包含皂苷佐剂的疫苗组合物的制作方法

专利名称：包含皂苷佐剂的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及改进的疫苗组合物、制备它们的方法，以及它们在医学中的用途。具体地，本发明涉及含佐剂的疫苗组合物，其中所述佐剂是脂质体制剂，包含皂苷和脂多糖。本发明进ー步涉及流感疫苗制剂和用于进行抗流感疾病免疫的免疫方案。
背景技术：
总是需要具有改进的免疫原性的新组合物或疫苗。作为ー种策略，已经用佐剂尝试和改进针对任何给定抗原产生的免疫应答。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的外小叶的主要表面分子，并且只存在于所述外小叶中。LPS通过血清补体和吞噬细胞阻止细菌破坏，并且參与用于集群的粘附。LPS是ー组结构上相关的复杂分子，大小是大约10，000道尔顿，并且由三个共价连接的区域组成⑴外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)(ii)核心寡糖中心区(iii)最内部的区域，其作为疏水性锚，包含携带长链脂肪酸的糖胺ニ糖单元。已经证明LPS的生物活性，例如致死毒性、致热性和佐剂性，与脂质A部分相关。相反，免疫原性与O-特异性多糖成分(O-抗原)相关。长期以来，已知LPS和脂质A都具有强佐剂作用，但这些分子的高毒性排除了将它们用于疫苗制剂。因此，为了減少LPS或脂质A的毒性而保持它们的佐剂性，进行了显著努力。1966年，从亲本(光滑)菌株的培养物分离了明尼苏达沙门氏菌突变体R595 (Luderitz 等，1966Ann. N. Y Acad. ScL 133 :349-374)。筛选了选择的菌落对一组噬菌体的裂解的易感性，仅仅选择了展示出窄范围敏感性(仅仅对ー种或两种噬菌体易感)的那些菌落进行进ー步研究。该努力导致分离了深粗糙(deep rough)突变菌株,其是LPS生物合成缺陷的，并且称作明尼苏达沙门氏菌R595。与其它LPS相比，由突变体明尼苏达沙门氏菌R595产生的那些具有相对简单的结构。(i)它们不含O-特异性区-这是导致从野生型光滑表型转变为突变的粗造表型并且导致失去毒力的特征(ii)核心区非常短-该特征增加菌株对多种化学物质的易感性(iii)脂质A部分由最多7个脂肪酸进行高度酰化。4'-单磷酰脂质A(MPL)可以通过从革兰氏阴性细菌的深粗糙突变株提取的LPS的酸水解获得，其保留LPS的佐剂特性，同时证明毒性减少超过1000的因数(由鸡胚卵中的致死剂量测量)(Johnson 等，1987Rev. Infect. Dis. 9Suppl :S512_S516)。LPS 典型地在、中等强度的无机酸溶液(如O. IM HCl)中回流大约30分钟。该过程导致在I位的去磷酸化，和在6’位的去糖化，产生MPL。3-0-脱酰基单磷酰脂质A(3D_MPL)可以通过MPL的温和碱水解获得，其具有进ー步减少的毒性，同时也保持佐剂性。參见US4, 912, 094(Ribi Immunochemicals)。碱水解典型地在有机溶剤,如氯仿/甲醇的混合物中通过用弱碱水溶液,如pH 10. 5的O. 5M碳酸钠饱和而进行。
关于制备3D-MPL的进ー步信息可以从例如US4, 912，094和W002/078637 (CorixaCorporation)犹得。阜苷是从阜树(Quillaja saponaria)的树皮提取的三職糖苷。粗阜苷已经广泛用作兽医佐剂。Quil-A是皂苷材料的ー种部分纯化的水性提取物。QS21是Quil A的Hplc纯化的无毒级分，其制备方法(作为QA21)公开于美国专利No. 5，057，540。举例说明，已经开发了具有佐剂的流感疫苗和抗人乳头瘤病毒(HPV)的疫苗。流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人类，也可感染家畜。流感产生重大的经济负担、发病率乃至死亡率。流感病毒是RNA包膜病毒，颗粒的直径大小约为125nm。流感病毒的基本组成为内部为与核蛋白缔合的核糖核酸(RNA)核衣壳或核心，其包绕着脂质双层结构和外层糖蛋白的病毒包膜。病毒包膜内层主要由基质蛋白组成，而外层主要是宿主来源的脂类物质。流感病毒包含两种表面抗原糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)，它们以10-12nm长的刺突显露在颗粒表面上。就是这些表面蛋白、尤其是血细胞凝集素，决定了流感亚型的抗原特异性。这些表面抗原渐进地、有时快速地经历某些导致流感病毒抗原性变异的改变。这些抗原性改变称为‘漂移’和‘转换’，是不可预见的，由免疫学观点看可能具有显著的影响，因为它们最终导致出现新流感株，能使病毒逃逸免疫系统，几乎毎年都引起众所周知的流行病。每个季节加入到流感疫苗中的流感病毒株由WHO协同国家卫生管理局以及疫苗生产商共同确定。HA是确定不同流感株的血清学特异性的最重要的抗原。此75_80kD的蛋白包含众多的抗原决定簇，其中几个位于在不同毒株中经历序列改变的区域中(毒株特异性决定簇)，其余的位于许多HA分子共有的区域中(决定簇所共有的)。流感病毒几乎毎年冬天都引起流行，甲型或こ型病毒的感染率在6周的时间段内高达40%。流感感染产生各种疾病状态，由亚临床感染至轻微的上呼吸道感染到严重的病毒性肺炎。典型的流感流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率増加，证据是住院率或死亡率增加。疾病的严重性主要由宿主的年龄、其免疫状况和感染部位决定。65岁和以上的老年人尤其易受攻击，占发达国家所有流感相关死亡的80-90%。患有基础性慢性疾病的个体也非常有可能经历这种并发症。幼儿也可能患严重疾病。因此，这些群体尤其需要受保护。除了这些‘风险’群体以外，卫生当局还推荐对与老年人接触的健康成人接种。接种对控制毎年的流感流行起关键作用。目前可用的流感疫苗是灭活的流感疫苗或减毒活流感疫苗。灭活的流感疫苗包括3种可能形式的抗原制剂灭活的全病毒、纯化的病毒颗粒被去污剂或其它试剂破坏以溶解脂质包膜的亚病毒体(所谓的“分裂(split)疫苗”)或纯化的HA或NA(亚单位疫苗)。这些灭活的疫苗肌内(i.m.)或鼻内(i. η.)施用。所有种类的流感疫苗通常都是三价疫苗。一般来说，它们含有的抗原得自两种甲型流感病毒株和一种こ型流感病毒株。据单辐射免疫扩散(SRD) (J. Μ. Wood等An improved single radial immunodifiusion tecnnique ior the assay 01influenza haemaggiutinin antigen :adaptation for potency determination ofinactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5(1977)237-247 ；J.M.Wood 等，International collaborative study of single radial diffusion andImmunoelectrophoresis techniques for the assay of haemaggiutinin antigen ofinfluenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)的检测，在大多数情况下，标准 O. 5ml注射剂量含有每种毒株的15 μ g血细胞凝集素抗原组分。目前可用的流感疫苗被认为在所有年龄组都是安全的(De Donato等，1999，Vaccine, 17，3094-3101)。但是，很少有证据表明当前的流感疫苗在2岁以下的儿童中有作用。而且，预防典型的已确认流感疾病的疫苗的报告有效率对老年人为23-72%，这显著低于对较年轻成年人所报告的60-90%的有效率(Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc,21，166-1665 ;Gross，1995，Ann Intern. Med. 123，523-527)。业已表明，流感疫苗的有效性与针对病毒株的血凝反应抑制(HI)抗体的血清滴度相关，几个研究已发现较年长的成年人在流感免疫后表现出的HI滴度低于较年轻成年人(Murasko, 2002, Experimentalgerontology,37,427-439)。因此，仍需要具有改善的免疫原性的新疫苗。疫苗抗原和有效佐剂的制剂是ー种有可能增强对亚病毒体抗原的免疫应答的方法。用水包油乳液形式的佐剂MF59作为佐剂的亚单位流感疫苗已商品化，已证明其诱导高于无佐剂亚单位疫苗所获抗体滴度的抗体滴度的能力(De Donato等，1999,Vaccine，17，3094-3101)。但是，在后来的出版物中，相同疫苗没有表现出其相比无佐剂分裂疫苗改善的谱(Puig-Barbera 等，2004，Vaccine 23，283-289)。作为背景，在大流行之间的时间段内，与之前流行的流感病毒相关的流感病毒传播。病毒以和生命早期感染不同的免疫水平在人之间传播。在通常2-3年的时间段内，这种传播促进对已改变得足以在一般群体中再引起流行的新毒株的选择；此过程称为‘抗原性漂移’。‘漂移变体’在任一年中在不同的社区、地区、国家或洲都具有不同影响，尽管在几年内其总体影响经常是相似的。换句话说，当出现人群对其没有免疫性的新流感病毒吋，发生流感大流行。典型的流感流行引起肺炎和下呼吸道疾病的发病率増加，证据是住院率或死亡率増加。老年人或患有基础性慢性疾病的人最有可能经历此并发症，而幼儿也可能患严重疾病。新流感病毒以不可预见的间隔出现，其具有与之前季节流行的毒株完全不同亚型的关键表面抗原，即血细胞凝集素。此时，产生的抗原可以先前在人体中循环的毒株的对应蛋白的20%至50%变化。这可导致病毒逃逸‘群体免疫’，并建立大流行。此现象叫做‘抗原性转变’。一般认为，至少在过去已发生了大流行，当时不同物种的流感病毒如禽或猪流感病毒已穿过种间屏障。如果这些病毒具有人与人之间传播的潜力，它们可在数月至一年内全球扩散，导致大流行。例如，在1957年(亚洲流感大流行)，H2N2亚型取代了 HlNl病、毒，HlNl病毒至少从首先分离到该病毒的1918年开始就在人群中循环。H2HA和N2NA在1957年至1968年之间经历了抗原漂移，直至HA在1968年(香港流感大流行)被出现的H3N2流感病毒亚型替代，此后N2NA连同H3HA继续漂移(Nakajima等，1991，Epidemiol.Infect. 106,383-395)。给予流感病毒株引起大流行爆发潜カ的流感病毒株特征是与当前循环株中的血细胞凝集素相比其包含新血细胞凝集素，其可伴有或不伴有神经氨酸酶亚型的改变；其能够在人群中水平传播；其对人是致病的。新血细胞凝集素可为长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显的血细胞凝集素，例如H2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血细胞凝集素，例如存在于鸟类中的H5、H9、H7或H6。在任一种情况下，大部分或至少大比例的乃至整个群体以前都没有遇到抗原，在免疫学上对抗原是原初态的。乳头瘤病毒是小DNA肿瘤病毒，是高度物种特异性的。迄今为止已描述了 100多 种独立的人乳头瘤病毒(HPV)基因型。一般来说，HPV对皮肤(例如HPV-I和HPV-2)或粘膜表面(例如HPV-6和HPV-11)是特异性的，通常引起持续数月或数年的良性肿瘤(疣)。这种良性肿瘤可困扰所涉及的个体，但趋向于无生命威胁，有ー些例外。ー些HPV还与癌症相关。HPV和人类癌症之间最强的正相关是HPV-16和HPV-18与宫颈癌之间存在的正相关。宫颈癌是发展中国家最常见的恶性肿瘤，在全世界毎年发生约500，000例新病例。现在，使用疫苗主动对抗原发性HPV-16感染乃至已确诊的含HPV-16的癌症在技术上是可行的。关于抗HPV-16的预防性和治疗性接种的前景的综述，參见CasonJ. , Clin. Immunother. 1994 ;I (4)293-306 和 HageneseeM. E. , Infections in Medicine199714 (7)555-556，559-564。尽管确实存在微小差异，但所描述的所有HPV基因组都具有至少8个早期基因，即El至ES和2个晚期基因，即LI和L2。另外，上游调节区具有调节序列，该调节序列似乎控制HPV基因组的大部分转录事件。基于HPV LI 的疫苗公开于 W094/00152、W094/20137、W093/02184 和 W094/05792。此疫苗可包含为单体、壳粒或病毒样颗粒的LI抗原。制备VLP的方法在本领域众所周知，包括VLP分解-再组装法，以提供增强的均一性，例如W09913056和US6245568所述。这种颗粒可另外包含L2蛋白。基于L2的疫苗描述于例如W093/00436。其它HPV疫苗方法基于早期蛋白，例如E7或诸如L2-E7的融合蛋白。仍需要改进的疫苗，特别是在流感的情况下，特别是流感大流行，以及对于老年人群，或在HPV疫苗的情况下。以前已经公开了含有脂多糖和皂苷的组合的佐剂，例如，在EP0671948中。该专利证明了当脂多糖(3D-MPL)与皂苷(QS21)组合时的强协同作用。目前已经发现在佐剂组合物中采用脂多糖和皂苷的组合作为免疫刺激剤，可以实现良好的佐剂特性，甚至当免疫刺激剂在人类剂量中以小量存在时也是如此。

