专利名称：草麻黄、草麻黄水提物作为制备治疗创伤性脑打击的药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及草麻黄的用途，尤其涉及草麻黄在制药领域中的应用。
背景技术：
重型颅脑损伤的死亡率仍高达30 50%，致残和后遗症也较严重；推其原因，除一部分特重型脑损伤和特急性颅内血肿难以救活外，伤后急性期脑的继发性炎症反应也是重要原因之一。研究证明补体激活成份C3a，C5a，MAC等是一组重要的炎性介质，在感染、创伤、缺血再灌注损伤、自身免疫疾病等多种原因引起的急、慢性炎症反应中，参与介导了对自身组织的损伤。脑内补体系统经三种途径激活，最终可形成C5b-9攻膜复合体(membraneattack complex, MAC)及一系列具有重要生物学效应的补体蛋白片段,①颉脑损伤BBB遭到破坏后，血浆与中枢神经系统的抗原物质(如髓鞘等)接触，细胞缺血坏死后释放亚细胞结构(如线粒体等)，使补体沿着不依赖抗体的经典途径激活。②抗磷脂抗体与脑磷脂、鞘磷脂等形成抗原抗体复合物，经过依赖抗体的替代途径激活补体。③脑缺血毛细血管内皮细胞破坏，可经甘露醇结合凝集素途径激活补体。脑内补体激活导致脑损伤，可造成以下伤害直接破坏BBB，引起脑水肿；通过膜攻击作用使红细胞溶解，神经元死亡；引起炎性细胞因子释放，加重脑损伤。因此，通过调控补体活化保护脑组织的方法将会是人们在脑损伤的后续治疗中的一条有效途径。因此，用补体抑制剂阻断补体活化可能成为治疗炎症的一种有效手段。目前，多种补体抑制剂正在研发之中，国外已成功获得基因重组的可溶性补体一型受体((sCRl)，并用于治疗大鼠心肌缺血再灌注损伤，疗效显著，目前已临床试用治疗急性成人呼吸窘迫综合症(ARDS)。但目前文献报道的系统性补体抑制剂虽然改善了炎症反应，由于补体系统在机体内的重要防御作用，同时产生的全身性补体抑制，也造成感染等潜在的副作用，此外，上述抑制剂的产量有限，价格昂贵，难以推广。因此研发靶向性高具有双向调节作用的补体抑制剂，提高作用特异性，从而减少可能导致严重系统性补体抑制的副作用，是目前国际研究的热点和难点。中医药学是我国的特色医学，为数众多的方剂和单药的防病治病作用已被几千年的医学实践所证实，它们也是寻找和开发抗重型颅脑损伤中抗炎效应药物的优质资源。麻黄属植物的枝茎常含有多种生物碱，其中以麻黄碱为主要有效成分，次为伪麻黄碱，此外，还含有微量的甲基麻黄碱、甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱和去甲基伪麻黄碱等，麻黄作为药用植物。麻黄属在中国的应用已有上千年的历史，有解表、散寒、平喘、止咳、利水等功能和松弛平滑肌、收缩血管及中枢兴奋等作用，可治风寒感冒、风寒咳嗽、气喘、水肿及支气管哮喘等病。化学研究麻黄主要成分为生物碱(1%-2%)，总生物碱的80%-85%为麻黄碱(左旋麻黄碱，L-ephedrine);其次为伪麻黄碱(D-pseudo-ephedrine,以及微量的 L-N-甲基麻黄喊(L-N-methyl-ephedrine)、D-N-甲基伪麻黄喊(D-N-methyl-pseudo-ephedrine)、去甲基麻黄喊(L-nor-ephedrine)、去甲基、伪麻黄碱(D-nor-pseudo-ephedrine)和麻黄次碱(ephedine,麻黄定)等；麻黄含有少量挥发油，油中含I-a-松油醇(I-a-terpineol，萜品烯醇)、2，3，5，6_四甲基毗嗪(2，3，5，
