的样本；各泳道的数字(如I. 24等)分别表示各泳道样品未TCA沉淀前的总量。检测P55gag和gpl20的第一抗体分别为抗HIV-I gag p24的特异性抗体(购自 AIDS Reagents and Depositary program, NIAID, NIH ；clone 183-H12)和抗 HIV-1gpl20 的特异性抗体(购自 Advanced BioScience Laboratories, Inc.公司货号 4317)。二抗为AP偶联的抗小鼠抗体(购自Promega公司货号s3721)。图4、HIV VLP (pDOL)电镜观察。图5、HIV VLP(pDOL)免疫后小鼠血清中对HIV-1 gpl20抗体(I 1，000稀释的血清样品)抗体活性检测。PBS对照组、DNA plasmid免疫-VLP(pDOL)/CpG/ISA720免疫组；其中CpG和ISA720是两种免疫佐剂。图6、不同稀释度(滴度)的免疫小鼠的血清样品对同源(pDOL)和异源(Q168)的HIV-I假病毒抗体中和活性抑制率。#21-24样品编号。图7、细胞因子(IFN-Y和TNF-a)标记以测定⑶4和⑶8T细胞对于HIV-1肽的应答。图8、上图为制备流感病毒VLP所用的质粒示意图，其中，Selection Marker为blasticidin抗性基因的载体。流感HA，NA，M1和gag蛋白质粒构建和表达检测。左侧A-C图显示以Ml为核心蛋白的HA/NA VLP ;右侧A-C图为以HIV-IGag为核心蛋白的HA/NA VLP。W/0 表示不含有 CdCl2。第一抗体分别为为 Anti-HA (California0609)pAb(购自 eENZYME)，anti-NA抗体选用抗FLAG tag的鼠IgG单抗(购自Sigma公司)，anti-gag (HIV)(购自AIDSReagents and Depositary program, NIAID, NIH ；clonel83-H12)和 anti-Ml(SZ)patientserum(购自 kindly provided by professor Toyota at the IPS), 二抗为 AP 偶联的抗小鼠抗体(购自Promega公司货号s3721)。图9、蔗糖梯度后流感VLP样本的SDS/PAGE和Western Blot鉴定。上图为抗HIV-1 gag抗体的鉴定结果；中图为抗HA血清的鉴定结果；下图为抗flag tag抗体的鉴定结果。UNF :浓缩但没有经蔗糖梯度离心分离的样本；lto 11 :经蔗糖梯度离心分离的样本。anti-NA抗体选用抗FLAG tag的鼠IgG单抗(购自Sigma公司)，HA免疫血清(用CMV/RHA (Th)质粒肌肉注射BALB/c小鼠三次，注射间隔2 3周，第三次两周后采集小鼠血液，分离取得HA免疫血清)。图10、流感VLP电镜观察。图11、同源病毒10MLD50攻毒后小鼠体重改变(左图)和存活率(右图)。图12、异源病毒10MLD50攻毒后小鼠体重改变(左图)和存活率(右图)。图13、同源病毒1，000MLD50攻毒后小鼠体重改变(左图)和存活率(右图)。图14、BALB/c小鼠用1，000MLD50的同源H5N1病毒感染 后大体的病理。(a) PBS对照组的一只代表性小鼠的肺。(b)PBS对照组一只代表性小鼠的下肢局部麻痹。(c)PBS对照组一只小鼠的小肠和大肠松弛。图15、同源病毒10MLD50攻毒后肺部病理。(a_d)小鼠10MLD50感染(同源(A/Shenzhen/406H/06, clade 2. 3. 4)H5N1病毒)后4天的肺组织用苏木精和伊红(HE)染色。其中，(a)为PBS对照组；(b)为同源VLP-VLP组；(c)为同源DNA-DNA组；(d)为异源DNA-VLP 组。图16、同源病毒I, 000MLD50攻毒后肺部病理。(e_h)小鼠I, 000MLD50感染(同源(A/Shenzhen/406H/06，clade 2. 3. 4) H5N1病毒)后4天的肺组织用苏木精和伊红(HE)染色。其中，(e)为PBS对照组；(f)为同源VLP-VLP组；(g)为同源DNA-DNA组；(h)为异源 DNA-VLP 组。图17、各免疫组的ELISA抗体结合反应结果。图18、HIV-1 Gag p55 (SEQ ID NO: I)序列。图19、产生HIV-IVLP (consensus B和C)的代表性S2克隆(VB2)的冷冻电镜和断层图象。A.非线性鹿糖梯度的上带(upper band)中获得的代表性的HIV-1VLP (consensusB和C)的冷冻电镜的横截面图象。比例尺为lOOnm。B.非线性鹿糖梯度的下带(lowerband)中获得的代表性的HIV-1 VLP (consensus B和C)的冷冻电镜的横截面图象。比例尺为100nm。C.非线性蔗糖梯度的下带(lower band)中获得的代表性的HIV-1 VLP的冷冻电镜断层图象(Z-stack)。红色箭头指示了刺突的位置。D.由上述冷冻电镜断层图象所合成的HIV-1 VLP的表面模型。图中白点代表包膜蛋白刺突的位置。图20、对由DNA-HIV-I VLP (consensus B和C)异源免疫产生的每个免疫血清样本的ADCC和ADCVI应答。A.用PBS对照鼠和DNA-HIV-I VLP异源免疫鼠的合并血清以及HIV-I病人的合并血清所检测到的在HIV-1 AD8感染的CEMss-CCR5细胞表面表达的HIV-I包膜蛋白。B.用PKH-26和CFSE荧光染料来染色HIV-1 AD8感染的CEMss_CCR5靶细胞。被染色的靶细胞与来自BALB/c小鼠的脾脏细胞一起孵育(E T = 50 I)，再加上I : 50稀释PBS对照鼠和DNA-HIV-I VLP异源免疫鼠的每个血清样本。18小时后，按材料和方法中所述测定ADCC。C. HIV-1 AD8感染的CEMss_CCR5靶细胞与来自BALB/c小鼠脾脏细胞一起孵育(E T = 20 I)，再加上I : 50稀释PBS对照鼠和DNA-HIV-I VLP异源免疫鼠的每个血清样本。2天后，用ELISA检测培养上清中的gag p24蛋白，并按材料和方法中所述的计算方法来算出抑制百分比。D.线性回归分析的方法来分析PBS对照鼠和DNA-HIV-IVLP异源免疫鼠的每个血清样本的ADCC抑制百分比和ADCVI抑制百分比之间的相关性。