发明内容
在本发明的第一方面，提供了免疫原性组合物，其包含与佐剂组合物组合的抗原或其抗原性制剂，所述佐剂组合物包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美阜皮树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮并以脂质体形式存在。
在本发明的第二方面，提供了免疫原性组合物，其包含与皂苷佐剂组合的流感病毒或其抗原性制剂，所述皂苷佐剂以脂质体形式存在。在该方面的ー种特定实施方案中，所述免疫原性组合物进ー步包含脂质A衍生物，如3D-MPL。适当地，本发明的脂质体形式的皂苷佐剂包含来源于南美皂皮树的树皮的皂苷的活性级分,如QS21和甾醇，如胆固醇，其中皂苷甾醇的比是I : 1-1 100w/w。具体地,所述免疫原性组合物包含具有CD4T细胞表位的抗原。或者,所述免疫原性组合物包含具有B细胞表位的抗原。本发明也涉及流感病毒或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防流感病毒感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。本发明也涉及人乳头瘤病毒抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防人乳头瘤病毒感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。本发明也涉及巨细胞病毒抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防巨细胞病毒感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。本发明也涉及肺炎链球菌抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防肺炎链球菌感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。本发明也涉及恶性疟原虫抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防恶性疟原虫感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。本发明也涉及水痘-帯状疱疹病毒抗原或其抗原性制剂和佐剂在制备用于预防水痘-帯状疱疹病毒感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述佐剂包含免疫活性的皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在。另ー方面，提供了(a)抗原或其抗原性制剂和(b)上文定义的佐剂在制备用于在人类中诱导以下至少ー种或至少两种或全部效果的免疫原性组合物中的用途(i)改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的CD4T-细胞免疫应答，(ii)改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的体液免疫应答，(iii)改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的B-记忆细胞应答。具体地，所述抗原是流感病毒、HPV、巨细胞病毒(CMV)、水痘-帯状疱疹病毒(VZV)、肺炎链球菌或疟疾抗原或其抗原性制剂，并且所述人是免疫受损的个体或群体，例如高危成人、老年人或婴儿。在ー种特定实施方案中，提供了本文定义的抗原或其抗原性制剂在制备用于人类，特别是老年人抗病原体接种的免疫原性组合物中的用途，其中免疫组合物中的抗原来源于所述病原体。特别地，所述抗原是流感病毒、人乳头瘤病毒、巨细胞病毒、水痘-帯状疱疹病毒、肺炎链球菌、疟原虫寄生虫抗原或其抗原性制剂。也提供了接种方法，包括给有需要的个体或群体送递抗原或抗原性组合物，特别是流感病毒或HPV、巨细胞病毒、水痘-帯状疱疹病毒、肺炎链球菌、疟原虫寄生虫或其抗原 性制剂和上文定义的佐剂。在ー种特定实施方案中，与用不包含佐剂的抗原或抗原性组合物所获得的免疫应答相比，所述免疫原性组合物能够诱导改进的抗所述抗原或其抗原性制剂的CD4 T-细胞免疫应答，特别地，进ー步能够诱导体液免疫应答或改进的B-记忆细胞应答，或这两者。特别地，所述CD4 T-细胞免疫应答涉及诱导交叉反应性CD4T辅助细胞应答。特别地，所述体液免疫应答涉及诱导交叉反应性体液免疫应答。在进ー步的实施方案中，提供了上文定义的方法或用途，用于提供抗病原体导致的感染或疾病的保护作用，所述病原体是免疫原性组合物中的抗原所来源的病原体的变体。在另ー实施方案中，提供了上文定义的方法或用途，用于提供抗病原体导致的感染或疾病的保护作用，所述病原体包含抗原，所述抗原是免疫原性组合物中的抗原的变体。在ー种 特定实施方案中，提供了抗原，特别是流感病毒或HPV或其免疫原性制剂在制备用于以前用包含抗原的免疫原性组合物接种的人的再次接种的免疫原性组合物中的用途，所述抗原特别是流感病毒或HPV或其抗原性制剂，其与本文描述的佐剂组合。在ー种特定实施方案中，用于再次接种的组合物可以额外包含佐剂。在另ー特定实施方案中，用于再次接种的免疫原性组合物包含抗原，所述抗原与用于前一次接种的抗原或抗原性组合物具有共同的⑶4 T-细胞表位。特别地，用于再次接种的免疫原性组合物包含流感病毒或其抗原性制剂，其与用于第一次接种的流感病毒或其病毒抗原性制剂具有共同的CD4T-细胞表位。一方面，对已经在上一季进行了抗流感接种的受试者中进行再次接种。典型地，在第一次接种后至少6个月，优选在第一次接种后8-14个月，更优选在第一次接种后大约10-12个月进行再次接种。另一方面，在已经用包含流感病毒或其抗原性制剂的组合物接种的受试者中进行再次接种，其中至少ー种病毒株与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的可能。在本发明的进ー步的实施方案中，提供了来自第一流感病毒株的流感病毒或其抗原性制剂在制备本文定义的用于提供抗流感感染的保护作用的免疫原性组合物中的用途，所述流感感染由变异的流感病毒株导致。本发明也涉及接种方法，包括送递流感病毒或其抗原性制剂和本文定义的佐剂。另ー方面，提供了对免疫受损的人类个体或群体，例如高危成人或老年人进行接种的方法，包括施用包含与本文定义的佐剂组合的流感病毒或其抗原性制剂的流感免疫原性组合物。在另ー实施方案中，本发明提供了对以前用流感免疫原性组合物接种过的人进行再次接种的方法，所述组合物包含与本文定义的佐剂组合的、来自至少ー种流感病毒株的流感病毒抗原或其抗原性制剂，所述方法包括给所述人施用含有佐剂或不含佐剂的免疫原性组合物，所述组合物包含流感病毒或其抗原性制剂。本发明也涉及用于制备免疫原性组合物的方法，包括将脂质体形式的皂苷佐剂与流感病毒或其抗原性制剂组合，任选与3D-MPL组合。在以下优选实施方案的详述中进ー步描述本发明的其它方面和优点。


图1:MPL制备的图示。图2 :在用实验制剂免疫雪貂后抗各种流感病毒株的体液应答异源初免(H1N1A/斯德哥尔摩/24/90)之前和之后，免疫后(H1N1A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97)以及异源攻击后(H3N2A/怀俄明/3/2003)的血细胞凝集素抑制测试(GMT+/-IC95)。图3 :雪貂研究攻击后(第42天)鼻洗液中的病毒滴度。图4 :小鼠研究用实验制剂免疫小鼠后抗三种流感疫苗株的体液应答免疫(H1N1A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/怀俄明/3/2003和B/江苏/10/2003)后21天的血细胞凝集素抑制测试(GMT+/-IC95)。图5 :小鼠研究细胞介导的免疫应答免疫后第7天的流感特异性CD4+T细胞应答。图6 :小鼠研究⑶4的CMI-合并的病毒株(都加倍)-第O天和第21天。图7 :第O天和21天时HI抗体的GMTs。图8 :用含有佐剂的流感病毒制剂免疫后，在7天随访阶段期间报道的人局部和全身症状的发生率(总数和第3级相关的)，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。图9 :用含佐剂的HPV制剂免疫后，小鼠中对HPV 16和18L1的体液应答，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。图10 :小鼠中的细胞介导的免疫应答细胞内细胞因子染色-用含佐剂的HPV制剂免疫后的VLP 16和18CD4+T细胞，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。图11 :用含佐剂的HPV制剂免疫后产生特异性B记忆细胞，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。图12 :小鼠中含有佐剂的肺炎链球菌疫苗的临床前比较，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。图13 :用含有佐剂的Gb疫苗免疫后的豚鼠抗_gB ELISA滴度，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。图14 :用含有佐剂的Gb疫苗免疫后的豚鼠抗CMV中和滴度，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。图15 :用含有佐剂的gB疫苗免疫后的小鼠抗_gB ELISA滴度。图16 :用含有佐剂的gB疫苗免疫后的小鼠抗CMV中和滴度。图17 :小鼠研究细胞介导的免疫-用gB肽的合并物再刺激后的CMV特异性CD4+和CD8+细胞(第二次免疫后7天)。图18 :小鼠研究细胞介导的免疫-用两种不同剂量的gB肽的合并物再刺激后的CMV特异性CD4+细胞(第二次免疫后21天)。图19 :小鼠研究细胞介导的免疫-用两种不同剂量的gB肽的合并物再刺激后的CMV特异性CD8+细胞(第二次免疫后21天)。图20 :在小鼠中用含有佐剂的RTS，S疫苗免疫后抗子孢子蛋白CSP的几何平均抗体滴度(GMT)，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
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图21 :在小鼠中用含有佐剂的RTS，S疫苗免疫后抗こ型肝炎表面抗原(HBs)的几何平均抗体滴度(GMT)，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。图22 :用含有佐剂的RTS，S免疫原性组合物免疫后，CSP特异性⑶4和⑶8T细胞的IL-2和/或IFNy离体表达，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。
图23 :用含有佐剂的RTS，S免疫原性组合物免疫后，HBs特异性⑶4和⑶8T细胞的IL-2和/或IFNy离体表达，比较具有两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂。图24 :用含有佐剂的三价分裂流感疫苗(A/新喀里多尼亚，A/怀俄明，B/江苏)免疫后小鼠中的体液应答，两种不同浓度的免疫刺激剤。图25 :用含有佐剂的三价流感疫苗(A/新喀里多尼亚，A/怀俄明，B/江苏)免疫后小鼠中的细胞介导的免疫应答，两种不同浓度的免疫刺激剂。图26 :小鼠中比较以ASOlB或ASOlE为佐剂的VZV gE疫苗的临床前結果。图27 :用流感病毒抗原初免和攻击后的鼻洗液病毒滴度-在雪貂中用普通的或以包含两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂组合物为佐剂的A/新喀里多尼亚、A/怀俄明、B/江苏免疫。
图28 :用流感抗原初免和攻击后在雪貂中监测体温。用普通的或以包含两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂组合物为佐剂的A/新喀里多尼亚、A/怀俄明、B/江苏免疫。图29 :用流感抗原制剂免疫和攻击后三价疫苗制剂中A株的抗HI滴度。用普通的或以包含两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂组合物为佐剂的A/新喀里多尼亚、A/怀俄明、B/江苏免疫。图30 :用流感抗原制剂免疫和攻击后用于攻击的B/江苏和漂移株的抗HI滴度，用普通的或以包含两种不同浓度的免疫刺激剂的佐剂组合物为佐剂的A/新喀里多尼亚、A/怀俄明、B/江苏免疫。