6-tetramethylpyrazine),尚含鞋质等。麻黄属药效扩张肾血管一增加肾血流量，阻碍肾小管对钠离子的重吸收，抗炎、抗过敏；其有效成分伪麻黄碱、甲基麻黄碱、麻黄碱，有抑制过敏递质释放，溶血素减少，呈抗补体，镇咳、祛痰作用；有效成分萜品烯醇、麻黄挥发油，有解热、抗菌、抗病毒作用；有效成分挥发油，有抗菌作用抗金黄色葡萄球菌，甲、乙型溶血链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、大肠杆菌、奈瑟双球菌；抗流感病毒作用等。在中国大部地区习用的麻黄为草麻黄(产东北、华北及河南、陕西)、木贼麻黄(产华北及西北)和中麻黄(产华北、西北及辽宁、山东、西藏)三种植物的枝条。其中草麻黄和中麻黄产量较大，木贼麻黄含麻黄碱量较高(占生物碱含量的85 90%)。在四川、云南、贵州亦用丽江麻黄，西藏用山岭麻黄入药。膜果麻黄在某些产地也作麻黄入药，但所含麻黄碱 量较低。此外，麻黄有固沙保土的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供草麻黄的新用途，即在制药领域中的新应用。实际上，本发明涉及草麻黄作为制备治疗创伤性脑打击的药中的应用。为了进一步提高对创伤性脑打击的治疗效果，上述优选采用中药草麻黄的水提物作为制备治疗创伤性脑打击的药中的应用。草麻黄的有机相提取物再经过相应的化学修饰可作为冰毒的有效成分，草麻黄本身是作为一种常规中药、应用广泛，且本发明作为治疗创伤性脑打击的药中应用的草麻黄有效成分是其水相提取物。具体地说，草麻黄水提物的提取工艺优选按如下步骤草麻黄生药(产地甘肃)400g，加PH4.0蒸馏水2000ml，6(TC过夜，煮沸I小时，过滤除渣；在水相中加入2M (即2mol/L，下同)NaOH调pH值至9. 0，出现大量沉淀，1500g离心力离心10分钟，弃上清液；加入无水乙醇洗沉淀三次，60°C烘干后得深褐色粗品；所得粗品粉末溶于蒸馏水中，2M HCl调pH值至4. 0，室温下磁力搅拌I小时，离心弃沉淀，再用2MNaOH调上清液pH值至9. O,离心弃上清液，上述酸溶碱沉淀过程重复三次，最后所得碱沉淀物溶于40ml蒸馏水中，调pH值至4. 0，4°C保存；最后采用硅胶柱(GF254，青岛海洋化工生产，粒度20(Γ260)层析，移动相为以体积比计的丙酮正丁醇水=5 4 1，然后采用pH为4的蒸馏水洗脱，将洗脱液pH值调至9，离心出现沉淀，去上清留沉淀，沉淀物反复按上述酸溶碱沉淀5次，得到的沉淀物即为草麻黄水提物。补体激活已经涉及人类神经系统诸多疾病，尤其在脑部疾病造成的脑损伤中起到重要作用，草麻黄水提物具有具有良好的补体抑制活性，本发明将草麻黄水提物作为医治颅脑打击伤后续治疗的药，开辟了草麻黄这一中草药的一种新用途。本发明在抑制补体激活方面为成功地减轻继发性脑损害提供了广阔的治疗前景，有益于降低脑损伤患者的伤残率和病死率；且草麻黄在我国分布广泛、价廉易得，是中药方剂中的常用药材。
图1:HE染色图；图I (a):生理盐水6小时XlOO倍；(b):草麻黄组6小时XlOO ;(C):生理盐水6小时X400 ;(d):草麻黄组6小时X400 ;(e):生理盐水I天XlOO ; (f):草麻黄组I天X400 ； (g):生理盐水I天X400 ； (h):草麻黄I天X400 ； (i):生理盐水3天XlOO ；(j):草麻黄3天XlOO ;(k):生理盐水3天X400 ;(1):草麻黄3天X400 ; (m):生理盐水7天XlOO ； (η):草麻黄7天XlOO ； (ο):生理盐水7天Χ400 ； (ρ):草麻黄7天Χ400。图2 C3补体免疫组化检测图；图3:大鼠生存曲线图；图4 :经典途径补体抑制活性图；图5 :替代途径补体抑制活性图； 图6 :补体后段活性的抑制作用图。