专利名称：汉防己甲素在制备癌细胞自噬诱导剂上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及汉防己甲素在制备诱导癌症细胞自噬的诱导剂上的应用。
背景技术：
恶性肿瘤与心血管疾病是导致人类疾病和死亡的两个最大顽疾。恶性肿瘤中肺癌、胃癌、食管癌、肠癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌等在我国是常发性肿瘤，且以肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌最为多见，约占全部恶性肿瘤的70% — 80% ο癌症治疗的传统方法中有放疗、化疗、手术；然而放疗、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也对人体正常细胞有损伤，毒副作用大且造成患者生活质量差、生存率低。因此，筛选高效低毒的抗癌药物一直是癌症治疗的重要研究课题，特别是设计专门针对肿瘤细胞特定信号途径或特定癌细胞靶位点的药物。随着研究者对细胞死亡现象本质的探究，尤其是对细胞凋亡分子机理的阐明，使人们对抗癌药物的筛选及其作用机理有了全新的认识。有目的地诱导肿瘤细胞的凋亡已成为一种治疗肿瘤的有效手段。汉防己甲素(Tetrandrine，分子式C38H42N2O6,分子量 622.75，CAS 号 518-34-3，以下简写为Tet)，又称粉防己碱，是从中草药粉防己的根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱。临床上常用于治疗高血压，肝纤维化和矽肺等疾病。近年来，一些研究表明较高浓度的汉防己甲素可诱导肿瘤细胞凋亡，显示其具有潜在的抗肿瘤活性，如对人白血病细胞株HL-60、人白血病U937细胞、人肝癌细胞Mahlavu、人恶性淋巴瘤BM13674细胞、人神经胶质瘤细胞U138MG、鼠神经母细胞瘤Neuro 2a有抑制肿瘤细胞增生和诱导凋亡的作用；研究结果还表明，汉防己甲素可以通过提高细胞内活性氧水平抑制鼠神经母细胞瘤株生长，诱导其凋亡；在HT-29细胞中汉防己甲素通过PI3K/AKT/GSK3beta途径诱导细胞周期阻滞和凋亡。Tet不仅能直接抑制肿瘤生长，并且具有放疗增敏、逆转耐药、减轻放化疗毒副反应的作用，表明Tet在抗肿瘤治疗中有着良好的临床应用前景。与以往报道不同，在本发明中，体内外实验发现汉防己甲素能在较低浓度下诱导肝癌细胞发生自噬，且有显著的剂量效应和时间依赖关系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了汉防己甲素在制备诱导癌细胞自噬的诱导剂上的应用。所述的癌细胞为肝癌细胞。本发明的实验研究发现，低浓度的(彡5 μ M)汉防己甲素可有效诱导肝癌细胞发生自噬，且有显著的剂量效应和时间依赖关系。
本发明可用于诱导多种肿瘤细胞，不仅限于实例中所列举的肿瘤类型。本发明通过汉防己甲素在低浓度下(彡5μΜ)诱导肝癌细胞BEL-7402、HepG2和Huh7自噬，研究汉防己甲素对肝癌细胞的诱导自噬的能力。本发明采用不同浓度汉防己甲素对肝癌细胞BEL-7402、HepG2和Huh7处理，通过蛋白质杂交和吖啶橙染色，观察不同浓度汉防己甲素对诱导肝癌细胞形成自噬的能力。结果表明，不同浓度的汉防己甲素都能诱导肝癌细胞形成自噬，且呈浓度和时间依赖效应。
图I不同浓度的Tet处理肝癌细胞，Western blot检测细胞凋亡和细胞自噬的标志性蛋白。肝癌细胞Bel7402、Hep G2和Huh7经不同浓度的Tet处理24小时后，Westernblot 检测细胞内 PARP、Caspase-8、Caspase_3、LC3 蛋白。GAPDH 作为内参。图2三种肝癌细胞经5 μ M Tet处理不同时间后，吖啶橙染色并在荧光显微镜下观察。图3统计分析Tet处理不同时间后Bel7402肝癌细胞自噬比例。图4统计分析Tet处理不同时间后!tepG2肝癌细胞自噬比例。图5统计分析Tet处理不同时间后Huh7肝癌细胞自噬比例。图6 Tet处理Bel7402肝癌细胞引起细胞自噬的肿瘤组织电镜照片(标尺为800nm ;处理组箭头自噬溶酶体)。