具体实施例方式本发明人发现，包含以脂质体形式存在的皂苷和脂多糖的佐剂组合物(其中每种免疫刺激剂以30 μ g或低于30 μ g/人类剂量的水平存在)可以改进对抗原性制剂的免疫应答，而同时比ー些现有技术的制剂具有更低的反应原性，在所述现有技术制剂中，免疫刺激剂以每个人类剂量更高水平存在。本发明人进ー步发现，包含流感病毒或其抗原性制剂以及佐剂(包含以脂质体形式存在的皂苷)并且任选额外包含脂质A衍生物如3D-MPL的流感制剂与用不含佐剂的病毒或其抗原性制剂获得的制剂相比，能够改进抗所述抗原或抗原性组合物的CD4 T-细胞免疫应答。以脂质体形式的皂苷作为佐剂的制剂有利地用于诱导能够检测II类MHC分子呈递的流感病毒表位。本申请人发现，其有效靶定细胞介导的免疫系统，以便(在接种和感染后)増加针对同源和漂移流感病毒株的反应性。本发明的ー种特定实施方案是，用于本发明的组合物在再次接种后能够在人类中提供更好的抗流感的血清保护作用，这是通过满足流感相关保护作用的人类受试者数目评估的。此外，另ー特定实施方案是与不含佐剂的组合物相比，用于本发明的组合物在首次接种人类受试者后也能够诱导更高的B细胞记忆应答，并且在再次接种后能够诱导更高的体液应答。本发明的含有佐剂的组合物具有一些优点I)改进的免疫原性它们使得能够在老年人(超过50岁，典型地超过65岁)中的弱免疫应答恢复到年轻人中观察到的水平(抗体和/或T细胞应答)；2)改进的交叉保护谱増加的抗变异(漂移)流感病毒株的交叉保护作用；
3它们也允许用減少的抗原剂量来得到相似的应答，从而确保在紧急情况(例如大流行)时增加的能力。在本发明的另一方面，发明人发现，本文定义的佐剂组合物证明了抗体产生和接种后流感特异性CD4频率的免疫原性结果等于或有时大于用不含佐剂的疫苗产生的結果。这种作用在老年群体中特别有价值，并且可以用本文定义的含有较低剂量免疫刺激剂的佐剂实现。此外，反应原性症状显示以下趋势在接受以最高浓度的免疫刺激剂为佐剂的疫苗的组中比接受以较低浓度免疫刺激剂为佐剂的疫苗的组中更高。 这些发现可以适用 于其它形式的相同抗原和其它抗原。皂苷佐剂本发明的佐剂组合物包含以脂质体形式存在的皂苷佐剂。特别适用于本发明的皂苷是Quil A及其衍生物。Quil A是ー种从南美洲的树木-南美皂皮树分离的皂苷制剂，并且在1974年由Dalsgaard等人首先描述(“Saponinadjuvantsへ Archiv. fiir die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag,Berlin，p243-254)具有佐剂活性。已经通过HPLC分离了 Quil A的纯化片段，其保留佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性(EP 0362278)，所述片段例如QS7和QS21(也称作QA7和QA21)。QS-21是ー种来源于南美皂皮树的树皮的天然皂苷，其诱导⑶8+毒性T细胞(CTLs)、Thl细胞和占优势的IgG2a抗体应答，并且是本发明的优选皂苷。在本发明的一种合适的形式中，免疫原性组合物中的皂苷佐剂是南美皂皮树QuiIA的衍生物，优选是Quil A的免疫活性级分，例如QS-17或QS-21，合适地是QS-21。在ー种实施方案中，本发明的组合物含有基本纯的形式的免疫活性皂苷级分。优选地，本发明的组合物含有基本纯的形式的QS21，也就是说，QS21是至少90%纯的，例如，至少95%纯或至少98%纯。在ー种特定实施方案中，QS21是在其反应原性较低的组合物中提供的，其中用外源留醇，例如胆固醇对其进行猝灭。存在ー些特定形式的反应原性较低的组合物，其中用外源胆固醇猝灭QS21。在ー种特定实施方案中，皂苷/留醇是脂质体结构的形式(W096/33739，实施例I)。在该实施方案中，脂质体合适地含有中性脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温下合适地是非晶体，所述磷脂酰胆碱例如卵黄磷脂酰胆碱、ニ油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰磷脂酰胆碱。脂质体也可以含有带电脂质，其増加用于饱和脂质组成的脂质体的脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情况下，带电脂质的量合适地是1-20% w/w，优选5-10%。甾醇与磷脂的比例是1-50% (mol/mol)，合适地是20-25%。合适的留醇包括谷留醇、豆留醇、麦角留醇、麦角钙化留醇和胆固醇。在ー种特定实施方案中，佐剂组合物包含胆固醇作为留醇。这些留醇是本领域已知的，例如，胆固醇在Merck Index，第11版，第341页中描述为动物脂肪中存在的天然甾醇。本发明的包含QS21和留醇，特别是胆固醇的佐剂组合物，与不存在留醇的组合物相比，显示出減少的反应原性，同时保持佐剂作用。可以根据WO 96/33739中公开的方法评估反应原性研究。本发明的留醇表示外源留醇，即，并非是抗原性制剂所来源的生物体内源的甾醇而是加入到抗原制剂中或随后在配制时加入的。典型地，通过利用例如留醇猝灭形式的皂苷，可以在随后用皂苷佐剂配制抗原制剂过程中加入甾醇。合适地，如WO 96/33739中的描述，外源留醇与皂苷佐剂缔合。
当活性皂苷级分是QS21时，QS21 :甾醇的比例典型地将是I 100-1 I (w/w)的数量级，合适地是I : 10-1 : I (w/w),优选是I : 5-1 I (w/w)。存在合适过量的甾醇，QS21 甾醇的比例是至少I : 2 (w/w)。在一种实施方案中，QS21 甾醇的比例是I : 5 (w/W)。留醇合适地是胆固醇。其它有用的阜苷来源于植物-欧洲七叶树或Gyophilla struthium。描述于文献中的其它皂苷包括七叶素，其描述于Merck index (12版条目3737)，其是存在于七叶树(拉丁文是Aesculus hippocastanum)的种子中的阜苷混合物。描述其分离是通过色谱和纯化(Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)),以及通过离子交换树脂(Erbring等，US 3,238,190)。已经纯化了七叶素的级分，并且显示是生物活性的(Yoshikawa M等，(Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996Aug ；44 (8) :1454-1464))。已经针对例如 ISCOM 生产，描述了来自 Gypsophilla struthium 的 Sapoalbin(R. Vochten 等，，1968, J. Pharm. Belg. ,42,213-226)。 本发明的关键方面是以下事实免疫活性皂苷，优选QS21，可以以比以前认为有用的量更低的量使用，合适地是低于30 μ g，例如1-30 μ g/人类剂量的免疫原性组合物。因此，本发明提供了人类剂量的免疫原性组合物，其中包含免疫活性皂苷，优选QS21，其水平是30μ g或更低，例如1-30 μ g。在一种实施方案中，免疫原性组合物的体积适于人类剂量，所述人类剂量的免疫组合物包含QS21，其水平是大约25 μ g,例如20-30 μ g,合适地是21-29 μ g或22-28 μ g或23-27 μ g或24-26 μ g，或25 μ g。在另ー实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含QS21，其水平是大约10 μ g，例如5-15 μ g，合适地是6-14 μ g，例如7-13μ g或8-12μ g或
9-11 μ g,.或 10μ g。在进ー步的实施方案中，人类剂量的免疫组合物包含QS21，其水平是大约5 μ g，例如1-9 μ g，或2-8 μ g,或合适地是3-7 μ g或4-6 μ g，或5 μ g。QS21 的合适量是例如以下任一量1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，μ g (w/v) / 人类剂量的免疫原性组合物。术语“人类剂量”表示具有适于人类使用的体积的剂量。通常是0.3_1.5ml。在一种实施方案中，人类剂量是O. 5ml。在进ー步的实施方案中，人类剂量是高于O. 5ml，例如0.6，0.7，0.8，0.9或11111。在进ー步的实施方案中，人类剂量是lml-1. 5ml。本发明的特征在于每个人类剂量含有30 μ g或更少，例如1-30 μ g的QS21。本发明进ー步提供了包含30yg或更少，例如l-30yg的QS21的佐剂组合物。典型地，所述佐剂组合物将是人类剂量合适的体积。当佐剂是要与液体形式的抗原组合物进行组合的液体形式时，佐剂组合物将是人类剂量合适的体积，其大约是人类剂量的目标终体积的大约一半，例如，对于O. 7ml的目标人类剂量，其是360 μ I体积，对于0. 5ml的目标人类剂量，其是250 μ I体积。当与抗原组合物组合时，佐剂组合物是稀释的，以提供最終人类剂量的疫苗。所述剂量的终体积当然根据佐剂组合物的初始体积和加入佐剂组合物中的抗原组合物的体积而改变。在一种替代的实施方案中，用液体佐剂重配冻干的抗原组合物。在该实施方案中，佐剂组合物的人类剂量合适的体积大约等于人类剂量的终体积。在含有冻干的抗原组合物的管形瓶中加入液体佐剂组合物。最終的人类剂量可以是0. 5-1. 5ml。在ー种特定实施方案中，人类剂量是0. 5ml。在该实施方案中，本发明的疫苗组合物将包含QS21，其水平是30μ g或低于30 μ g，例如1-30 μ g/0. 5ml人类剂量。此外，在该实施方案中，本发明的佐剂组合物将包含QS21，其水平是30 μ g或低于30 μ g，例如1-30μ g/250y I佐剂组合物或/500 μ I佐剂组合物,这取决于佐剂组合物是要与液体还是冻干的抗原组合物进行组合。特别地，当与流感抗原组合时,可以使用的QS21的量可以是例如1-100 μ g(w/v)/组合物剂量，优选是10-50 μ g(w/v)/组合物剂量。QS21的合适的量是例如以下任一量
2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49 或 50 μ g(w/v)/ 组合物剂量。更优选地，QS21的量是25- 75 yg(w/v)/组合物剂量。通常，组合物剂量是约O. 5ml-约 lml。典型的疫苗剂量是 O. 5ml,O. 6ml,O. 7ml,O. 8ml,O. 9ml 或 lml。在一种优选实施方案中，每ml疫苗组合物中包含终浓度为50 μ g的QS21，或25 μ g/0. 5ml疫苗剂量。在另ー种优选实施方案中，每ml疫苗组合物中包含终浓度为35. 7μ g或71. 4μ g的QS21。特别地，O. 5ml疫苗剂量体积包含25 μ g或50 μ g的QS21/剂量。QS21的剂量合适地能够增强人类中对抗原的免疫应答。具体地，合适的QS21的量是相对于不含佐剂的组合物或相对于以另ー QS21量为佐剂的组合物，改进组合物的免疫潜能同时仍然是反应原性谱能够接受的量。3D-MPL 佐剂组合物进ー步包含额外的佐剂，其是脂多糖，合适地是脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别是3-脱酰基单磷酰脂质A(3D-MPL)。3D-MPL 由 GlaxoSmithKline Biologicals N. A.以 MPL 的名称出售，并且在文件中称作 MPL 或 3D-MPL。參见例如美国专利 Nos. 4，436，727 ;4，877，611 ;4，866，034 和4，912，094。3D-MPL主要促进具有IFN-g(Thl)表型的CD4+T细胞应答。根据GB 2220211A公开的方法可以生产3D-MPL。化学上，它是具有3、4、5或6个酰化链的3-脱酰基单磷酰脂质A的混合物。优选地，本发明的组合物中采用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒度使得它能够通过0.22 μ m滤器进行灭菌过滤。所述制剂描述于WO 94/21292中。本发明的关键方面是以下事实脂多糖，优选3D-MPL，可以以比以前认为有用的量更低的量使用，合适地30 μ g或更低的水平，例如1-30 μ g/人类剂量的免疫原性组合物。因此，本发明提供了人类剂量的免疫原性组合物，其中包含脂多糖，优选3D-MPL，其水平是30 μ g或更低，例如1-30 μ g。在一种实施方案中，人类剂量的免疫组合物包含3D-MPL，其水平是大约25μ g，例如 20-30 μ g,合适地是 21-29 μ g 或 22-28 μ g 或 23-27 μ g 或 24-26 μ g，或 25 μ g。在另ー实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含3D-MPL，其水平是大约10 μ g，例如 5-15 μ g，合适地是 6-14 μ g，例如 7-13 μ g 或 8-12 μ g 或 9-11 μ g，或 10 μ g。在进ー步的实施方案中，人类剂量的免疫组合物包含3D-MPL，其水平是大约5 μ g,例如 1-9 μ g,或 2-8 μ g,或合适地是 3-7 μ g 或 4-6 μ g,或 5 μ g。3D-MPL 的合适量是例如以下任一量1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，μ g (w/v) / 人类剂量的免疫原性组合物。在一种实施方案中，人类剂量的体积是O. 5ml。在进ー步的实施方案中，免疫原性组合物的体积是适于人类剂量的体积，所述体积是高于O. 5ml,例如O. 6,0. 7,0. 8,0. 9或lml。在进ー步的实施方案中，人类剂量是lml-1. 5ml。本发明的特征在于每个人类剂量含有30 μ g或更少，例如1-30 μ g的3D-MPL。本发明进ー步提供了包含30 μ g或更少，例如1-30 μ g的3D-MPL的佐剂组合物。典型地，所述佐剂组合物将是人类剂量合适的体积。当佐剂是要与液体形式的抗原组合物进行组合的液体形式时，佐剂组合物将是人类剂量合适的体积，其大约是人类剂量的目标终体积的大约一半，例如，对于O. 7ml的目标人类剂量，其是360 μ I体积，对于O. 5ml的目标人类剂量，其是250 μ I体积。当与抗原组合物组合时，佐剂组合物是稀释的，以提供最终人类剂量的疫苗。所述剂量的终体积当然根据佐剂组合物的初始体积和加入佐剂组合物中的抗原组合物的体积而改变。在一种替代的实施方案中，用液体佐剂重配冻干的抗原组合物。在该实施方案中，佐剂组合物的人类剂量合适的体积大约等于人类剂量的终体积。在含有冻干的抗原组合物的管形瓶中加入液体佐剂组合物。最終的人类剂量可以是