为了进一步说明本发明的治疗效果，发明人提供以下实验数据一、体内实验草麻黄补体抑制活性成份(即草麻黄水提物)防治大鼠脑打击伤疗效的研究I、材料I. I动物及主要试剂清洁级健康成年雌雄各半SD大鼠，200 250g由第三军医大学大坪三院实验动物中心提供。草麻黄中补体抑制活性成份(草麻黄水提物)由重庆金麦生物科技有限公司提供，小鼠抗大鼠C3抗体(sant公司)，大鼠白介素_1 β (1L-1 β )、肿瘤坏死因子一a (TNF-a) ELISA试剂盒由上海西唐生物科技有限公司。I. 2动物分组和处理根据数字随机原则分为正常组、假手术组、生理盐水组、草麻黄组，每组再分为6h、ld、3d、7d四个时相点，每个时相点大鼠6只。根据前期的实验结果，草麻黄组给药剂量定为12mg/kg，3天通过灌胃给药3天，生理盐水组只灌注等量的生理盐水，每日剂量每天上午8:30给药，正常组、假手术组未做任何处理。2、实验方法2. I动物模型的制备颅脑致伤参照Feeney法[1]，建立大鼠实验重型颅脑损伤模型。用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，颅顶部脱毛、消毒；将大鼠固定于立体定向仪上，正中切开颅，以牙科钻在冠状缝后3mm与矢状缝右侧3mm交会处钻孔，扩大骨窗至6mmX6mm(前至冠状缝，左界为矢状缝右旁2_)，保持硬膜完整；将重30g的圆柱状打击杆(打击端直径45mm)沿垂直固定于立体定向仪上的套管内自20cm高度释放，打击中心即为钻孔点；以明胶海绵局部止血，至无活动性出血后间断缝合头皮。假手术组只开骨窗，不进行打击。2. 2神经功能评分将动物模型随机分为正常组、假手术组、生理盐水组、草麻黄组，观察生理盐水组、草麻黄组打击后生存时间，分别于术后6h、ld、3d、7d观察动物神经功能缺损评分并取材，评分标准采用Bederson[2]6级5分法正常为5级(O分);对侧上肢不能完全伸展为4级(I分)；向对侧推时抵抗力下降(置于光滑塑料板上)为3级(2分);提尾时向向对侧转圈为2级(3分)；自动转圈为I级(4分)；无自发性活动、意识障碍为O级(5分)。假手术组不予评分。2. 3ELISA检测致伤后上述时相点血清1L-1 β、TNF-a浓度2. 3. I标本收集及处理各组大鼠在上述时相点神经功能评分后，用3%戊巴比妥钠腹腔将大鼠麻醉后，开胸行心脏穿刺抽血，等血清静置30分钟后，以3000r/min离心10分钟，取上清液保存于-70 V冰箱待检测。2. 3. 2IL-I β、TNF-a浓度检测按IL-I β、TNF-a检测试剂盒说明进行，酶标仪上在450nm处测吸光值，以标准品配制浓度与之相对应的OD值建立标准曲线，根据OD计算血清中IL-I β、TNF-a浓度。2. 4免疫组织化学检测补体C32. 4. I取材将大鼠断头处死后，取出大鼠伤侧大脑组织用10%中性甲醛固定。2. 4. 2免疫组织化学按照蜡块切片常规步骤，O. 2%的H2O2灭活内源性过氧化物酶活性。小鼠抗大鼠的抗C3结合孵育后，洗涤后羊抗小鼠酶标二抗结合，联苯二胺(DAB )显色以后用盐酸乙醇分化、脱水，最后中性树胶封片。2. 5大鼠脑组织的含水量
取大鼠大脑组织致伤处约O. 250g左右称湿重后，将脑组织置于100°C烤箱内烘干24小时至完全脱水，称其干重，脑含水量(%) =(湿重-干重)/湿重X100%，以估计伤处脑组织水肿程度。2. 6生存率分析应用Kaplan-Meier曲线分析大鼠伤后各时间点生存率。(二)实验结果I、HE (苏木精-伊红染色法)观察结果结果见图1，6小时至7天脑组织变性坏死；血管充血、出血、水肿，小胶质细胞增生，生理盐水组比草麻黄组重，说明草麻黄水提物有保护脑组织的作用。2、神经功能评分除假手术组外，生理盐水组与草麻黄组大鼠在麻醉清醒后均出现一定程度的神经功能障碍症状，见表I。另外评分是确定造模成功的标准，5级与O级造模大鼠测定IL-I β、TNF-a浓度时需排除。表I