具体实施例方式本发明人经过多年的深入研究，首次开发了一种稳转果蝇S2细胞生产病毒样颗粒的方法。利用本发明的方法生产包膜病毒的病毒样颗粒，蛋白能够得到正确的表达、剪切和组装，最终获得具有良好的免疫原性的病毒样颗粒。术语如本文所用，所述的“动物”可以是任何能够对本发明的病毒样颗粒生产系统生产的病毒样颗粒发生免疫应答的动物。包括哺乳动物(包括人，猪、牛、马、羊、骡等家畜，或其它经济动物)、家禽(如鸡、鸭、鹅)、鸟类(如鹌鹑、观赏鸟类)等。本发明的病毒样颗粒生产系统产生的生物病毒样颗粒可用于人类或动物。本发明中，以鼠作为受试生物，其与人类相比，无论在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等都非常接近。如本文所用，所述的“抗原蛋白”或“抗原”是指具有免疫原性的蛋白质，或对于构建病毒样颗粒有用的蛋白质。所述的“抗原蛋白”也包括它们的蛋白变体，只要所述蛋白变·体保留有该“抗原蛋白”的功能或活性。如本文所用，所述的“构建物”是指包含有编码特定蛋白的核酸序列的、用于转化细胞的核酸，所述的“构建物”还可包含与编码特定蛋白的核酸序列操作性连接的启动子或终止子等。一个或多个构建物可分别包含在一个或多个表达载体中，用于转化细胞和表达。如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区域”，是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。组织或器官特异型启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中。如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充齐U、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。对于疫苗，所述的药学上可接受的载体例如可包括佐剂。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。病毒样颗粒生产果蚬细胞能在实验室条件下进行稳定的培养(Schneider, J. Embryol. Exp.MorphoI. 27 :353(1972))。许多含有特定编码序列的载体系统可通过果蝇热激启动子和COPIA 启动子插入到果妮基因组中(DiNocera et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. . USA 80:7095(1983))。而且，热激启动子的mRNA能在果蝇细胞中大量翻译(McGarry et al.，Cell42 :903(1985))oB.J. Bond等揭示了黑腹果蝇肌动蛋白5C基因的结构(B.J. Bond et al, Mol.Cell. Biol. ,6(6) :2080(1986))。该报道还讨论了肌动蛋白5C基因的两个起始位点，这两个位点在启动子序列之间融合；细菌氯霉素乙酰转移酶基因插入到黑腹果蝇宿主细胞中。大肠杆菌gal K基因在果蝇细胞系中表达时受到黑腹果蝇启动子的调控(H. Johansen et al,28th Annual Drosophila Conference, p.41 (1987))。多篇文献均讨论了潮霉素B(hygromycin B)选择系统(A. Vanderstraten et al,Proceedings of the 7th International Conference on Invertebrate and Fish TissueCulture,Abstract,University of Tokyo Press,Japan, (1987) ；A. Vanderstraten et al,in" Invertebrate and Fish Tissue Culture" , Eds. Y. Kuroda et al,Japan ScientificSocieties Press, Tokyo,pp.131-134, (1988))。本发明不限于特定的果蝇细胞系，较佳的，本发明使用的果蝇细胞系为黑腹果蝇S2细胞系。S2细胞是一种稳定的多倍体果蝇胚胎细胞(Schneider, J. Embryol. Exp.Morph. 27 :353(1972))。将gpl60或其剪切体形式gpl20或gp41、或其其他派生物的cDNA编码序列通过DNA转染技术导入果蝇S2细胞可生产大量的HIV env蛋白。表达tPA也能获得相似的结果。使用果蝇S2细胞有许多优点，包括但不限于，它能在室温下进行高密度生长。稳定的筛选系统已获得了高达1000个拷贝的表达单元插入宿主细胞基因组中。其他的果蝇细胞系统也可在本发明中使用，如无血清细胞系-KC-O黑腹果蝇细