O.5-1. 5ml。在ー种特定实施方案中，人类剂量是O. 5ml。在该实施方案中，本发明的疫苗组合物将包含3D-MPL，其水平是30 μ g或低于30 μ g，例如1-30 μ g/0. 5ml人类剂量。此外，在该实施方案中，本发明的佐剂组合物将包含3D-MPL，其水平是30μ g或低于30 μ g，例如1-30 μ g/250 μ I佐剂组合物或/500 μ I佐剂组合物，这取决于佐剂组合物是要与液体还是冻干的抗原组合物进行组合。当免疫原性组合物含有流感病毒或其抗原性制剂时，包含脂质体形式的皂苷的佐剂组合物任选额外包含脂质A衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别是3D-MPL。在该实施方案中，可以使用的3D-MPL的量可以是例如I-100 μ g (w/v) /组合物剂量，优选是
10-50 μ g (w/v) /组合物剂量。3D-MPL的合适的量是例如以下任一量:1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49 或 50μ g(w/v)/组合物剂量。更优选地，3D-MPL的量是25-75 μ g (w/v) /组合物剂量。通常，组合物剂量是约O. 5ml-约Iml。典型的疫苗剂量是O. 5ml, O. 6ml, O. 7ml, O. 8ml, O. 9ml或lml。在一种优选实施方案中，每ml疫苗组合物中包含终浓度为50 μ g的3D-MPL，或25 μ g/0. 5ml疫苗剂量。在另ー种优选实施方案中，每ml疫苗组合物中包含终浓度为35. 7 μ g或71. 4 μ g的3D-MPL。特别地，O. 5ml疫苗剂量体积包含25 μ g或50 μ g的3D-MPL/剂量。3D-MPL的剂量合适地能够增强人类中对抗原的免疫应答。具体地，合适的3D-MPL的量是相对于不含佐剂的组合物或相对于以另ー MPL量为佐剂的组合物，改进组合物的免疫潜能同时仍然是反应原性谱能够接受的量。本发明的合适组合物是这样的其中最初在没有MPL的条件下制备脂质体(如WO96/33739中的描述)，然后加入MPL，合适地作为小于IOOnm的小颗粒或容易通过O. 22 μ m膜进行灭菌过滤的颗粒。因此，MPL不包含在囊泡膜中(称作MPL在外)。MPL包含在囊泡膜内(称作MPL在内)的组合物也形成本发明的一方面。抗原可以包含在囊泡膜内或包含在囊泡膜外。合适地，可溶性抗原在外，疏水或脂化抗原包含在膜内或膜外。在一种实施方案中，本发明的佐剂组合物包含脂多糖和免疫活性皂苷这两者。在本发明的ー种特定实施方案中，脂多糖是3D-MPL，并且免疫活性皂苷是QS21。在本发明的 进ー步的实施方案中，佐剂组合物基本由脂多糖和脂质体制剂中的免疫活性皂苷组成。合适地，在这种实施方案的ー种形式中，佐剂组合物基本由3D-MPL和QS21组成，任选含有甾醇，其优选是胆固醇。在本发明的进ー步的实施方案中，佐剂组合物在脂质体制剂中包含脂多糖和免疫活性皂苷，它们与一种或多种其它的免疫刺激剂或佐剂组合。合适地，在这种实施方案的一种形式中，脂多糖是3D-MPL，并且免疫活性皂苷是QS21。在ー种特定实施方案中，QS21和3D-MPL以相同终浓度/人类剂量的免疫组合物存在。在该实施方案的ー个方面，人类剂量的免疫原性组合物包含最终水平为25 μ g的3D-MP和25μ g的QS21。在进ー步的实施方案中，人类剂量的免疫原性组合物包含最终水平为IOyg的MPL和IOyg的QS21。在进ー步的实施方案中，提供了体积为250 μ I的佐剂组合物，其中包含水平为25 μ g的MPL和25μ g的QS21，或MPL和QS21各10μ g。可以与本发明的佐剂组合物一起使用的抗原包括病毒、寄生虫、细菌或肿瘤相关抗原，例如
按照本发明使用的流感病毒或其抗原性制剂可为分裂流感病毒或其分裂病毒抗原性制剂。在一个替代性实施方案中，流感病毒制剂可包含另ー类型的灭活流感抗原，例如灭活的全病毒或纯化的HA和NA(亚单位疫苗)，或流感病毒体。在再另ー个实施方案中，流感病毒可为减毒活流感病毒制剂。合适地，按照本发明使用的分裂流感病毒或其分裂病毒抗原性制剂为灭活病毒制齐 ，其中病毒颗粒用溶解脂质包膜的去污剂或其它试剂破坏。合适地，分裂病毒或其分裂病毒抗原性制剂如下制备用溶解浓度的有机溶剂或去污剂使感染性或灭活的完整流感病毒片段化，随后去除全部或大部分溶解剂和某些或大部分病毒脂质物质。所述其分裂病毒抗原性制剂是指相比于分裂病毒可能已经受了一定程度的纯化而保留了分裂病毒组分的大部分抗原特性的分裂病毒制剂。例如，当在卵中产生时，可以从分裂病毒去除了卵污染蛋白，或者在细胞培养物中产生时，可以从分裂病毒去除了宿主细胞杂质。分裂病毒抗原性制剂可包含一种以上病毒株的分裂病毒抗原性组分。含分裂病毒的疫苗(叫做‘分裂流感疫苗’)或含分裂病毒抗原性制剂的疫苗一般包含残余的基质蛋白和核蛋白，有时包含脂质以及膜包膜蛋白。这种分裂病毒疫苗通常包含大部分或全部病毒结构蛋白，但不一定和它们在全病毒中存在的比例相同。或者，流感病毒可为全病毒疫苗形式。对于大流行情况来说，其可表现出超过分裂病毒疫苗的优势，因为其避免了有关针对新流感病毒株是否可成功地产生分裂病毒疫苗的不确定性。对于某些病毒株来说，用于生产分裂病毒的常规去污剂可损伤病毒，并使其无用。尽管经常有可能使用不同的去污剂和/或开发不同的分裂疫苗生产方法，但这会耗时，在大流行情况下可能不可用。全病毒法除了较大程度的确定性以外，还有比分裂病毒大的疫苗生产能力，因为在制备适宜的分裂疫苗必需的额外纯化步骤中有相当大量的抗原损失。在另ー个实施方案中，流感病毒制剂为纯化的亚单位流感疫苗形式。亚单位流感疫苗一般包含两种主要的包膜蛋白HA和NA，可能具有超过全病毒体疫苗的额外优势，因为它们一般无反应原性，尤其是在年轻的接种者中。亚单位疫苗可重组生产，或者可由破裂的病毒颗粒纯化。在另ー个实施方案中，流感病毒制剂为病毒体形式。病毒体是球形的单层囊泡，其保留了真实构象的功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA，嵌入病毒体的磷脂双层膜中。所述流感病毒或其抗原性制剂来源于卵或来源于细胞培养物。例如，本发明的流感病毒抗原或其抗原性制剂可来源于常规的含胚卵法，该方法在卵中培养流感病毒，并纯化收集的尿囊液。卵可在短时间内大量累积。或者，它们可来源于任ー种使用细胞或细胞培养物的新生产方法，以培养病毒或表达重组流感病毒表面抗原。适于培养病毒的细胞基质包括例如狗肾细胞，例如MDCK或来自MDCK克隆的细胞、MDCK样细胞，猴肾细胞，例如AGMK细胞，包括VeiO细胞，合适的猪细胞系，或适于生产疫苗用途的流感病毒的任意其它哺乳动物细胞类型。合适的细胞基质还包括人细胞，例如MRC-5细胞。合适的细胞基质不限于细胞系；例如原代细胞，如鸡胚成纤维细胞，还包括禽细胞系。流感病毒抗原或其抗原性制剂可通过众多エ业用方法中的任一种生产，例如在专利号DD 300833和DD 211444 (引入本文作为參考)中描述的分裂流感病毒法。分裂流感病毒传统上使用溶剂/去污剂处理产生，例如磷酸三正丁酷，或者ニこ醚与Tween 的组合(称作“Tween-醚”分裂)，该方法仍在某些生产厂家中使用。目前使用的其它分裂剂包括去污剂或蛋白水解酶或胆盐，例如在专利号DD 155875(引入本文作为參考)中描述的脱氧胆酸钠。可用作分裂剂的去污剂包括阳离子去污剂，例如溴化鲸蜡基三甲铵(CTAB);其它离子去污剂，例如十二烷基硫酸盐、牛磺脱氧胆酸盐；或非离子去污剂，如上述的ー种，包括Triton X-100 (例如在 Lina 等，2000，Biologicals 28，95-103 描述的方法中)和 TritonN-IOl ;或者任何两种或多种去污剂的组合。分裂疫苗的制备方法可包括众多不同的过滤和/或其它分离步骤，如各种组合的超离心、超滤、区带离心和层析(例如离子交換)步骤，以及任选的例如采用热、甲醛或β_丙醇酸内酯或紫外线的灭活步骤，其可在分裂前或后进行。分裂过程可以分批、连续或半连续过程进行。用于分裂免疫原性组合物的优选分裂和纯化方法描述于WO 02/097072。本发明的优选分裂流感疫苗抗原制剂包含生产过程剩余的残余量的Tween 80和/或Triton X-100，但这些物质可在分裂抗原制备后加入或调整其浓度。优选地，Tween 80和Triton X-100都存在。疫苗剂量中这些非离子型表面活性剂的终浓度的优选范围为Tween 80 :0. 01-1%,更优选为约 O. 1% (体积 / 体积)Triton X-100 :0. 001-0. 1% (重量 / 体积)，更优选为 0. 005-0. 02% (重量 / 体积)。在ー个特定实施方案中，Tween 80的终浓度在O. 045% -O. 09% (重量/体积)的范围内。在另ー个特定实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Tween 80浓度在0.045%-0.2% (重量/体积)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。在另ー个特定实施方案中，Triton X-100的终浓度在0. 005% -0. 017% (重量/体积)的范围内。在另ー个特定实施方案中，抗原作为2倍浓缩的混合物提供，其具有的Triton X-100浓度在0.005%-0.034% (重量/体积)的范围内，在最终配制时必须用佐剂(或在对照制剂中用缓冲液)稀释2倍。优选地，流感病毒制剂在低水平硫柳汞存在下制备，或优选地在没有硫柳汞的情况下制备。优选地，获得的流感制剂在没有有机汞防腐剂的情况下是稳定的，具体地说，所述制剂不含残余硫柳汞。具体地说，流感病毒制剂包含在没有硫柳汞的情况下或在低水平、硫柳汞(一般来说为5μ g/ml或以下)的情况下稳定的血细胞凝集素抗原。具体地说，こ型流感毒株的稳定利用α生育酚衍生物如α生育酚琥珀酸酷(也称为维生素E琥珀酸酷，即VES)来实施。这种制剂及其制备方法公开于WO 02/097072。优选的组合物含3种灭活的分裂病毒体抗原，它们由WHO推荐的适宜流感季的病毒株制备。优选地，流感病毒或其抗原性制剂和本发明的佐剂包含在同一容器中。这被称为‘单管形瓶法’。优选地，所述管形瓶为预填充注射器。在一个替代实施方案中，流感病毒或其抗原性制剂和本发明的佐剂包含在分开的容器或管形瓶中，并在给予受试者之前不久或给予受试者时混合。这被称为‘双管形瓶法’。作为实例，当疫苗为0.7ml总剂量体积的2组分疫苗时，浓缩抗原(例如浓缩三价灭活分裂病毒体抗原)存在于I个管形瓶(335 μ I)(抗原容器)中，预填充注射器含佐剂(360 μ I)(佐剂容器)。在注射时，使用含佐剂的注射器将含浓缩的三价灭活分裂病毒体抗原的管形瓶中的内容物由管形瓶中取出，接着轻柔混合注射器。在注射前，使用的针头用肌内针头替换，体积调整到530μ I。在该实例中，一个剂量的重配的含有佐剂的流感疫苗候选物相当于530 μ I。根据本发明，在本文定义的多价免疫原性组合物中的至少ー种流感病毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。这种病毒株在下文还可称为‘大流行株’。具体地说，当疫苗为多价疫苗如ニ价或三价或四价疫苗吋，至少ー种病毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。适宜的病毒株是但不限于Η5Ν1、Η9Ν2、Η7Ν7、Η2Ν2和HlNl。所述流感病毒或其抗原性制剂合适地为多价的，例如ニ价或三价或四价。优选地，流感病毒或其抗原性制剂为三价的或四价的，具有得自3种不同流感株的抗原，至少ー种病毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的潜力。给予流感病毒株引起大流行爆发潜カ的流感病毒株特征是与当前循环株中的血细胞凝集素相比其包含新血细胞凝集素；其能够在人群中水平传播；其对人是致病的。新血细胞凝集素可为长时间段内(可能数十年)在人群中还不明显的血细胞凝集素，例如Η2。或者其可为之前还没有在人群中循环的血细胞凝集素，例如存在于鸟中的Η5、Η9、Η7或Η6。在任一种情况下，大部分或至少大比例的乃至整个群体以前都没有遇到抗原，在免疫学上对抗原是原初态的。一般来说，在大流行环境下，某些群体被流感感染的风险增加。老年人、慢性疾病患者和小孩尤其易感，但许多年轻人和表面上健康的人也有风险。对于Η2流感，1968年后 出生的部分群体承受的风险增加。对这些群体重要的是尽快地和以简单的方式有效地被保护。承受增加的风险的另ー个人群是旅行者。今天，人们比以往任何时候都更常旅行，出现最多新病毒的地区中国和东南亚在近些年已成为受欢迎的旅行目的地。旅游模式的这种改变能使新病毒在约数周内而不是数月或数年内到达全球。因此，对于这些人群来说，在大流行情况下或潜在大流行的情况下特别需要接种保护来对抗流感。适宜的病毒株是但不限于Η5Ν1、Η9Ν2、Η7Ν7、Η2Ν2和HlNl。任选地，所述组合物可包含3价以上，例如3种非大流行毒株加ー种大流行毒株。或者，所述组合物可包含3种大流行毒株。优选地，所述组合物包含3种大流行毒株。
