专利名称：乌头枝孢菌xj-ac03及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域,涉及一种新的乌头枝孢菌(C7at/o5/7ori舰S/7.)及其应用。
背景技术：
乌头是我国记载最早的有毒植物，乌头植物全身有毒，属根最毒，其有毒成分主要是二萜类生物碱，乌头引起中毒主要是误食和药用不当。一般来说，本地动物对乌头有识别能力，且乌头对口腔黏膜有刺激作用，不会主动采食，外地引进的动物由于对毒草缺乏判断能力，主动采食而中毒。白喉乌头的主要成分中属乌头碱毒性最大，乌头碱主要是对动物的心血管和神经毒害作用。心血管毒害作用主要为兴奋心脏迷走神经，降低窦房结的自律性和房室结的传导性，引起窦性心动过缓和房室传导阻滞；神经毒性是使中枢神经系统麻痹，使血压下降，运动失灵。虽然乌头碱是有毒成分，但同时也是乌头植物的有效成分。乌头碱是C19 二萜类双酯型生物碱，存在于乌头属植物中，是常用的中药川乌、草乌、附子中的主要有效成分，乌头类中药主要来源于毛莨科植物乌头和北乌头的母根及其侧根的加工品，具有良好的抗肿瘤、抗炎、抗风湿、镇痛作用。然而乌头碱的来源确十分匮乏，价格昂贵，远远不能满足人们的研究和临床医疗需要。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和缺陷，本发明的目的在于提供一种能够有效的合成乌头碱的乌头枝孢菌QCladosporiumsp. )XJ-ACO3,为制备抗肿瘤、抗炎、抗风湿药物提供材料。为实现上述目的，本发明的技术方案如下
一种能够合成乌头碱的枝孢属XJ-AC03 Cladosporium sp. XJ-AC03,以下简称乌头枝孢菌XJ-AC03，于2011年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为=CCTCC NO M2011483，保藏地址中国武汉武汉大学。本发明还有一个目的是提供乌头枝孢菌XJ-AC03在合成乌头碱中的应用。本发明还有一个目的是提供乌头枝孢菌XJ-AC03在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还有一个目的是提供乌头枝孢菌XJ-AC03在制备抗炎药物中的应用。本发明还有一个目的是提供乌头枝孢菌XJ-AC03在制备镇痛药物中的应用。乌头枝孢菌XJ-AC03寄生在白喉乌头根部组织内，建立起共生关系，不会引起白喉乌头的病害，经体外培养发现XJ-AC03能够产生乌头碱，说明其参与着白喉乌头中乌头碱的合成。乌头枝孢菌XJ-AC03菌株经体外培养能够大量繁殖扩增，并能在人工培养的条件下制备抗肿瘤、抗炎、镇痛的乌头碱提供原料。
图I XJ-AC03菌株的菌落形态照片；
图2 XJ-AC03菌株的菌丝显微镜 图3 XJ-AC03菌株的分生孢子显微镜 图4利用MEGA软件构件系统进化树结构 图5乌头碱标准品的高效液相色谱图；
图6 XJ-AC03菌丝提取物的高效液相色谱图。
具体实施例方式以下结合发明人给出的附图和具体试验例及具体实施例来说明本发明乌头枝孢菌XJ-AC03的有益效果和制备方法。实施例I乌头枝孢菌XJ-AC03的分离
I)将采自新疆维吾尔族自治区新源县的那提拉大草原的白喉乌头根部用去离子水将表面的泥沙冲洗干净，进行表面消毒。2)用灭菌滤纸吸去经表面消毒的根部组织上的水分，再将其剪切成5 mmX5mmX5 mm大小的组织块，然后将其接种于PDA固体培养基表面，置20 1培养箱中黑暗培养。3)待组织块边缘有菌丝长出时，挑取菌落边缘的菌丝接种于PDA固体培养基表面，在20 °C培养箱中黑暗培养，直至纯化为单一的菌落；收集培养的真菌菌丝，用有机溶剂提取其生物碱；应用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)对菌丝中提取的生物碱进行检测，检测是否含有乌头碱，筛选得到能够合成乌头碱的乌头枝孢菌XJ-AC03。实施例2枝孢菌XJ-AC03的鉴定 I)形态学特征
如图I、图2、图3所示，该菌株的菌落呈圆形，边缘较规则呈白色；培养初期为乳白色，随着培养时间的推移，菌落逐渐变成灰色至深灰绿色，中央稍突起；此菌株的菌丝体具横隔，无纵隔，比较密集，一些菌丝具分生孢子梗，且分生孢子梗具有分支；分生孢子橄榄形，呈褐色至深褐色，集中分布，(T3个隔膜不等。2)培养学特征
该菌株在PDA固体培养基上生长适中，最适生长温度为20 °C，当温度高于28 °C时生长受到抑制；
所述的PDA固体培养基的组分及配比为马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，121 V高压灭菌30 min。3)分子生物学鉴定