图7 Tet处理H印G2肝癌细胞引起细胞自噬的肿瘤组织电镜照片(标尺为1300nm;处理组箭头自噬溶酶体)。
图8 Tet处理Huh7肝癌细胞引起细胞自噬的肿瘤组织电镜照片(标尺为800nm;处理组箭头自噬溶酶体)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。所有实施例所用细胞的培养、药品的添加以及癌细胞自噬均按以下方法进行。一、材料
I.细胞株肝癌细胞BEL-7402、HepG2和Huh7等细胞株均购自中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection, CCTCC)。2.试剂DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清和胰酶、乙二胺四乙酸等药品来自GIBCO公司；汉防己甲素、青霉素、链霉素、DMSO、、Sigma公司产品。其余试剂均为国产分析纯。LC3抗体购自sigma公司；细胞色素C, Atg5, Atg7, caspase-3, caspase-8,caspase-9, PARP, phospho-Akt, phospho-ERK, p38 MAPK 和 JNK 等抗体均为 CellSignaling公司产品；吖啶橙、GAPDH抗体为碧云天公司产品；二抗羊抗兔IgG-HRP为Beyotime公司产品；二抗羊抗鼠IgG-HRP为Beyotime公司产品；
3.仪器5% CO2细胞培养箱(ThermoForma，美国)，细胞培养超净工作台(苏净集团安泰公司)，低温超速离心机(Haraeus公司，德国),倒置突光显微镜(Olympus,日本),透射电子显微镜(日立一H 600型)。二、主要试剂配制I)将汉防己甲素用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)配制成1(Γ2Μ储备液,小量分装，一 20 1贮存备用，临用时用相应细胞培养液稀释到所需终浓度。2) 一抗/ 二抗工作液一抗/ 二抗均用封闭液以1:1000比例稀释，4°C保存。3)PBS溶液将购买的PBS粉剂溶于5L三蒸水中，磁力搅拌器混匀，高压蒸汽锅灭菌，4°C保存。4)青霉素/链霉素溶液用PBS将青霉素和链霉素配制成10，000U/mL,用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，_20°C保存。
5) DMEM-高糖细胞培养基DMEM粉剂溶于10L三蒸水中，磁力搅拌器中搅拌0. 5小时后，加入37g NaHCO3，继续搅拌0. 5小时，用稀盐酸将pH值调到7. 04-7. 05，真空泵抽滤除菌。培养细胞DMEM含10%的胎牛血清和1%的青霉素/链霉素。6) 5%牛奶封闭液称取5g的脱脂牛奶溶于IOOmL双蒸水中，磁力搅拌器混匀，分装后-20°C保存。7) TBS 缓冲液(10X) Tris. Base 150g, KCl 10g，NaCl 400g，加双蒸水至 5L，磁力搅拌器搅拌至其完全溶解，用HCl调pH调至7. 4，室温保存。8) TBST缓冲液TBS缓冲液(10X) IOOmL,加双蒸水至1L，再加lmLTween-20，摇匀。9) Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5X) :75. 5g Tris. Base，360g 甘氨酸，5g SDS，加双蒸水至5L，磁力搅拌器搅拌至其完全溶解，过夜，调pH调至8. 3-8. 8，4°C保存。使用时，取IOOmL加双蒸水至1L，摇匀。10)Western blot 转移缓冲液(10X) Tris. Base 151. 5g，甘氨酸 720g,加双蒸水至5L，磁力搅拌器搅拌至其完全溶解，室温存放。使用时，取IOOmL加双蒸水至1L，摇匀。11) Inoue转化缓冲液
①0. 5的PIPES (pH 6. 7)溶液的配置