用于本发明的免疫原性组合物的抗原的另ー实例是链球菌抗原，例如来自A族链球菌或B族链球菌，但最优选来自肺炎链球菌。最优选使用至少ー种蛋白和/或至少ー种糖抗原。至少ー种肺炎链球菌蛋白抗原最优选选自肺炎球菌溶血素、PspA或其跨膜缺失变体、PspC或其跨膜缺失变体、PsaA或其跨膜缺失变体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、CbpA或其跨膜缺失变体、PhtA、PhtD, PhtB, PhtE, SpsA、LytB, LytC, LytA、Spl25、SplOl、Spl28、Spl30和Spl33，或其免疫功能等同物(例如，上述蛋白的结构域的融合体，例如W001/98334和TO03/54007中描述的PhtDE融合体)。某些组合物描述于WO 00/56359和WO 02/22167和WO 02/22168 (在此引入作为
參考)。所述抗原可包含荚膜糖类抗原(优选缀合至载体蛋白)，其中所述糖类(最优选多糖)来源于至少四种肺炎球菌血清型。优选地，所述四种血清型包括6B、14、19F和23F。在 进ー步的实施方案中，所述组合物中包含至少7种血清型，例如来源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的那些。在进ー步的实施方案中，所述组合物中包含至少10种血清型，例如在一个实施方案中，所述组合物包含来源于血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖类(优选缀合至载体蛋白)。在另ー实施方案中，免疫原性组合物包含来源于血清型
1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖类(优选缀合至载体蛋白)。在本发明的一种优选实施方案中，包括至少13种糖类抗原(优选缀合至载体蛋白)，但本发明还包括另外的糖类抗原，例如 23 价体(如血清型 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F)。尽管上述糖类有利地为其全长天然多糖形式，但应该理解，如果在偶联至蛋白载体时有需要，那么也可以使用大小减少但仍然具备免疫原性的多糖(參见例如EP 497524和 497525)。为了预防/缓解老年(55岁以上)群体的肺炎和婴儿(最大至18个月)以及幼儿(通常是18个月到5岁)的中耳炎，本发明的优选实施方案将本文描述的多价肺炎链球菌糖类与优选选自以上列出蛋白的肺炎链球菌蛋白组合在一起。肺炎链球菌蛋白的组合还可有利地如下文所述使用。肺炎球菌蛋白肺炎链球菌抗原优选选自来自多组氨酸三联体家族(Pht)的蛋白、来自Lyt家族的蛋白、胆碱结合蛋白、具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任意氨基酸)、具有II型信号序列基序LXXC的蛋白(其中X是任意氨基酸)和具有I型信号序列基序的蛋白。这些种类(或基序)中的优选实例是以下蛋白(或其截短物或免疫功能等同物)Pht (聚组氨酸三联体)家族包含蛋白phtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族具有以下特征脂化序列、由脯氨酸富集区和几个组氨酸三联体分隔开的两个结构域(可能涉及金属或核苷结合或酶活性)、(3-5)卷曲螺旋区、保守的N末端和异源的C末端。它存在于已检验的所有肺炎球菌菌株中。同源蛋白还可见于其它链球菌和奈瑟氏球菌。该家族优选的成员包括PhtA、PhtB和PhtD。更优选地，其包括PhtA或PhtD。但是，要理解的是，术语PhtA、B、D和E指具有在下文引用文献中公开的序列的蛋白，以及其具有序列同源性的天然(和人工制备的)变体，所述变体与參比蛋白至少90%相同。优选地，至少95%相同，最优选97%相同。
对于Pht蛋白而言，PhtA公开于WO 98/18930，还可称作Sp36。如上所述，其是一种多组氨酸三联体家族的蛋白，且具有II型信号基序LXXC。PhtD公开于WO 00/37105，也可称作Sp036D。如上所述，它也是多组氨酸三联体家族的ー种蛋白，也具有II型LXXC信号基序。PhtB公开于WO 00/37105，也称作Sp036B。PhtB家族的另一成员是降解C3的多肽，公开于WO 00/17370。该蛋白也来自多组氨酸三联体家族，也具有II型LXXC信号基序。优选的免疫功能等同物是公开于W098/18930的蛋白Sp42。PhtB截短物(约79kD)公开于WO 99/15675，它也被认为是PhtX家族成员。PhtE 公开于 WO 00/30299， 称作 BVH-3。SpsA是胆碱结合蛋白(Cbp)，公开于WO 98/39450。Lyt家族是膜结合蛋白，与细胞裂解有夫。N末端结构域包含胆碱结合结构域，但Lyt家族不具有以下所示的见于胆碱结合蛋白家族(Cbp)的所有特征，因此，对本发明而言，Lyt家族被认为不同于Cbp家族。与Cbp家族相反，C末端结构域包含Lyt蛋白家族的催化结构域。该家族包括LytA、B和C。对于Lyt家族而言，LytA公开于Ronda等，EurJBiochem，164 :621-624(1987)。LytB 公开于 WO 98/18930，也称作 Sp46。LytC 也公开于 WO98/18930，也称作Sp91。该家族的优选成员是LytC。另ー个优选实施方案是Lyt家族(具体地说是LytA)截短物，其中“ Lyt”如上定义，“截短物”指缺失胆碱结合区的50%或更多的蛋白。优选地，这类蛋白缺失整个胆碱结合区。Spl25是具有细胞壁锚定基序LPXTG(其中X是任意氨基酸)的肺炎球菌表面抗原的实例。业已发现，在该类具有此基序的肺炎球菌表面蛋白中的任意蛋白在本发明范围内都是有用的，因此被看作是本发明的又ー种蛋白。Spl25自身公开于WO 98/18930，也称为ZmpB-锌金属蛋白酶。SplOl公开于WO 98/06734 (其中，其具有參考号#y85993)。其特征还在于I型信
号序列。Spl33公开于WO 98/06734 (其中，其具有參考号#y85992)。其特征还在于I型信号序列。Spl28 和 Spl30 公开于 TO 00/765400。本发明所使用的蛋白优选选自PhtD、PhtA和PhtE，或者是这些蛋白中的2种或全部 3 种的组合(即 PhtA+D、A+E、D+E 或 A+D+E)。可包括的其它肺炎球菌蛋白抗原为来自以下的ー种或多种肺炎球菌溶血素(也称为Ply ;优选通过化学处理或突变而去毒)[W096/05859，WO 90/06951, WO 99/03884]、PsaA及其跨膜缺失变体(Berry 和 Paton，Infect Immun 1996 年 12 月；64(12) :5255-62)、PspA及其跨膜缺失变体(US 5804193、WO 92/14488、WO 99/53940)、PspC及其跨膜缺失变体(W0 97/09994、WO 99/53940)、胆碱结合蛋白(Cbp)家族成员[例如CbpA及其跨膜缺失变体(W0 97/41151 ；W0 99/51266)]、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect, Immun. 199664 3544)、HSP70 (TO 96/40928)、PcpA (Sanchez-Beato 等，FEMS Microbiol Lett 1998，164 :207-14)、M样蛋白(SB专利申请号EP 0837130)和粘附素18627 (SB专利申请号EP0834568)。本发明还包含这种蛋白的免疫功能等同物或截短物(如上定义)。关于胆碱结合蛋白家族，该家族的成员最初被鉴定为可通过胆碱亲和层析纯化的肺炎球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白都非共价结合于细胞壁磷壁酸和膜结合型脂磷壁酸的磷酸胆碱部分。在结构上，它们有数个在整个家族中共有的区域，但这些蛋白的确切特性(氨基酸序列，长度等)可变。一般来说，胆碱结合蛋白包含N末端区(N)、保守重复区(Rl和/或R2)、脯氨酸富集区(P)和保守的胆碱结合区(C)，这些区域由多个重复序列組成，占该蛋白的约一半。正如本申请中所用的，术语“胆碱结合蛋白家族(Cbp) ”选自在WO 97/41151中鉴定的胆喊结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA> CbpD 和 CbpG。CbpA 公开于 W097/41151。CbpD 和 CbpG 公开于 WO 00/29434。PspC 公开于 W097/09994。PbcA 公开于 WO 98/21337。优选地，胆碱结合蛋白选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。
如果Cbp是所用的另ー种蛋白，那么它可以是Cbp截短物，其中“ Cbp”如上定义，“截短物”指缺失胆碱结合区(C)的50%或更多的蛋白。优选这类蛋白缺失整个胆碱结合区。更优选地，这类蛋白截短物缺失(i)胆碱结合区和(ii)该蛋白的N末端一半的一部分，但仍保留至少ー个重复区(Rl或R2)。再更优选地，所述截短物具有2个重复区(Rl和R2)。这类优选实施方案的实例是描述于WO 99/51266或W099/51188的NRlxR2、RlxR2、NRlxR2P和RlxR2P，但缺失类似胆碱结合区的其它胆碱结合蛋白也包括在本发明的范围内。Cbp截短物-Lyt截短物嵌合蛋白(或融合体)也可用于本发明的组合物。优选地，其包括Cbp的NRlxR2 (或RlxR2或NRlxR2P或RlxR2P)和Lyt的C末端区(Cterm,即缺失胆碱结合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更优选地，Cbp选自CbpA、PbcA、SpsA或PspC0再更优选地，其是CbpA。优选地，Lyt是LytC (也可称作Sp91)。也可应用缺失了胆碱结合域(C)并表达为与Lyt的融合蛋白的PspA或PsaA截短物。优选地，Lyt是LytC0在ー种肺炎球菌组合物中，可能组合本发明的不同肺炎球菌蛋白。优选本发明的蛋白组合选自2种或多种(3或4种)不同种类，如具有II型信号序列基序LXXC的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如多组氨酸三联体家族(Pht))、胆碱结合蛋白家族(Cbp)、具有I型信号序列基序的蛋白(例如SplOl)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任意氨基酸，例如Spl28、Spl30)、毒素(例如Ply)等等。在这些种类(或基序)中的优选实例是以上所提到的蛋白或其免疫功能等同物。毒素+Pht、毒素+Cbp、Pht+Cbp和毒素+Pht+Cbp是优选的种类组合。优选的有益组合包括但不限于PhtD+NRlxR2、PhtD+NRlxR2_Sp9 ICterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Spl28、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NRlxR2、PhtA+NRlxR2-Sp9ICterm 嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Spl28、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NRlxR2+LytC、NRlxR2P+PspA、NRlxR2+PspA、NRlxR2+Spl28、RlxR2+LytC、RlxR2+PspA、RlxR2+PsaA、RlxR2+Spl28、RlxR2+PhtD、RlxR2+PhtA。优选地，NRlxR2 (或 RlxR2)来自 CbpA或PspC。更优选它来自CbpA。特别优选的肺炎球菌蛋白组合包括Ply(或其截短物或免疫功能等同物)+PhtD (或其截短物或免疫功能等同物)以及任选包括NRlxR2 (或RlxR2或NRlxR2P或RlxR2P)。优选地，NRlxR2 (或 RlxR2 或 NRlxR2P 或 RlxR2P)来自 CbpA 或 PspC。更优选它来自CbpA。所述抗原可为含多糖抗原的肺炎球菌糖类缀合物，所述多糖抗原来自至少4种血清型，优选至少7种血清型，更优选至少10种血清型，包括至少ー种但优选2、3或4种优选选自上述蛋白组的肺炎链球菌蛋白。优选所述蛋白中的ー种蛋白是PhtD (或其免疫功能等同物)和/或Ply(或其免疫功能等同物)。与多糖接种方法有关的问题是多糖本身为弱免疫原这一事实。为克服此问题，可将多糖与蛋白载体缀合，所述载体可提供旁观T细胞辅助作用。因此，优选本发明所用的糖类连接至这种蛋白载体。目前常用于产生糖类免疫原的这类载体的实例包括白喉类毒素和破伤风类毒素(分别为DT、DT CRM197和TT)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC以及結核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。基于肺炎球菌糖类的免疫原性组合物(或疫苗)的优选载体是来自流感嗜血杆菌的D蛋白(EP 594610-B)或其片段。适合使用的片段包括含T辅助表位的片段。具体地说，D蛋白片段优选包含所述蛋白的N末端1/3。D蛋白载体可作为载体用在其中缀合了多种肺炎球菌糖类抗原的组合物中。组合中的ー种或多种肺炎球菌糖类可有利地缀合到D蛋白上。