胞系(Schulz et al, Proc, Nat' I Acad. Sci. USA, 83 :9428 (1986))。但早先的研究表明KC-O细胞系转染比S2细胞系转染难。另一种可用的细胞系是来自Drosophila hydei的细胞系，该细胞系能用于蛋白表达，但是，蛋白表达效率较低(Sinclair et al, Mol. Cell.Biol.，5 :3208(1985))。其他本发明可用的果蝇细胞系还包括SI细胞系和S3细胞系。本发明使用的果蝇细胞能在多种合适的培养基中培养，包括M3培养基。M3培养基PH值为6. 6，由一系列平衡盐以及必须氨基酸组成。培养基的制备见文献描述(Lindquist，DIS, 58 :163(1982))。其他常规培养基也可用于果蝇细胞培养。较佳的启动子为黑腹果蚬启动子(Lastowski-Perryet al, J. Biol. Chem. , 260 1527(1985))。该诱导型启动子能在CuS04存在的情况下高水平转录基因。在表达系统中使用黑腹果蝇启动子，在高拷贝数的情况下也能维持调节能力。然而在哺乳动物细胞中金属离子对于哺乳动物metalIothionein启动子的调节能力是随着拷贝数的增加而减弱的。 在果蝇表达系统中，维持的诱导效力增加了在基因高拷贝数的情况下，基因的表达量。果蝇肌动蛋白5C基因启动子(B. J. Bond et al,Mol. Cell. Biol. ,6 :2080(1986))也是一种理想的启动子序列。肌动蛋白5C基因启动子是一种组成型启动子，它不需要额外金属离子的诱导。所以，该启动子可能比黑腹果蝇启动子更适用于大规模生产系统。该启动子的另一个优点是在没有高浓度铜离子的培养基中，细胞能够长时间保持更好的状态。其他果蝇启动子还包括诱导型热激(Hsp70)启动子和COPIA LTR启动子。SV40早期启动子系统的表达水平比黑腹果蝇启动子系统低。通常用于细胞表达载体中的启动子如arian Rous肉瘤病毒LTR和猿病毒(SV40早期启动子)，他们在果蝇系统中的功能及表达能力均较差。本发明所述的果蝇S2细胞是一种商业化的细胞,例如可购自Invitrogen公司。现有技术中，所述的果蝇S2细胞常规被应用于外源蛋白的表达与生产。S2细胞可在室温条件下生长并且不需要C02。由于果蝇S2细胞能够半悬浮生长，所以可实现高密度地生长。外源蛋白用可诱导的启动子(如MT启动子)或稳定表达的启动子(如Ac5启动子)表达出来。而且，多种外源信号肽在S2细胞中都可以将分泌蛋白正常释放出来。尽管果蝇S2细胞已被用于生产多种外源蛋白，但尚未有研究报道采用此系统从 包膜和非包膜蛋白病毒中生产VLP。本发明人经过了大量地研究工作，发明了用果蝇S2细胞来高效地生产病毒样颗粒(VLP)的方法，特别是用于生产针对流感病毒的病毒样颗粒以及针对HIV病毒的病毒样颗粒。本发明人首次在所述的果蝇S2细胞中被转入编码病毒核心蛋白的核酸序列以及编码包膜病毒抗原蛋白的核酸序列以生产包膜病毒的病毒样颗粒。较佳地，该包膜病毒为从宿主细胞的细胞膜上芽生时获得包膜的病毒。作为本发明的优选方式，所述的果蝇S2细胞中还被转入包含编码病毒颗粒蛋白表达调节因子蛋白(Rev)的核酸序列的表达构建物，其有助于更高效地形成病毒样颗粒。Rev蛋白，即调节HIV病毒颗粒蛋白表达的蛋白质(regulator of exPression of virionProtein) 0 Rev蛋白是一个重要的调节HIV基因复制的反式激活因子。对HIV调节蛋白有负调控作用，对病毒颗粒蛋白有正调控作用，其主要功能是促进HIV基因表达由早期(转录调节蛋白mRNA)向晚期(转录HIV结构蛋白mRNA)的转化,并促进晚期转录的进行。在rev基因缺陷的HIV原病毒，仅有早期基因表达。只有在加入Rev蛋白后，晚期基因才开始转录。另外，Rev蛋白还在转运结构蛋白mRNA进入细胞质的过程中发挥作用，这可能是经过在核内抑制RNA加工系统或增强RNA转运系统来完成的。编码病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的片段或变体的抗原核酸序列也是可用的。所述的片段或变体(衍生物或类似物)是指基本上保持所述的病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。所述的病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。所述的病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的片段至少保持50%的所述全长蛋白的活性。在更优选的条件下，所述片段能够保持全长蛋白的 60%,70%,80%,90%,95%,99%^ 100%的活性。所述的编码病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的片段或变体的核酸序列可以是经过密码子优化的，这种密码子优化可以是根据果蝇S2细胞的偏好设计的。一些商业化的软件可用于进行密码子优化的设计。本发明所述的构建物可以是或来自于表达载体。本发明对所述的表达载体没有特别的限制，只要其包含了一些对于蛋白表达必要的元件，且这些元件可操作性相连。只要能在本发明的果蝇S2细胞内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。作为本发明的优选方式，所述的表达载体中，启动子为果蝇细胞启动子，例如选自MT启动子或Ac5(AC)启动子。事实上，果蝇细胞中的其它启动子也可适用于病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的表达。 包含上述的适当的抗原核酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化宿主细胞，以使其能够表达蛋白质，最终形成病毒样颗粒。所述的宿主细胞是果蝇S2细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如磷酸钙转化(转染)法。利用本发明的系统可大量地、高效地生产出病毒样颗粒。生产方法是将所述的构建物转化所述的病毒样颗粒生产细胞，获得重组病毒样颗粒生产细胞；和培养所述的重组病毒样颗粒生产细胞，从而表达获得病毒样颗粒。本发明的系统仅采用质粒转化细胞来获得病毒样颗粒，其产生出的病毒样颗粒中不存在重组病毒污染。作为本发明的优选方式，所述的构建物是构建物组合，例如包括构建物1，其中包括以下操作性连接的元件启动子，人类免疫缺陷病毒的包膜蛋白前体Gpieo ;构建物2，其中包括以下操作性连接的元件启动子，病毒颗粒蛋白表达调节因子；和构建物3，其中包括以下操作性连接的元件启动子，核心蛋白gag。