将15. Ig PIPES溶于80mL三蒸水中。用5M KOH调pH值至6. 7，最后加纯水，定容至100mL。用0. 2 μ m滤膜过滤除菌。分成小份于_20°C保存。② Inoue转化缓冲液的配置
将下列组分溶于800mL纯水中，然后加20mL0. 5M的PIPES (pH 6. 7)，加纯水定容于1L。
表I Inoue转化缓冲液各组分含量
试剂I需要量几I终浓度
MnCla. 4Ha0_10. 88g 55mM
CaCla. 2Ha0~20g 15mM
Fe I18.65g 250mM
FlPES(0. 5M, pH6. 7) 20mL IOmM H^0~I补至 IL
二、实验方法
I.细胞培养细胞按常规培养于含10 %小牛血清的RPMI-1640或DEME培养基(青霉素100 u/ mL，链霉素100 u/ mL)中，置CO2培养箱(37 °C，5 % CO2)中培养。2.选用对数生长期的肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基配成1-5X IO4个/ mL的细胞悬液，接种在24孔培养板中，每孔接种lmL，37°C，5%CO2培养箱中培养24h。
3.实验组换新的含不同浓度被测药品的培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设5平行孔，每孔中药物溶剂(DMS0或水)的体积不超过1%总体积。每个浓度设5个复孔，37°C，5% CO2培养3 5天。
4.细胞总蛋白的提取及定量 I)提取细胞内总蛋白
①收集细胞将细胞进行消化，加到I.5mL离心管中，1600rpm离心4分钟，弃上清；
②冰冷PBS重悬细胞；
③1600rpm离心4分钟,弃上清；
④根据收集细胞量加入一定量1%SDS，沸水浴20分钟；
⑤12000rpm离心10分钟,取上清至新EP管。2)测定蛋白质的浓度(采用BCA测定)
①在酶标板上每孔加入23μ L的灭菌ddH20,然后再加入2 μ L的蛋白样品；同时另取两个孔，加入25 μ L的灭菌ddH20,作为对照；
②配制BCA工作液根据蛋白样品数量，按A液B液=50:1的比例进行配置并充分混
匀；
③每孔加入200μ L配制的BCA工作液，于37°C放置30分钟；
④在酶标仪上，利用570nm的波长测定蛋白样品的OD值；
⑤根据已有的标准曲线计算出每个蛋白样品的浓度；
⑥根据目标浓度进行取样。5. Western blot (蛋白杂交实验)
SDS-PAGE 电泳
1)①配分离胶根据目标蛋白的分子量配置相应浓度的分离胶，加入两玻璃板间。再加入医用酒精至玻璃板顶部。待其凝固后，倒出医用酒精，用滤纸吸干多余酒精；
2)②配浓缩胶按照各成分的量依次加入，混匀，加到玻璃板间，插入梳子，凝固后，移走梳子；
3)③将玻璃板安装到电泳槽中，倒入RunningBuffer ；
4)④上样按照样品的顺序依次加样，蛋白上样量为20μ g，加入3μ L LoadingBuffer ；
5)⑤140V进行电泳；
6)⑥电泳完毕后，关闭电源，将玻璃板上取出，准备转膜。7)蛋白转膜(用半干转膜器进行)
8)①活化PVDF膜将PVDF膜在甲醇中浸泡3分钟；
9)②转膜按从下到上滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序放置；
10)③开启电源，电压18V，转膜30分钟。11) 封闭，杂交
12)①将PVDF膜放入5%的牛奶封闭液中，室温，摇床上缓慢摇动1-2小时；
13)②切PVDF膜根据目标蛋白的分子量切PVDF膜；
14)③将切好的PVDF膜放入相应的一抗中，4°C孵育过夜；
15)④回收一抗，用TBST漂洗膜3次，每次10分钟；16)⑤将漂洗后的膜放入二抗中，室温孵育1-2小时；
17)⑥回收二抗，再用TBST漂洗膜3次，每次10分钟。18)显影
19)①将显色A液、B液等量均匀混合；
20)②把膜放入显色液中，在暗室内使用X胶片感光、显影。6.细胞吖啶橙染色