用于肺炎球菌糖类的另一种优选载体是肺炎球菌蛋白本身(如上在“本发明的肺炎球菌蛋白”章节中定义)。所述糖类可通过任何已知方法(例如Likhite的美国专利4，372，945和Armor等的美国专利4，474，757的方法)与载体蛋白连接。优选地，可进行CDAP缀合(W095/08348)。优选地，所述缀合物的蛋白糖类(重量重量)比例是0.3 : I到I : 1，更优选O. 6 I到O. 8 1，最优选约O. 7 I。本发明的特别优选的组合物包含一种或多种缀合的肺炎球菌糖类，以及本发明的ー种或多种肺炎球菌蛋白。另外，肺炎球菌糖类和蛋白可作为吸附在磷酸铝上的原液组分以液体形式稳定储存。在本发明的另一方面，疫苗组合物可以包含人巨细胞病毒(HCMV)抗原。HCMV是ー种属于疱疹病毒家族的人DNA病毒，并且是新生儿先天缺陷的主要原因，并且也导致免疫受损患者的严重医学状況。临床疾病导致多种症状，包括发热、肝炎、肺炎和传染性单核细胞增多症。在一种实施方案中，HCMV抗原是嵌合融合蛋白或其免疫原性衍生物，其包含与HSV糖蛋白的一部分融合的HCMV糖蛋白的一部分。HCMV糖蛋白典型地是gB，并且HSV糖蛋白典型地是gD，特别是HSV 2型gD(gD2)。融合体典型地位于HCMV gB蛋白的一部分的N末端部分的氨基酸与HCMV gD蛋白的一部分的C末端的氨基酸之间。融合蛋白的HCMV gB蛋白和HSV gD蛋白组分都可以缺乏膜锚区。HCMV gB蛋白的部分可以包含HCMV gB的不可切割形式。合适地，这是通过改变位于蛋白的切割位点的一个或多个氨基酸，例如通过分别将Arg458和Arg459分别交换为Glu和Thr而实现的。HSV蛋白的部分可以包含gD2的信号序列(氨基酸1_25)，并且任选包含gD2的氨基酸26-52，和/或来自gD2的序列PEDSALLEDPED或其功能等同物，其可以更短或更长。来自HSV gD的其它序列可以加入融合蛋白，例如HCMV gB蛋白的C末端。在一种实施方案中，融合蛋白包含与HCMV gB蛋白的残基28_685融合的HSV gD2蛋白的氨基酸1-52。所述融合蛋白称作HCMVgB685*。在进ー步的实施方案中，来源于内部gD2序列的氨基酸序列PEDSALLEDPED可以包括在蛋白HCMV gB685*的C末端，以产生命名为HCMV gB685#的蛋白。这些特定融合蛋白更详细描述于W095/31555。适于用作HCMV疫苗的另ー种免疫原是pp65，它是ー种描述于WO 94/00150 (Cityof Hope)的 HCMV 基质。在进ー步的实施方案中，免疫原性组合物包含来源于认为与生殖器疣有关的人乳头瘤病毒(HPV) (HPV 6或HPV 11以及其它HPV病毒)和/或与宫颈癌有关的HPV病毒(HPV16、HPV18以及其它HPV病毒)的抗原。在一种实施方案中，生殖器疣预防或治疗组合物的形式包含LI颗粒或病毒壳粒和融合蛋白，该融合蛋白包含一种或多种选自HPV蛋白E1、E2、E5、E6、E7、L1和L2的抗原。在一种实施方案中，融合蛋白的形式为WO 96/26277公开的L2E7和GB9717953. 5 (PCT/EP98/05285)公开的蛋白 D(1/3)_E7。优选HPV宫颈感染或宫颈癌的预防或治疗疫苗组合物可包含HPV16或18抗原。例如LI或L2抗原単体、或以病毒样颗粒(VLP) —起存在的LI或L2抗原或者以VLP或壳粒结构单独存在的LI蛋白。这类抗原、病毒样颗粒和病毒壳粒本身是已知的。參见例如 W094/00152、W094/20137、W094/05792 和 W093/02184。可包含其它单独或作为融合蛋白的早期蛋白，例如E7、E2或优选E5 ;这样特别优选的实施方案包括含L1E7融合蛋白的VLP(W096/11272)。在一种实施方案中，HPV 16抗原包含与蛋白D载体融合的早期蛋白E6或E7，以形成蛋白D-HPV 16的E6或E7融合体，或其组合；或者E6或E7与L2的组合(W0 96/26277)。或者，HPV 16或18早期蛋白E6和E7可以以单个分子、优选蛋白D-E6/E7融合蛋白存在。这种组合物可任选包含HPV18的E6和E7之一或二者，优选为蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白形式。本发明的组合物还可额外包含来自其它HPV类型、优选HPV 31或33的抗原。致癌HPV 类型包括 HPV 31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66 和 68。因此，除 HPV16和/或PV 18之外，本发明的组合物可以包含来自ー种或多种所述HPV类型的抗原。用于本发明的HPV LlVLPs或病毒壳粒可以包含全长LI或LI的免疫原性片段，或由全长LI或LI的免疫原性片段组成。当VLP或病毒壳粒包含LI的免疫原性片段或由LI的免疫原性片段组成吋，HPVLl的合适免疫原性片段包括LI的截短、缺失、取代或插入突变体。合适地，所述免疫原性片段能够引起免疫应答，所述免疫应答能够识别LI蛋白，例如得到LI蛋白的HPV类型的病毒样颗粒。合适的免疫原性LI片段包括截短的LI蛋白。一方面，截短除去了核定位信号。另一方面，截短是C末端截短。另ー方面，C末端截短除去了少于50个氨基酸,如少于40个氨基酸。当LI来自HPV 16吋，则另一方面，C末端截短从HPV 16L1除去了 34个氨基酸。当LI来自HPV 18吋，则另一方面，C末端截短从HPV 18L1除去了 35个氨基酸。合适的截短的HPV 16和18L1序列公开于WO 06/114312。HPV 16序列也可以为公开于W09405792或US6649167中的那些，例如，合适地被截短。合适的截短为在上述序列的等同位置截短，如通过序列比较来评价。另ー种HPV 18序列在W09629413中公开，其可合适地被截短。合适的截短为在上述序列的等同位置截短，如通过序列比较来评价。其它的HPV 16和HPV 18序列是本领域已知的，可适用于本发明。、
当存在来自另ー种HPV类型的LI蛋白时，则可以使用相应于对HPV 16和HPV 18进行的C末端截短的那些截短，这是基于DNA或蛋白序列比对。HPV 31和45L1蛋白的合适截短公开于WO 06/114312。例如，也可以进行HPV 31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66 和 68 的合适的截短，在一方面，除去与上文描述的那些等同的LI蛋白C末端部分，如通过序列比对所评价的。本发明的LI蛋白或其免疫原性片段可以任选是融合蛋白形式，例如LI蛋白与L2或早期蛋白的融合体。HPV LI蛋白合适地是病毒壳粒或病毒样颗粒(VLP)的形式。一方面，HPV VLPs可以用于本发明。HPV VLPs和生产VLPs的方法是本领域公知的。VLPs典型地是从病毒的LI结构蛋白，任选从L2结构蛋白构建的，參见例如W09420137，US5985610, W09611272,US6599508B1,US6361778B1,EP 595935。任何合适的HPV VLP都可以用于本发明，其提供交叉保护，如LI或L1+L2VLP。 合适地，VLP是仅仅含有LI的VLP。本发明的组合物可以含有HPV 16L1VLPS和HPV 18LlVLPs的组合，或来自HPV 16，18，31和45的HPV LlVLPs的组合，或更大的组合，并且包括HPV 16和18或HPV 16，18，31和45L1VLPS，或更大的组合，其中LI按照上文的描述任选截短。在本发明的特定实施方案中，一种或多种来自致癌HPV类型的额外抗原与HPV 16和/或18抗原一起使用，所述抗原选自以下HPV类型HPV 31，45，33，58和52。如本文的描述，每种情况下抗原可以是LI，例如LlVLPs或病毒壳粒形式。因此，用于本文描述的组合物、方法和用途中的HPV抗原可以包含来自HPV 16，18，31，45，33，58和52的LlVLPs或病毒壳粒或由所述VLPs或病毒壳粒组成。LlVLPs可以是仅仅含LI的VLPs，或与另ー种抗原如L2在L1+L2VLPS中组合。LI蛋白可以合适地按照本文的描述截短。可以通过标准技术，例如电子显微术和动态激光散射来评估VLP制剂。VLP可以包含全长LI蛋白。一方面，用于形成VLP的LI蛋白是上文描述的截短的LI蛋白。可以在任何合适的细胞基质，如酵母细胞或昆虫细胞，如在杆状病毒表达系统中制备VLPs，并且，用于制备VLPs的技术是本领域公知的，如W09913056，US 6416945B1, US6261765B1和US6245568及其中的參考文献，在此引入其完整内容作为參考。可以通过解组装和重新组装技术来制备VLP，其可提供更稳定和/或更均质的乳头瘤病毒 VLP。例如 McCarthy 等，1998 " Quantitative Disassembly and Reassembly ofHuman Papillomavirus Type IlVirus like Particles in Vitro" J. Virology 72(1)33-41，其中描述了从昆虫细胞纯化的重组LlHPV IlVLP的解组装和重新组装以获得VLP的均质制剂。W09913056和US6245568也描述了制备HPV VLP的解组装和重新组装方法。一方面，本发明的HPV VLPs可如W09913056或US6245568中的描述制备。本发明的组合物可以包含来自引起疟疾的寄生虫如恶性疟原虫或间日疟原虫的抗原或其抗原性制剂。例如，可能的来自恶性疟原虫的抗原包括子孢子蛋白(CS蛋 白)、RTS, S MSPl、MSP3、LSAl、LSA3、AMAl和TRAP。RTS是ー种杂合蛋白，包含恶性疟原虫的子孢子(CS)蛋白的基本上所有C-末端部分，其通过こ型肝炎表面抗原的preS2部分的四个氨基酸与こ型肝炎病毒的表面(S)抗原连接。它的完整结构在国际专利申请NO. PCT/EP92/02591中公开，所述专利申请的公开号是WO 93/10152，要求英国专利申请No. 9124390. 7的优先权。当在酵母中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒产生，当与来自HBV的S抗原共表达时，产生称为RTS，S的混合颗粒。TRAP抗原在以WO 90/01496公开的国际专利申请N0.PCT/GB89/008 95中公开。本发明的ー种优选实施方案是疟疾疫苗，其中抗原性制剂包含RTS，S和TRAP抗原的组合。其他很可能作为多阶段疟疾疫苗的组分候选物的疟原虫抗原是恶性疟原虫 MSPl、AMAl、MSP3、EBA、GLURP、RAPl、RAP2、钳合蛋白、PfEMPl、Pf332、LSA1、LSA3、STARP, SALSA, PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs 16、Pfs48/45、Pfs230 和它们在疟原虫物种中的类似物。本发明的一个实施方案是包含RTS，S或C蛋白或其片段，如RTS，S的CS部分的组合物，所述RTS，S或C蛋白或其片段与可以选自例如MSP1、MSP3、AMAU LSAl或LSA3的ー种或多种其它疟疾抗原组合。来自间日疟原虫的可能抗原包括子孢子蛋白(CS蛋白)和Duffy抗原结合蛋白及其片段，如PvRII (參见例如W002/12292)。可以用于本发明的免疫原性组合物的其它可能的抗原包括链球菌抗原，如来自A族链球菌或B族链球菌、合适地来源于以下病原体的抗原HIV-I,(如F4抗原或其片段或gag或其片段，诸如p24、tat、nef、gpl20或gpl60或任何这些抗原的片段)；人类疱疹病毒，如gD或其衍生物或立即早期蛋白，如来自HSVl或HSV2的ICP27;巨细胞病毒((尤其是人类)(如gB或其衍生物))；轮状病毒(包括减毒活病毒);EB病毒(如gp350或其衍生物)；水痘-帯状疱疹病毒(如gpl、II和IE63);或来自肝炎病毒，如こ型肝炎病毒(例如こ型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或来自其它病毒病原体，如副粘病毒呼吸道合胞体病毒(如F、N和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒(例如HPV6、