该构建物组合在转化果蝇S2细胞后，包膜蛋白前体Gpl60可在S2细胞中正确地、适当地剪切成为gpl20和gp41，最终能够非常高效地获得病毒样颗粒，其免疫原性非常高。作为本发明的优选方式，所述的构建物是构建物组合，例如包括构建物1，其中包括以下操作性连接的元件启动子，流感病毒的血凝素抗原(HA);构建物2，其中包括以下操作性连接的元件启动子，流感病毒的神经氨酸酶抗原(NA);和构建物3，其中包括以下操作性连接的元件启动子，流感病毒的基质蛋白Ml。该构建物组合在转化果蝇S2细胞后，HA和NA包膜蛋白可有效地组装成VLP，能够从细胞中释放出来，其颗粒大小与野生病毒十分相似，其免疫原性非常高。作为本发明的优选方式，所述的构建物是构建物组合，例如包括构建物1，其中包括以下操作性连接的元件启动子，流感病毒的血凝素抗原(HA);构建物2，其中包括以下操作性连接的元件启动子，流感病毒的神经氨酸酶抗原(NA);和构建物3，其中包括以下操作性连接的元件启动子，人类免疫缺陷病毒的核心蛋白gag。该构建物组合在转化果蝇S2细胞后，HA和NA包膜蛋白可有效地组装成VLP，能够从细胞中释放出来，其颗粒大小与野生病毒十分相似，其免疫原性非常高。
其它形式的带有病毒核心蛋白或包膜病毒抗原蛋白的核酸序列以及必要的基因表达元件(如启动子)的构建物也包含在本发明中，只要它们能够在转化果蝇后获得所述的病毒样颗粒。由此，S2系统所生产出的病毒样颗粒能克服重组杆状病毒载体转染的昆虫细胞所生产VLP时出现弊端。病毒样颗粒和组合物本发明还提供了具有免疫原性的病毒样颗粒，其基本上由本发明所述的病毒样颗粒生产系统以及方法制备获得。机体免疫系统的MHC I型和MHC II型对以颗粒状形式存在的外源性抗原的提呈较对可溶性单体抗原的提呈要强1000或10000倍，即以颗粒状形式存在的抗原比可溶性单体抗原具有更强的免疫原性，机体免疫系统的MHC I型和MHC II途径对以颗粒状形式存在的外源性抗原的提呈较对可溶性单体抗原的提呈要强1000或10000倍，即以颗粒状形式存在的抗原比可溶性单体抗原具有更强的免疫原性。本发明还提供所述的具有免疫原性的病毒样颗粒的用途，根据所采用的编码抗原蛋白的核酸序列的不同，其用于治疗不同的微生物感染疾病。所述的微生物感染疾病在例如(但不限于)感冒、获得性免疫缺陷综合征、肺炎、肝炎、气管炎、疱疹、眼内炎、角膜炎、麻疹、腮腺炎、麻疹、水痘或带状疱疹。当所述当抗原蛋白是来源于流感病毒或HIV病毒当情况下，所述当病毒样颗粒用于预防或治疗感冒或获得性免疫缺陷综合征。本发明还提供一种具有免疫原性的组合物(预防性或治疗性的疫苗)，所述的组合物包含有效量的本发明所述的具有免疫原性的病毒样颗粒，和药学上可接受的载体。所述的药学上可接受的载体指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’ s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化齐U、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂；较佳地为注射剂。动物实验表明，利用本发明的具有免疫原性的病毒样颗粒制成的病毒样颗粒免疫动物后，可在动物体内产生高效价的抗体。在使用时，是将安全有效量的本发明所述的具有免疫原性的病毒样颗粒施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约I微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约I微克/千克体重-约I毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。作为本发明的一种方式，所述的组合物中还包括免疫刺激剂或佐剂。例如ISA720、CpG ODN或ISA51等。然而，本发明人的研究结果表明，在不添加任何佐剂的情况下，所述的病毒样颗粒也具有很好的免疫原性并且异源DNA-VLP免疫策略能够诱导出较好的中和抗体活性和CTL反应。在流感病毒的攻毒模型中，该策略显示了完全的免疫保护性。、
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆实验室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第3版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料与方法细胞
将从Invitrogen公司购买的果蚬S2细胞在添加了 10 %胎牛血清(GIBCO catnol6000)的 Express FIVE SFM(GIBCO cat no 10486)培养基在 28°C无 C02 环境下培养，直至达到每毫升0. 5至2X IO6个细胞浓度时再用于转染。质粒构建HIV-I包膜(HIVenv)和Rev基因(HIVrev)序列，以及编码流感M1、HA和NA的基因是用PCR，重叠PCR或recursive PCR来产生。重组质粒构建如下pMT-bip-HIVenv (pDOL)的构建将HIV 包膜蛋白原始质粒 CMV/R_Gpl60 pD0L(购自 AIDS Reagents andDepositary program,NIAID,NIH)上编码包膜蛋白的核酸序列通过PCR方法扩增(引物正向ctagaattcaacagagaagctgtggg(SEQ ID NO 2):反向GATGCGGCCGCTTACTTTCC(SEQ IDNO :3))然后插入到果蚬 S2 表达载体 pMT-bip vector(购自 invitrogen)的 Bglll’EcoRI位点。HIVenv (pDOL)的氨基酸序列和碱基序列分别如Genbank登录号AAC82596和AF033819. 3(5771bp-8341bp)所示。