XJ-AC03 菌株 ITS-5. 8S rDNA 序列用 NCBI 中的 Blast 与 Genbank 中的 ITS-5. 8SrDNA序列进行同源性比较，以枝孢菌)菌株序列构建系统进化树。应用ClustalX I. 83 Version 和 MEGA 5. 0 软件米用邻接法(neighbor_johning,NJ)构建系统发育树(图4)，XJ-AC03菌株与枝孢属最近，说明该菌在分子生物学分类上为乌头枝孢菌。根据形态学特征、培养特性、系统发育分析，并结合文献报道，确定该菌为乌头枝孢菌 XJ-AC03。
试验例I乌头枝孢菌XJ-AC03合成乌头碱的试验
将XJ-AC03菌株接种于PDA固体培养基上，置20 °C培养20 d，然后将菌丝刮下，50 V烘干，然后称量菌丝。将干燥的菌丝研磨成粉状后，用滤纸将其包裹好用乙醚提取24 h，将乙醚提取液挥干得到残渣，用二氯甲烷将残渣溶解。用二氯甲烷将乌头碱标准品、XJ-AC03中提取的生物碱溶解，并分别点样于硅胶薄层板上，用薄层色谱检测。若菌丝生物碱经薄层分离后具有与乌头碱标准品的颜色和位移相同的斑点，即可确定其对应的真菌可以合成乌头碱。应用高效液相色谱法检测菌丝中的乌头碱含量，其高效液相色谱图如5、6所示。试验例2乌头枝孢菌XJ-AC03合成乌头碱的抗肿瘤试验
采用四氮哇溴盐(MTT)还原法测定从白喉乌头根部分离的内生真菌所产乌头碱对肿瘤细胞的抑制作用。细胞株为人前列腺癌(PC-3)，作用时间72 h。将肿瘤细胞接种于细胞培养板内，37 V，5%的CO2培养箱中培养，等待细胞贴壁后，在每孔加入不同浓度10_4、10_5、10_6、10' 10_8 mo I/L的乌头碱。阴性对照组加入等体积RPMI 1640完全培养液，并且设置空 白调零孔(只加入完全培养液，不加入细胞)，每一组均设有4个平行孔，在37 °C, 5% 0)2的条件下在培养箱中分别培养72 h，实验终止前4 h再加入5 mg/mL的MTT储存液10 u L，混匀后再继续培养4 h,除去上清液，每孔再加入150 ii L的DMS0，振荡10 min，用酶标仪测定波长为492 nm时每个孔的OD值，求出细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%):(对照组平均OD值一实验组平均OD值)/对照组平均OD值X 100%,结果评定细胞生长抑制率(%)彡50%有效。结果表明浓度为10_4mol/L乌头碱对PC-3细胞生长抑制率(%) = 72.9%，说明乌头碱具有一定抗肿瘤效果。试验例3乌头枝孢菌XJ-AC03合成乌头碱的抗炎试验
将20只体重18 20 g的昆明种小鼠，按体重随机分为2组凡士林空白组和乌头碱
药物组。用乙醚麻醉，在小鼠右耳的前后两面涂布100%二甲苯致炎液，0. 02 mL/只，30 min
后，分别在小鼠右耳炎症部位涂空白对照组和乌头碱药物组等量，剂量0. 06 mg/只，左耳不
做任何处理。4 h后颈椎脱白处死小鼠，立即剪下双耳，用8 mm打孔，以右耳片重量减去左
耳片重量为肿胀度，(右耳重一左耳重)/左耳重为肿胀率，以(对照组平均肿胀度一给药组
平均肿胀度)/模型组平均肿胀度为肿胀抑制率。如下表(ri=10，i±s，* P < 0. 01):
权利要求
1.乌头枝孢菌(C7at/o5T7oriw sp. ) XJ-ACO3，保藏号为 CCTCC NO :M2011483。
2.权利要求I所述的乌头枝孢菌(C7a￡/o5T7oriw sp. ) XJ-AC03在合成乌头碱中的应用。
3.权利要求I所述的乌头枝孢菌(C7a￡/o5T7oriw sp. ) XJ-AC03在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.权利要求I所述的乌头枝孢菌(C7a￡/o5T7oriw sp. ) XJ-AC03在制备抗炎药物中的应用。
5.权利要求I所述的乌头枝孢菌sp.)XJ-AC03在制备镇痛药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了乌头枝孢属真菌XJ-AC03，于2011年12月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCCNOM2011483。该菌株的菌落呈圆形，边缘较规则呈白色；培养初期为乳白色，随着培养时间的推移，菌落逐渐变成灰色至深灰绿色，中央稍突起；此菌株的菌丝体具横隔，无纵隔，比较密集，一些菌丝具分生孢子梗，且分生孢子梗具有分支；分生孢子橄榄形，呈褐色至深褐色，集中分布，0~3个隔膜不等。该菌株从新疆白喉乌头的根部中经人工分离、筛选而得到的，能够有效的合成乌头碱的乌头枝孢菌(Cladosporiumsp.)XJ-AC03，为制备抗肿瘤、抗炎、抗风湿药物提供材料。
文档编号A61P19/02GK102703327SQ20121010559
公开日2012年10月3日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年2月4日
发明者夏爽, 孔祥雅, 李勤凡, 杨凯, 梁洁 申请人:西北农林科技大学