11、16、18)、黄病毒(如黄热病毒、登革热病毒、蜱传播脑炎病毒、日本脑炎病毒)或流感病毒(全活病毒或灭活病毒、在卵中或MDCK细胞中培养的分裂流感病毒或完整流感病毒体(如R. Gluck, Vaccine, 1992，10，915-920所述)或其纯化蛋白或重组蛋白，如HA、NP、NA或M蛋白或其组合)；或来源于细菌病原体,如奈瑟氏球菌(Neisseria spp),包括淋病奈瑟氏球菌(N. gonorrhea)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)(例如荚膜糖类及其缀合物、运铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、粘附素)；化脓链球菌(S. pyogenes)(如M蛋白或其片段，C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、无乳链球菌(S. agalactiae)、变异链球菌(S. mutans);杜氏嗜血菌(H. ducreyi);莫拉氏菌(Moraxella spp),包括粘膜炎莫拉氏菌(M catarrhalis),也称为粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhal is)(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵袭素)；博德特氏菌(Bordetella spp)，包括百日咳博德特氏菌(B. pertussis)(例如百日咳外膜蛋白(pertactin)、百日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B. parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(B. bronchiseptica);分枝杆菌(Mycobacterium spp.),包括结核分枝杆菌(M. tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝杆菌(M. bovis)、麻风分枝杆菌(M. leprae)、鸟分枝杆菌(M. avium)、副结核分枝杆菌(M. paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M. smegmatis);军团菌(Legionella spp),包括侵肺军团菌(L. pneumophila)；埃希氏菌(Escherichia spp),包括肠产毒性大肠杆菌(enterotoxic E.coli)(例如定居因子、热不稳定毒素或其衍生物、热稳定毒素或其衍生物)、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(例如志贺毒素样毒素或其衍生物)；弧菌(Vibrio spp)，包括霍乱弧菌(V. cholera)(例如霍乱毒素或其衍生物)；志贺氏菌(Shigella spp),包括索氏志贺氏菌(S. sonnei)、痢疾志贫氏菌(S. dysentertae)、弗氏志贫氏菌(S. f Iexnerii)；耶尔森氏菌(Yersinia spp),包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y. enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶尔森氏菌(Y. pestts)、假结核耶尔森氏菌(Y. pseudotuberculosis)；弯曲杆菌(Campylobacter spp),包括空肠弯曲杆菌(C. jejuna)(例如毒素、粘附素和侵袭素)和大肠弯曲杆菌(C.coli);沙门氏菌(Salmonella spp),包括伤寒沙门氏菌(S. typhi)、副伤寒沙门氏菌(S. paratyphi)、猪霍乱沙门氏菌(S. choleraesuis)、肠炎沙门氏菌(S. enteritidis);利斯特氏菌(Listeria spp),包括单核细胞增生利斯特氏菌(L. monocytogenes);螺杆菌(Helicobacter spp),包括幽门螺杆菌(H. pylori)(例如脲酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌(Pseudomonas spp)，包括铜绿假单胞菌(P. aeruginosa);葡萄球菌(Staphylococcus spp),包括金黄色葡萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis);肠球 菌(Enterococcus spp),包括幾肠球菌(E. faecalis)、尿肠球菌(E. faecium);梭菌(Clostridium spp.),包括破伤风梭菌(C. tetani)(例如破伤风毒素和其衍生物)、肉毒梭菌(C. botulinum)(例如肉毒杆菌毒素和其衍生物)、艰难梭菌(C. difficile)(例如梭菌毒素A或B和其衍生物);芽孢杆菌(Bacillus spp)，包括炭疽芽孢杆菌(B. anthracis)(例如肉毒杆菌毒素和其衍生物)；棒杆菌(Corynebacteriumspp),包括白喉棒杆菌(Cdiphtheriae)(例如白喉毒素和其衍生物)；疏螺旋体(Borreliaspp.),包括布氏疏螺旋体(B. burgdorferi)(例如 OspA、OspC、DbpA、DbpB)、格氏疏螺旋体(B. garinii)(例如 OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋体(B. afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. andersonii (例如 OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏蝶疏螺旋体(B. hermsii);埃里希氏体(Ehrlichia spp),包括马埃里希氏体(E. equi)和人粒细胞埃里希氏体病(Ehrlichiosis)因子；立克次氏体(Rickettsia spp),包括立氏立克次氏体(R. rickettsii);衣原体(Chlamydia spp.),包括砂眼衣原体(C trachomatis)(例如M0MP、肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(C. pneumoniae)(例如M0MP、肝素结合蛋白)、婴鸟踏热衣原体(C. psittaci)；钩端螺旋体(Leptospira spp.),包括问号钩端螺旋体(L. interrogans);密螺旋体(Treponema spp.),包括苍白密螺旋体(T. pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齿垢密螺旋体(T. denticola)、猪痢疾密螺旋体(T. hyodysenteriae)；或来源于寄生物，如痕虫(Plasmodium spp·),包括恶性痕虫(P. falciparum);弓形虫(Toxoplasma spp·),包括鼠弓形虫(T. gondii)(例如 SAG2、SAG3、Tg34);内变形虫(Entamoeba spp.),包括痢疾内变形虫(E. histolytica);巴贝虫(Babesia spp·),包括果氏巴贝虫(B.mtcroti);锥虫(Trypanosoma spp.),包括克香氏锥虫(T. cruzi);贾第虫(Giardia spp.),包括表晚贾第虫(G. Iamblia);利什曼虫(Leishmania spp·),包括硕大利什曼虫(L. major);肺囊虫(Pneumocystis spp.),包括卡氏肺囊虫(p. carinii);毛滴虫(Trichomonas spp.),包括阴道毛滴虫(T. vaginalis);血吸虫(Schisostoma spp·),包括曼氏血吸虫(S. mansoni),或来源于酵母,如假丝酵母(Candida spp.),包括白色假丝酵母(C. albicans);隐球酵母(Cryptococcus spp.),包括新型隐球酵母(C. neoformans)。结核分枝杆菌(M. tuberculosis)的其它优选特异性抗原是例如TbRal2、Tb H9、Tb Ra35、Tb38_l、Erd 14、DPV、MTI, MSL, mTTC2 和 hTCCl (WO 99/51748)，Mtb72F 和 M72。结核分枝杆菌的蛋白还包括融合蛋白和其变体，其中结核分枝杆菌的至少两个，优选三个多肽融合成一个更大的蛋白。优选的融合体包括Ral2-TbH9-Ra35、Erdl4-DPV_MTI、DPV-MTI-MSL, Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erdl4-DPV-MTI_MSL、DPV-MTI-MSL_mTCC2、TbH9-DPV-MTI (W099/51748)。可以提到的特定 Ral2_Tbh9_Ra35 序列是 TO2006/117240 中定义为SEQ ID No 6的序列以及其变体(其中该序列的Ser 704突变为丝氨酸以外的氨基酸，如Ala)和衍生物，所述衍生物中掺入了合适长度的N末端His标记(如W02006/117240的 SEQ ID No 2 或 4)衣原体如沙眼衣原体的示例性抗原选自CT858，CT 089,CT875,MOMP,CT622,PmpD,PmpG及其片段，SffIB和其任一免疫原性片段(如PmpDpd和PmpGpd)及其组合。抗原的优选组合包括CT858，CT089和CT875。可以采用的特定序列和组合描述于W02006/104890。优选的细菌组合物包含源自嗜血菌(Haemophilus spp)的抗原，包括B型流感嗜血菌(例如PRP及其缀合物)、不可分型的流感嗜血菌，例如0MP26、高分子量粘附素、P5、P6、D蛋白和脂蛋白D，以及丝束蛋白和丝束蛋白衍生的肽(US 5，843，464)或多重拷贝变体或其融合蛋白。こ型肝炎表面抗原的衍生物是本领域熟知的，且尤其包括，在欧洲专利申请EP-A-414374、EP-A-0304578 和 EP 198-474 中所列出的 PreSl、PreS2S 抗原。在一个优选方面，本发明的疫苗制剂包含HIV-I抗原、gpl20，尤其是在CHO细胞中表达时。在另ー个实施方案中，本发明的组合物包含如上文所述的gD2t。组合物还可包含抗肿瘤抗原，并用于癌症的免疫治疗性治疗。例如，所述抗原可为肿瘤排斥抗原，例如针对前列腺癌、乳癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑素瘤的抗原。示例性的抗原包括MAGEI、MAGE3和MAGE4或例如公开于W099/40188中的其它MAGE抗原、PRAME, BAGE, Lage (也称为 NY Eos I)、SAGE 和 HAGE (W099/53061)或 GAGE (Robbins和 Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8,628-636 页；Van den Eynde 等，International Journal of Clinical&Laboratory Research (1997 年提父ノ ；Correale 等(1997), Journal of the National Cancer Institute 89,293 页)。实际上，这些抗原在广泛的肿瘤类型中表达，如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。用于本发明的MAGE抗原可与表达增强子或免疫融合配偶体一起作为融合蛋白表达。具体地说，Mage蛋白可融合至B型流感嗜血菌的D蛋白或其脂质化衍生物。具体地说，融合配偶体可包含D蛋白的前1/3。此结构公开于WO 99/40188。其它肿瘤特异性抗原包括但不限于KSA(GA733)肿瘤特异性神经节苷脂，例如GM2和GM3或其与运载蛋白的缀合物；或者所述抗原可以是自身肽激素，如全长促性腺激素释放激素(GnRH，W095/20600)，其是10个氨基酸长的短肽，用于治疗许多癌症，或用于免疫去势。在一个优选实施方案中，利用前列腺抗原，例如前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、PSCA(PNAS 95 (4) 1735-17401998)、PSMA 或称为 Prostase 的抗原。Prostase是前列腺特异性丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶样)，254个氨基酸长，具有保守的丝氨酸蛋白酶催化三联体H-D-S和氨基末端前-肽原序列，显示潜在的分泌功能(P. Nelson,Lu Gan,C. Ferguson,P. Moss,R. Gelinas,L. Hood&K. Wand, “Molecular cloningand characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease withprostate restricted expression，，，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119)。已经描述了推定的糖基化位点。预测的结构非常类似于其它已知的丝氨酸蛋白酶，表明成熟多肽折叠成单个结构域。成熟蛋白为224个氨基酸长，具有一个显示被天然加工的A2表位。Prostase核苷酸序列和推定的多肽序列和同源物公开于Ferguson等(Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1999，96，3114-3119)和国际专利申请号 WO 98/12302 (以及相应的授权专利 US 5, 955, 306) ,WO 98/20117 (以及相应的授权专利 US 5，840，871 和 US5, 786，148)(前列腺特异性激肽释放酶)和WO 00/04149 (P703P)。本发明提供含基于Prostase蛋白及其片段和同源物(“衍生物”)的含Pro stase蛋白融合体的组合物。这种衍生物适用于适合治疗前列腺肿瘤的治疗性疫苗制剂。典型地，所述片段将含如在以上引用的专利和专利申请中公开的至少20个、优选50个、更优选100个连续氨基酸。再优选的前列腺抗原称为P501S，即WO 98/37814的序列标识号113。免疫原性片及其部分含如以上引用的专利申请中公开的至少20个、优选50个、更优选100个连续氨基酸。參见例如 PS108 (W098/50567)。其它前列腺特异性抗原可从WO 98/37418和W0/004149得知。另ー个是STEAP(PNAS 9614523145287-121999)。在本发明范围中有用的其它肿瘤相关抗原包括Plu-l (J Biol. Chem274(22) 15633-15645，1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto (Salomon 等，Bioessays 199，2161-70，美国专利5654140)、Criptin (美国专利5981215)。另外，与癌症治疗特别相关的