pMT_biP-gpl60 (consensus B 和 C)的构建以HIV-lconsensus B和C包膜基因为模板，PCR扩增缺失信号肽的编码HIVconsensus B 和 C gpl60 的 cDNA(如 Kothe, D. L et al, Virology 360 :218-34 和Virology352 :438-49中方法构建)，将扩增序列插入TA vector (Invitrogen)。测序后，将正确的序列切下插入pMT/BiP/V5-His (Invitrogen)的EcoR I和Xho I位点，获得的质粒命名为 pMT/BiP-gpl60 (consensus B 和 C), respectively。Gpl60/consensus B 的序列如 SEQ ID NO :14 或 Gene Bank :DQ667594 所不。Gpl60/consensus C 的序列如 SEQ ID NO :15 或 Gene Bank :DQ401075 所不。pMT-bip-HIVrev 的构建将HIVrev 原始质粒 pZeoSV/rev (购自 IPS, Institut Pasteur of Shanghai)上编码rev的核酸序列通过PCR方法扩增(引物正向CtaRaattcaccatRRcaRRaaRaaR(SEQ IDNO 4)和反向AGTGCGGCCGCCTATTCTTTAGC(SEQ ID NO :5))然后插入到 pMT-bip vector 的EcoR I 和 Not I 位点。HIVrev的氨基酸序列和碱基序列分别如Genbank登录号CAA41586和X58781所
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pMT-HIVgag 和 pAC-HIVgag 的构建将HIVgag 原始质粒 P55M(I-IO)(如 Ralf Schneider et al. Journal ofVirology 1997 :4892-4903中方法构建)上的gag相应核酸序列通过recursive PCR方法(参见 Ai-Sheng Xiong et al Nature Protocol 1(2)2006:791)扩增(引物正向gtcgaattcaccatgggtgcga(SEQ ID N0:6)，反向GTAGCGGCCGCTTATTGTGACG(SEQ ID NO :7))然后分别插入到 pMT/V5_His A (购自 Invitrogen)和 pAc5. l/V5_His A (购自 Invitrogen)的 EcoR I/Not I 位点。
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HIVgag的碱基序列(见图18)。pMT-bip-HA 的构建将HA 原始质粒 CMV/R HA(Th)(如 Tsai C，et al Vaccine. 2009Novl2 ；27(48)6777-90中方法构建)上的HA ORF中aal9_aa568的相应核酸序列通过PCR方法扩增(引物正向GGGAGATCTTGCATCGGATACCACG(SEQ ID NO :8)，反向CCCGAAITCTCAGATGCAGATTCTGC(SEQ ID NO :9))后插入到 pMT-bip vector 的 Bglll，EcoRI 位点。HA的氨基酸序列和碱基序列分别如Genbank登录号AAS65615和AY555150. 2(lbp-1718bp)中所记载。pMT-bip-NA 的构建将NA 原始质粒 CMV/R NA (Th)-FLAG (如 Tsai C，et al Vaccine. 2009Novl2 ；27(48) :6777-90中方法构建)上的NA ORF全长的相应核酸序列通过PCR方法扩增(引物正向GGGGGATCCATGAATCCTAATAAGAAGATCAT(SEQ ID NO: 10)，反向CCCGAATTCCTCACTTATCGATTGTAAAAGGCA(SEQ ID NO :11))后插入到 pMT-bip vector 的 Bglll，EcoRI 位点。NA的氨基酸序列和碱基序列分别如Genbank登录号AAS65616和AY555151. 3(21bp-1370bp)中所记载。pAC-Ml 的构建将Ml 原始质粒 CMV/R Ml (SZ)(如 Tsai C，et al Vaccine. 2009Novl2 ；27(48)6777-90中方法构建)上的Ml全长的相应核酸序列通过PCR方法扩增(引物正向CGGGAATT CACCATGAGTCTTCTAACCGAGG(SEQ ID NO: 12)，反向CCCTCTAGATCACTTGAATCGCTGCATCTG(SEQ ID NO :13))后插入到 pGEM T easy vector (购自 Progema)中，再由上述质粒中用EcoR I切下目的片段插入至pAc5. 1/V5-His A的EcoR I位点。Ml的氨基酸序列和碱基序列分别如Genbank登录号AB036645和EF137707. l(lbp-759bp)中所记载。产生稳定转染的果蝇S2细胞株为生产HIV VLP(pDOL)，本发明人构建了三个质粒第一个编码HIV-I的包膜蛋白(HIVenv (pDOL)，又称为Gpl60 (pDOL))，包膜蛋白的编码基因插入在可诱导的MT启动子后，该质粒为 pMT-bip-HIVenv (pDOL);第二个(pMT-HIVgag)和第三个(pAC-HIVgag)均编码HIV-1 gag蛋白，编码基因分别插入在可诱导的MT启动子和稳定性的Ac5启动子之后。用磷酸|丐转染的方法将(第一个4. 75 ii g和第二个9. 5 ii g)或(第一个4. 75 ii g和第三个9. 5 u g)质粒连同4. 75 u g pMT-bip-HIVrev以及Iug含有Hygromycin B抗性基因的载体质粒的 pCoBlast (购自 Invitrogen 公司，cat no R210-0IBlasticidin S HCl)一同转入S2细胞。