__6 小时____3_^__7_^_
草麻黄组 _3· 1667±0· 7527 3. 6667±0· 8165~ 4. 1667±0· 7528 2. 8333±0· 7528生理盐水组 2. 6667±0· 5164 2. 5000±O. 5477▲ | 3· 1667±0· 4082▲ | 2· 3333±0· 5164生理盐水组与草麻黄组比较*Ρ〈0. 05结果神经功能评分草麻黄组高于生理盐水组，第一天、第三天有统计学上的意义，第ld、3d有显著差异(ρ〈0.05)。麻黄水提物有保护脑组织的作用。3、炎症因子IL-I β、TNF-α检测结果表2炎症因子IL-I β检测结果
权利要求
1.草麻黄作为制备治疗创伤性脑打击的药中的应用。
2.草麻黄水提物作为制备治疗创伤性脑打击的药中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述草麻黄水提物是按如下步骤提取的 草麻黄生药400g，加pH4. O蒸馏水2000ml，60°C过夜，煮沸I小时，过滤除渣；在水相中加入2M NaOH调pH值至9. 0，出现大量沉淀，1500g离心力离心10分钟，弃上清液；加入无水乙醇洗沉淀三次，60°C烘干后得深褐色粗品；所得粗品粉末溶于蒸馏水中，2M HCl调pH值至4. 0，室温下磁力搅拌I小时，离心弃沉淀，再用2M NaOH调上清液pH值至9. 0，离心弃上清液，上述酸溶碱沉淀过程重复三次，最后所得碱沉淀物溶于40ml蒸馏水中，调pH值至4. 0，4°C保存；最后采用硅胶柱(GF254，青岛海洋化工生产，粒度200 260)层析，移动相为以体积比计的丙酮正丁醇水=5:4:1，然后采用pH为4的蒸馏水洗脱，将洗脱液pH值调至9，离心出现沉淀，去上清留沉淀，沉淀物反复按上述酸溶碱沉淀5次，得到的沉淀物即为草麻黄水提物。
4.如权利要求2或3所述作为制备治疗创伤性脑打击的药中应用的草麻黄水提物，其特征在于，其是按如下步骤提取的 草麻黄生药400g，加pH4. O蒸馏水2000ml，60°C过夜，煮沸I小时，过滤除渣；在水相中加入2M NaOH调pH值至9. 0，出现大量沉淀，1500g离心力离心10分钟，弃上清液；加入无水乙醇洗沉淀三次，60°C烘干后得深褐色粗品；所得粗品粉末溶于蒸馏水中，2M HCl调pH值至4. 0，室温下磁力搅拌I小时，离心弃沉淀，再用2M NaOH调上清液pH值至9. 0，离心弃上清液，上述酸溶碱沉淀过程重复三次，最后所得碱沉淀物溶于40ml蒸馏水中，调pH值至4. 0，4°C保存；最后采用硅胶柱(GF254，青岛海洋化工生产，粒度200 260)层析，移动相为以体积比计的丙酮正丁醇水=5:4:1，然后采用pH为4的蒸馏水洗脱，将洗脱液pH值调至9，离心出现沉淀，去上清留沉淀，沉淀物反复按上述酸溶碱沉淀5次，得到的沉淀物即为草麻黄水提物。
全文摘要
草麻黄水提物作为制备治疗创伤性脑打击的药中的应用，开辟了草麻黄这一中草药的一种新用途。草麻黄在我国分布广泛、价廉易得，是中药方剂中的常用药材，本发明在抑制补体激活方面为成功地减轻继发性脑损害提供了广阔的治疗前景，有益于降低脑损伤患者的伤残率和病死率。
文档编号A61P25/00GK102657685SQ20121010163
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者冯华, 刘羞菲, 叶雷, 朱刚, 李飞, 杨康, 陈冬艺, 魏林节 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院, 重庆润泽医疗器械有限公司