用无菌镊子将灭菌好的盖玻片加入十二孔板中，加入ImL的培养基，接种适量的细胞，摇匀，待细胞贴壁后，做后续实验。把灭菌的盖玻片放入12孔板孔中，接种上适量的细胞，24小时贴壁后，用药物处理。处理完后，吸走上清，用PBS清洗两遍，加入吖啶橙(终浓度为I μ g/mL)，室温避光孵育20分钟；用PBS清洗两遍，倒扣在载玻片上，在荧光显微镜下观察。7.电镜观察自噬泡
1)样品的制备
①组织取材一2. 5%戊二醛前固定一O. IM磷酸缓冲液漂洗三次一锇酸(1%)后固定一
O.IM磷酸缓冲液漂洗三次，梯度酒精脱水(50%，70%, 80%, 95%，100% 二次)每次15分钟。②环氧树脂包埋
纯丙酮脱水二次(15分钟)一 EP0N812 :丙酮(I :1)浸透30分钟一纯包埋液浸透I小时一纯包埋液固化37°C 24小时后60°C 48小时。③瑞典BROMMA公司产LKB — V型超薄切片机切片一铀、铅染色(醋酸双氧铀，枸橼酸铅)
2)观察
在放大倍数为6000X时，观察细胞全貌；放大倍数为25000X时，观察自噬泡。四、实验结果
实验分对照组(control)、汉防己甲素组(Tetrandrine),采用不同浓度汉防己甲素作用于肝癌细胞株，通过蛋白质杂交试验和吖啶橙染色试验和投射电镜试验检测汉防己甲素诱导癌细胞的自噬作用。实验例l:Western blot检测低浓度汉防己甲素(彡5 μ Μ)处理肝癌细胞Bel7402、HepG2和Huh7引起细胞自噬的影响。较低浓度的汉防己甲素(彡5μΜ)处理肝癌细胞Bel7402、！fepG2和Huh7 24小时后可以显者引起细胞自卩遼。如图I所不，Western blot检测细胞调亡和细胞自卩遼的标志性蛋白，结果发现，0_5μΜ的汉防己甲素处理细胞后，与凋亡相关的蛋白PARP、Caspase-8、Caspase-3蛋白都未发生剪切，而与细胞自噬相关的蛋白LC3_ II表达量明显上调，并且表现出较好的浓度依赖关系。这些结果表明汉防己甲素在较低浓度下可诱导肝癌细胞自噬，而不引发肝癌细胞凋亡。实验例2 :吖啶橙染色实验检测低浓度汉防己甲素(彡5μΜ)处理肝癌细胞Be 17402、HepG2和Huh7引起细胞自噬的影响。为了进一步证实汉防己甲素可诱导肝癌细胞自噬，我们进行了检测细胞自噬的吖啶橙染色实验。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；在自噬后期，在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下，吖啶橙使酸性囊泡显著着色。在荧光显微镜下观察可以看到明亮的红色荧光。用5μΜ的汉防己甲素处理Bel7402、HepG2和Huh7细胞8小时、16小时和24小时，吖啶橙染色后，在荧光显微镜下观察。结果显示，对照组只有极少数着色的自噬细胞，而处理组随着处理时间的延长，三种肝癌细胞内红色荧光点的强度和数量明显增多(图2)，这说明汉防己甲素可诱导细胞自噬。统计分析表明，随时间推移，细胞自噬比例逐渐升高，24小时后三种细胞系的自噬比例都达到90%以上(图 3，4，5)。实验例3 :电镜实验检测低浓度汉防己甲素(彡5μΜ)处理肝癌细胞Bel7402、HepG2和Huh7引起细胞自 噬的影响。电镜观察显示对照组有极少的自噬泡，处理组则出现大量的自噬泡(图6，7，8)。
权利要求
1.汉防己甲素在制备癌细胞自噬诱导剂上的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述的癌细胞为肝癌细胞。
全文摘要
本发明公开了汉防己甲素在制备诱导癌症细胞自噬的诱导剂上的应用。本发明采用不同浓度汉防己甲素对肝癌细胞BEL-7402、HepG2和Huh7处理，通过蛋白质杂交和吖啶橙染色，观察不同浓度汉防己甲素对诱导肝癌细胞形成自噬的能力。结果表明，不同浓度的汉防己甲素都能诱导肝癌细胞形成自噬，且呈浓度和时间依赖效应。
文档编号A61K31/4748GK102631346SQ20121010524
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者刘鑫, 李文化, 梅运军, 陈超, 龚克 申请人:武汉大学