转染后48个小时，将hygromycin B加入到培养液中，于室温无CO2的条件下培养2 3周直到稳定转染的细胞株出现。由此稳转细胞株产生的VLP命名为HIVVLP(pDOL)。用抗HIV-1 gag蛋白的抗体和包膜蛋白的单克隆抗体通过蛋白免疫印迹法对稳定转染的细胞株在使用和不使用5 u molCdCl2诱导3天时对细胞裂解液和细胞培养上清中的HIV-1 gag蛋白和包膜蛋白的表达均进行了检测。发明人还构建了pMT/BiP_gpl60 (consensus B 和 C),将 4.75iig pMT/BiP-gpl60 (consensus B 和 C)与 9. 5 u g pAC-HIVgag, 4. 75 u g pMT-bip-HIVrev 以及 lug含有Hygromycin B抗性基因的载体质粒的pCoBlast —同转入S2细胞，同上获得稳定转染的细胞株。由此稳转细胞株产生的VLP命名为HIV VLP (consensus B和C)。为了产生流感病毒VLP，本发明人首先比较了以流感病毒Ml蛋白和HIV-1 gag蛋白为核心蛋白时所产生出的流感病毒VLP颗粒的不同。构建了插入在稳定性启动子Ac5后 面的编码流感病毒Ml蛋白的质粒(pAC-Ml)和插入在诱导性启动子MT后面的编码流感病毒HA和NA蛋白的质粒(pMT-bip-HA和pMT-bip-NA)。如前面所述，这些质粒，即pAC_Ml，pMT-bip-HA 和 pMT-bip-NA (用于形成 H5N1HA-NA-M1VLP)；或 pAC-HIVgag，pMT-bip-HA 和pMT-bip-NA (用于形成H5N1HA-NA-HIV-1 gag VLP)分别和含有blasticidin抗性基因的载体pCoBlast (购自Invitrogen公司)一起转入S2细胞并挑出稳定转染的S2细胞株。然后对广生的VLP的表达和组装进彳丁研究。鉴定S2细胞中的转基因可正常表达后，采用有限稀释法产生稳定转染的S2细胞克隆。通常情况下，本发明人从稳定转染的S2细胞株中挑选20个克隆通过蛋白印迹分析方法鉴定出高表达病毒样颗粒的克隆。病毒样颗粒的生产和鉴定在建立出可高产量生产出VLP的稳定转染的S2细胞株后，将细胞置于150平方厘米的细胞培养瓶中于完全培养基(10%胎牛血清的Express Five SFM培养基)中进行培养，直至细胞浓度达到500 X IO7个。然后收集细胞置于2L的旋转培养瓶中在含有500ml新鲜培养基(不外加10%胎牛血清的Express Five SFM)中进行培养。收集细胞培养上清液中的VLP浓缩7倍。然后将浓缩的上清液于4°C条件下20000rpm离心2. 5小时(BeckmanCoulter, Fullerton, CA)。将粒子重浮于PBS中，于-80°C冰箱中存放。也可以采用带有WAVEP0D过程控制单元的微波生物反应器20/50EHT系统(GEHealthcare)，并以分批加料的培养方式培养S2克隆，从而生产HIV_1 VLP和流感病毒VLP。首先，在300ml完全的Express FIVE SFM培养基中接种6X 108S2细胞，将其置于2L细胞袋并在28°C无C02环境下培养。起始的摇摆速度为22rpm，摇摆角度为8°，至第3天，将摇摆速度增加至26rpm，摇摆角度增加至9°。培养至第5、7、8天，分别加入300、200、200ml新鲜的完全Express FIVE SFM培养基。第8天，在培养基中加入CdCl2至终浓度5 U M，用于诱导表达HIV-I包膜蛋白和流感病毒HA、NA蛋白。诱导3天以后，收集培养上清，于4°C离心出，000 Xg) 30分钟弃沉淀，上清再用0.45 iim过滤器过滤。用带有50，000NMWCHollow Fiber Cartridge (Model UFP-50-C-4MA)的 QuixStand Benchtop 系统将滤过的上清浓缩5倍。通过20%的蔗糖缓冲液超速离心来收集浓缩上清中的HIV-1 VLP或流感病毒VLP，并重悬于PBS中，分装并储藏于_80°C冰箱。在11天的加料分批培养中，每24小时收集少量的细胞上清。细胞的数量及活性通过台盼蓝排斥实验计算。HIV-1 VLP的量通过检测 HIV-1 gpl20 和 gag p55 来测定。
为鉴定VLP的特性，采用SW41转子、25000转速及4°C条件下对上述重浮的粒子进一步25-65%蔗糖梯度离心16小时。从离心管头部到底部的各梯度中收集了 12个组份，每份为0.96ml。TCA沉淀后。通过12% SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上。蛋白印迹封闭于含有5%的脱脂奶粉和0. I %的吐温20的Tris盐酸缓冲液中，随后与第一抗体抗HIV-Igag p24的抗体、HIV-lgp l60的抗体、抗HIV-1 gpl20的抗体、抗HIV-1 gp41的抗体、抗HA抗体，抗NA抗体或抗Ml抗体孵育，使用二抗为AP偶联的抗小鼠抗体(Promega)检测并显色，以上均可按厂商推荐操作。为进一步鉴定HIV和流感VLP，生产VLP的细胞和浓缩的VLP粒子在用2. 5%戊二醛固定30分钟后再用1%的四氧化锇固定。固定好的样本用50-100%浓度逐渐递增的酒精脱水，然后包埋于环氧树脂混合物中。在60°C温度下聚合72小时。超薄切片用乙酸双氧铀染色，最后通过透射电镜(model JEM 1230，JEOL Ltd.，Japan)进行观察和拍照。为了检测HIV-1 VLP的HIV-I包膜蛋白的量，用Iii g/ml抗HIV-1 gpl20 C5捕获抗体(Santa cruz Cat. #4302)包被96孔EIA/RIA平板(Costar)过夜。包被后的平板用含有5% BSA的PBS于37°C封闭I小时。将含有VLP的培养上清、VLP的浓缩样本、或作为标准品的连续稀释(稀释液10% BSA，0.5% Triton X-IOOin PBS)的纯化gpl20蛋白(同Proc Natl Acad Sci USA 91 :8314-8中描述制备)加到包被的96孔板中，并于37°C孵育2小时。然后用PBST缓冲液(0. 05% Tween 20in PBS)洗平板5次。加入按I : 2，000稀释的抗gpl20抗体(Santa cruz Cat. #4301),再孵育I小时。加入按I : 5，000稀释的结合有辣根过氧化物酶(HRP)的羊抗鼠IgG(Chemicon)。使用TMB底物试剂盒(Pierce)进行比色分析，用分光光度计(BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)读取450nm下的吸光度。以纯化gpl20蛋白的量制作标准曲线从而计算HIV-1 VLP的HIV-I包膜蛋白的量。为了检测HIV-1 VLP的gag p55的量，将含有VLP的培养上清、VLP的浓缩样本、或作为标准品的倍比稀释的p24标准品(从400ng开始)(Aalto BioReagents)置于4_12%Bis-Tis胶(Invita)gen)上，然后转移至PVDF膜。然后用含有5%脱脂奶粉封闭PVDF膜，随后用抗gag p24抗体检测。抗原可直接由按I : 5，000稀释的结合有辣根过氧化物酶(HRP)的抗鼠IgG抗体(MultiSciences)以及EZ-ECL底物(Thermo)指示。通过比较待测样本(HIV-1 VLP)中p55和p24标准品的条带密度，使用Quantity One软件(Bio-Rad)确定HIV-1 VLP的Gag的量。抗高致病性禽流感H5N1 (highly pathological avian influenza, HPAI)的免疫
与攻毒H5N1HA-NA-HIV-1 gag VLP收获后，浓缩，用PBS过夜溶解，做血凝实验来定量(Webster, R. G. , Cox,N. , andStohr,K. (2002)WHO Manual on Animal Influenza Diagnosisand Surveillance. Available from http://www.who. int/csr/resources/publications/influenza/whocdscsrncs20025)。免疫时每只小鼠注射相当于29个HA血凝单位的禽流感H5N1 VLP0年龄6-8周的雌性BALB/c小鼠随机分成4组，每组6只。免疫和攻毒时间如表I。第一组小鼠(PBS):对其两只后腿共肌肉注射200uL PBS (pH7. 4)进行初次免疫和加强免疫。第二组小鼠(VLP-VLP):初次免疫和加强免疫用含有29个HA血凝单位的禽流感H5N1VLP的200uL PBS进行肌肉注射。第三组小鼠(DNA-DNA):初次免疫和加强免疫均用将含有IOOug编码H5HA的质粒DNA(pMT-bip-HA)的 200uL PBS 进行肌肉注射。第四组小鼠(DNA-VLP):肌肉注射含IOOug编码H5HA的质粒DNA (pMT-bip-HA)的200uL PBS进行初次免疫，再肌肉注射含有29个HA血凝单位的禽流感H5N1VLP的200uLPBS进行加强免疫。第7天初次免疫，第28天加强免疫。在初次免疫的前7天和加强免疫的后7天收集血清样本，于56°C热灭活，分装保存于_80°C。加强免疫后的两周(第42天)，用50ul IOMLD5tl(10个动物半数致死量)同源H5N1 病毒 A/Shenzhen/406H/06，subclade 2. 3. 4(参见 NEngl J Med. 2007 ；357(14) 1450-1451)，和异源 H5N1 病毒 A/Cambodia/P0322095/05，clade I (参见 Viruses. 2009 ；
I(3) :335-36)，或者用50ul I, OOOMLD50同源H5N1病毒和异源H5N1病毒对每组小鼠进行攻毒。每日观察记录小鼠的病理特征，如昏睡、脱发及体重降低等特征。攻毒4天后，从每个免疫攻毒小组中选I只小鼠处死后，取肺部组织用于组织病理学检测。而对于其它小鼠，若体重较原始体重减少20%或更多时，将被实施安乐死，统计上记为死亡。期间所有的操作都将严格依据农业部下达的关于关注和使用实验动物的指导方针、动物福利行动、及农业部下达的微生物生物化学实验室生物安全指导方针进行。表I、免疫和攻毒时间表
权利要求
1.一种生产包膜病毒的病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括 将编码包膜病毒抗原蛋白的核酸转化果蝇细胞，获得重组病毒样颗粒生产细胞；培养该重组病毒样颗粒生产细胞，从而表达获得病毒样颗粒。另一优选例中该果蝇细胞为黑腹果蝇S2细胞。
2.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，所述的核酸包括编码病毒核心蛋白的核酸和编码包膜病毒抗原蛋白的核酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括 (A)提供表达构建物I，其包括编码病毒核心蛋白的核酸序列； (B)提供表达构建物2，其包括编码包膜病毒抗原蛋白的核酸序列； (C)将(A)和⑶的构建物转化黑腹果蝇S2细胞，获得重组病毒样颗粒生产细胞；和 (D)培养(C)的重组病毒样颗粒生产细胞，从而表达获得病毒样颗粒。
4.如权利要求2和3所述的方法，其特征在于，所述的病毒核心蛋白选自人类免疫缺陷病毒Gag蛋白、流感病毒Ml蛋白、猴免疫缺陷病毒Gag蛋白、小鼠白血病病毒Gag病毒核心蛋白、水疱性口炎病毒M病毒核心蛋白、埃博拉病毒VP40病毒核心蛋白、冠状病毒M和E蛋白、布尼亚病毒N蛋白、丙型肝炎病毒核心蛋白C、乙型肝炎病毒核心蛋白、SARS冠状病毒核心蛋白和其组合物。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的包膜病毒为从宿主细胞的细胞膜上芽生时获得包膜的病毒。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的病毒包括流感病毒、人类免疫缺陷病毒、负黏液病毒、博尔纳病病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒。
7.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的表达构建物I和表达构建物2位于一个表达载体上；或所述的表达构建物I和表达构建物2位于不同表达载体上。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为非病毒载体。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的表达载体中所用的启动子为果蝇细胞启动子，选自MT启动子或Ac5启动子。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的非病毒载体选自pMT/V5-His、pMT/BiP/V5-His、pMT_DEST48 或 pMT/V5-His_TOPO。
11.如权利要求1-2所述的方法，其特征在于，还包括将编码病毒颗粒蛋白表达调节因子蛋白的核酸转化该黑腹果蝇S2细胞。
12.如权利要求1-2所述的方法，其特征在于，还包括将抗性筛选基因转化该黑腹果蝇S2细胞。
13.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的病毒样颗粒是流感病毒来源的病毒样颗粒，所述方法包括 (Al)提供表达构建物1，其包括编码人类免疫缺陷病毒Gag蛋白的核酸序列或编码流感病毒Ml蛋白的核酸序列； (BI)提供表达构建物2，其包括编码流感病毒神经氨酸酶抗原的核酸序列和/或编码流感病毒的血凝素抗原的核酸序列； (Cl)将(Al)和(BI)的构建物转化黑腹果蝇S2细胞，获得重组病毒样颗粒生产细胞；和(Dl)培养(Cl)的重组病毒样颗粒生产细胞，从而表达获得病毒样颗粒； 附加条件是所述的表达构建物I和表达构建物2位于一个表达载体上；或所述的表达构建物I和表达构建物2位于不同表达载体上。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(BI)所述的表达构建物2中，所述的编码流感病毒神经氨酸酶抗原的核酸序列和编码流感病毒的血凝素抗原的核酸序列位于同一个表达载体上或者位于不同表达载体上。
15.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的病毒样颗粒是人类免疫缺陷病毒来源的病毒样颗粒，所述方法包括 (A2)提供表达构建物I，其包括编码人类免疫缺陷病毒Gag蛋白的核酸序列； (B2)提供表达构建物2，其包括编码人类免疫缺陷病毒的包膜蛋白前体Gpl60的核酸序列； (C2)将(A2)和(B2)的构建物转化黑腹果蝇S2细胞，获得重组病毒样颗粒生产细胞；和 (D2)培养(C2)的重组病毒样颗粒生产细胞，从而表达获得病毒样颗粒； 附加条件是所述的表达构建物I和表达构建物2位于一个表达载体上；或所述的表达构建物I和表达构建物2位于不同表达载体上。
另一优选例包括提供表达构建物3，其包括编码人类免疫缺陷病毒的rev的核酸序列；将表达构建物3同表达构建物I和2 —起转化黑腹果蝇S2细胞。
16.由权利要求1-15任一所述的方法获得的病毒样颗粒。
17.权利要求16所述的病毒样颗粒在制备预防、控制或治疗下述疾病、病症或状况的药物中的用途流感、艾滋病、麻疹、呼吸道合胞体病毒感染、腮腺炎、肺炎病毒感染、博尔纳病、狂犬病、埃博拉出血热。
18.一种具有免疫原性的组合物，其特征在于，所述的组合物包含 (a)权利要求16所述的病毒样颗粒；和 (b)药学上可接受的载体。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中还包括免疫佐剂。
20.一种疫苗组合，其特征在于，所述组合包括 (i)抗原蛋白；或表达抗原蛋白的构建物，其中含有编码该抗原蛋白的抗原核酸序列； (ii)病毒样颗粒，所述的病毒样颗粒由权利要求1-15任一所述的方法获得。
21.一种用于生产病毒样颗粒的试剂盒，包括 (1)表达载体，包括表达构建物I，其包括编码病毒核心蛋白的核酸序列；和表达构建物2，其包括编码包膜病毒抗原蛋白的核酸序列；和 (2)果蝇S2细胞。
22.如权利要求21所述的试剂盒，其特征在于，(I)中，表达载体还包括表达构建物3，其包括编码调节病毒颗粒蛋白表达的蛋白质的核酸序列的；和/或表达构建物4，其包括抗性筛选基因的序列； 附加条件是所述的表达构建物I和/或表达构建物2和/或表达构建物3和/或表达构建物4位于一个表达载体上或位于不同表达载体上。
23.—种果蝇细胞，其特征在于，该果蝇细胞包含用于生产包膜病毒的病毒样颗粒的载体。该果蝇细胞优选黑腹果蝇S2细胞。
24.如权利要求23所述的果蝇细胞，其特征在于，所述的生产包膜病毒的病毒样颗粒的载体包括编码病毒核心蛋白的核酸和编码包膜病毒抗原蛋白的核酸。全文摘要
本发明涉及一种利用果蝇细胞生产病毒样颗粒的方法及应用。利用本发明的方法生产包膜病毒的病毒样颗粒，蛋白能够得到正确的表达、剪切和组装，最终获得具有良好的免疫原性的病毒样颗粒。本发明还提供了表达所述病毒样颗粒的重组细胞，以及含有所述病毒样颗粒的组合物。
文档编号A61K48/00GK102676461SQ20121007313
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月19日 优先权日2011年3月17日
发明者丁衡, 周保罗, 周梵, 宋宇峰, 杨立飞, 蔡车国 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所