抗原还包括酪氨酸酶和存活蛋白。粘蛋白衍生的肽如Mucl 參见例如 US 5744，144、US 5827，666、WO 8805054、US4，963，484。特别考虑的是Mucl衍生肽，其包含Mucl肽的至少ー个重复单元，优选至少两个这种重复单元，其可被SM3抗体识别(US 6054438)。其它粘蛋白衍生肽包括来自Muc5的肽。本发明抗原可为乳癌抗原，如Her-2/Neu、乳腺珠蛋白(美国专利5668267)或在W000/52165、W099/33869、W099/19479、W098/45328 中公开的抗原。Her 2neu 抗原特别地公开于美国专利5，801，005。优选地，Her 2neu包含完整胞外结构域(包含大约氨基酸1_645)或其片段，以及大约C末端580个氨基酸的至少免疫原性部分或完整胞内结构域。具体地说，胞内部分应包含磷酸化结构域或其片段。这种构建体公开于W000/44899。ー种特别优选的构建体被称为ECD PD，第二种被称为ECD PD。參见W000/44899。在此使用的Her_2neu可来源于大鼠、小鼠或人类。所述组合物可包含与肿瘤支持机制(例如血管生成、肿瘤侵入)相关的抗原，例如tie2、VEGF。可预见的是,本发明的组合物可使用来源于博氏疏螺旋体(Borrelia sp.)的抗原。例如，抗原可包括核酸、病原体衍生的抗原或抗原制备物、重组生产的蛋白或肽以及嵌合融合蛋白。具体地说，所述抗原是OspA。OspA可为借助于宿主细胞(大肠杆菌)的脂质化形式的完整成熟蛋白，称为(Lip0-OspA)，或者可为非脂质化的衍生物。此非脂质化衍生物包括具有流感病毒非结构蛋白(NSl)的前81个N-末端氨基酸的非脂质化NSl-OspA融合蛋白、完整OspA蛋白以及另ー个MDP-OspA，MDP-OspA是携带3个额外的N-末端氨基酸的OspA的非脂质化形式。本发明的组合物可用于变态反应的预防或治疗。这种疫苗应包含变应原特异性抗原(例如Der pi)和变应原非特异性抗原(例如来源于人IgE的肽，包括但不限于stanworth 十月太(EP 0477231B1))。本发明的组合物还可用于变态反应、癌症或感染性疾病之外的慢性疾病的预防或治疗。这种慢性疾病是诸如动脉硬化和阿尔茨海默病的疾病。本发明的组合物特别适合于诸如慢性病症和癌症的疾病的免疫治疗性治疗，而且适合于持续感染的治疗。因此，本发明的组合物特别适合于感染性疾病的免疫治疗，所述感染性疾病例如为结核病(TB)、AIDS和こ型肝炎(HepB)病毒感染。另外，在AIDS背景下，提供一种治疗易 感或患有AIDS的个体的方法。该方法包括给予所述个体本发明的疫苗，由此降低由随后的HIV感染引起的CD4+T细胞减少量，或者减慢或阻止已感染HIV的个体中的⑶4+T-细胞減少。除了上述肺炎球菌抗原以外(包括或不包括肺炎球菌抗原)，其它抗原包括细菌(优选荚膜)糖类。多糖抗原吸附到磷酸铝上，便利地储存于原液中-因此通过将所述原液与本发明的含油乳液即时混合直接产生本发明的疫苗组合物。优选地，所述其它细菌糖类选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A荚膜糖类(MenA)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型C荚膜糖类(MenC)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型Y荚膜糖类(MenY)、脑膜炎奈瑟氏球菌血清型W-135荚膜糖类(MenW)、B族链球菌I组荚膜糖类、B族链球菌II组荚膜糖类、B族链球菌III组荚膜糖类、B族链球菌IV组荚膜糖类、B族链球菌V组荚膜糖类、金黄色葡萄球菌5型荚膜糖类、金黄色葡萄球菌8型荚膜糖类、得自伤寒沙门氏菌的Vi糖类、脑膜炎奈瑟氏球菌LPS、卡他莫拉菌LPS和流感嗜血菌LPS。所述LPS是指天然脂多糖(或脂寡糖)或其中脂质A部分已通过众多已知方法中的任ー种解毒的脂多糖(參见例如WO 97/18837或WO 98/33923)，或任何包含来源于所述LPS的O-多糖的分子。所述脑膜炎奈瑟氏球菌LPS是指12种已知免疫型(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11 或 L12)中的 I 种或多种。特别优选的组合是含以下组分的组合物1)缀合的Hib、缀合的MenA和缀合的MenC ；2)缀合的Hib、缀合的MenY和缀合的MenC ；3)缀合的Hib和缀合的MenC ;和4)缀合的MenA、缀合的MenC、缀合的MenY和缀合的MenW_135。在每种上述缀合物中的PS量可为每O. 5mL人剂量各5或10 μ g。优选地，Hib、MenA、MenC、Menff-135和MenY是TT缀合物。与多糖接种方法有关的问题是多糖本身为弱免疫原这一事实。为克服此问题，可将本发明的糖类与蛋白载体缀合，所述载体可提供旁观T细胞辅助作用。因此，优选本发明所用的糖类连接至这种蛋白载体。目前常用于产生糖类免疫原的这类载体的实例包括白喉类毒素和破伤风类毒素(分别为DT、DT CRM197和TT)、匙孔血蓝蛋白(KLH)、来自流感嗜血杆菌的D蛋白(EP 594610-B)、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的OMPC以及結核菌素的纯化蛋白衍生物(pro)。所述糖类可通过任何已知方法(例如Likhite的美国专利4，372, 945和Armor等的美国专利4，474，757中的方法)连接至载体蛋白。优选地，可进行CDAP缀合(W095/08348)。优选地，所述缀合物的蛋白糖类(重量重量)比例是0.3 1-1 1，更优选0.6 1-0. 8 1，最优选约 O. 7 I。本发明包括提供抗肺炎球菌和不同病原体的保护作用的抗原組合。目前许多儿科疫苗以联合疫苗形式给子，以减少儿童必须接受的注射次数。因此，对于儿科疫苗来说，来自其它病原体的其它抗原可以与本发明的肺炎球菌疫苗一起配制。例如，本发明的疫苗可以用公知的‘三价’联合疫苗配制(或同一时间分别给予)，该联合疫苗包含白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)和百日咳成分[通常是去毒的百日咳类毒素(PT)和丝状血细胞凝集素(FHA)，以及任选的百日咳外膜蛋白(pertactin，PRN)和/或凝集素1+2]，例如市售疫苗 INFANRIX-DTPa (SmithKlineBeecham Biologicals)，其包含 DT、TT、PT、FHA 和 PRN抗原，或带有完整细胞百日咳组分，例如SmithKlineBeecham Biologicals s. a.销售的Tritanrix。联合疫苗还可以包含其它抗原，如こ型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髄灰质炎病毒抗原(例如灭活的三价脊髓灰质炎病毒-IPV)、卡他莫拉菌外膜蛋白、不可分型的流感嗜血菌蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白。
可包含在联合疫苗中(特别是用于预防中耳炎)的优选卡他莫拉菌蛋白抗原的实例为OMP106 [WO 97/41731 (Antex)和 WO 96/34960 (PMC) ] ；0MP21 ;LbpA 和/或 LbpB [TO98/55606 (PMC) ] ；TbpA 和/或 TbpB [W0 97/13785 和 WO 97/32980 (PMC) ] ；CopB [HelminenME 等，(1993) Infect. Immun. 61 :2003-2010] ;UspAl 和/或UspA2 [W093/03761 (德克萨斯大学)]；0mpCD ；HasR(PCT/EP99/03824) ；PilQ(PCT/EP99/03823) ；0MP85 (PCT/EP00/01468)；lipo06(GB 9917977. 2) ；lipolO(GB 9918208. I) ；lipoll (GB 9918302. 2) ；lipol8(GB9918038.2) ；P6 (PCT/EP99/03038) ；D15 (PCT/EP99/03822) ；0mplAl(PCT/EP99/06781)；Hly3 (PCT/EP99/03257)和OmpE。可包含在联合疫苗(特别是用于预防中耳炎)中的不可分型的流感嗜血菌抗原的实例包括丝束蛋白[(US 5766608-俄亥俄州研究基金会)]和含来自该蛋白的肽的融合体[例如LBl (f)肽融合体；US 5843464 (OSU)或WO 99/64067]；0MP26 [W0 97/01638 (Cortecs)] ；P6 [EP 281673 (纽约州立大学)];TbpA 和/或 TbpB ;Hia ;Hsf ；Hin47 ；Hif ；Hmwl ；Hmw2 ；Hmw3 ；Hmw4 ；Hap ；D15(W0 94/12641) ;D 蛋白(EP 594610) ；P2和 P5(W094/26304)。考虑的其它组合是本发明的肺炎链球菌糖类和蛋白与病毒抗原的组合，所述病毒抗原例如来自流感病毒(减毒的、裂解的或亚单位的)[例如表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA) ] ο 參见例如Chaloupka I.等，Eur. Journal Clin. Microbiol.Infect. Dis. 1996,15 :121-127] ;RSV(例如 F 和 G 抗原或 F/G 融合体，參见例如=SchmidtA.C.等，J Virol，2001 年 5 月，4594-4603 页);PIV3 (例如 HN 和 F 蛋白，參见 Schmidt 等，出处同上)；水痘病毒(例如减毒的、糖蛋白I-V等)以及MMR(麻疹、流行性腮腺炎、风疹)的任意(或全部)组分。本发明意欲用于整体治疗或预防中耳炎的优选儿科联合疫苗包含ー种或多种肺炎链球菌糖类抗原(优选缀合至D蛋白)、ー种或多种肺炎球菌蛋白(优选上述肺炎球菌蛋白)和ー种或多种来自卡他莫拉菌和/或非典型流感嗜血菌的表面暴露抗原。D蛋白可有利地用作肺炎球菌糖类(如上所述)的蛋白载体，因为其自身为能够产生B细胞介导的抗非典型流感嗜血菌(ntHi)保护作用的免疫原。卡他莫拉菌或非典型流感嗜血菌抗原可包含在亚单位形式的疫苗中，或者可作为存在于由细菌制备的外膜囊泡(疱)表面上的抗原被加入。用于本发明接种的免疫原性组合物的免疫原性特性在本发明中，相比于用不含佐剂，即不含任何外源佐剂的对应组合物(本文也称为‘普通组合物’)获得的⑶4T-细胞免疫应答，免疫原性组合物优选能够诱导抗至少ー种组分抗原或抗原性组合物的改进的CD4 T-细胞免疫应答。在ー种特定实施方案中，当免疫原性组合物是流感组合物，并且当流感疫苗制剂是来自几种流感病毒株(其中之一是大流行株)时，所述改进的CD4 T-细胞免疫应答是针对大流行流感病毒株。所述“改进的CD4T-细胞免疫应答”是指在给予含有佐剂的免疫原性组合物之后在哺乳动物中获得的CD4应答高于在给予不含佐剂的相同组合物后获得的CD4应答。例如，与给予包含流感病毒或其抗原性制剂并且不含佐剂的免疫原性组合物之后诱导的应答相比，在给予包含流感病毒或其抗原性制剂以及佐剂的免疫原性组合物后在人类患者中获得更高的CD4 T-细胞应答。这种制剂将有利地用于诱导抗流感病毒的CD4-T细胞应答，该应答能够检测由MHC II类分子呈递的流感表位。具体地但非排它性地，所述‘改进的⑶4 T-细胞免疫应答’在免疫学上未初免的患者(即对所述抗原为血清阴性的患者)中获得。此血清阴性可能是从未面对这种病毒或抗原的所述患者(所谓的‘原初’患者)的结果，或者是在遭遇时不能对所述抗原应答的所述患者的結果。在ー个特定方面，在免疫受损的受试者，如老年人，典型是65岁或年龄更大，或具有高危医学状况的小于65岁的成人(“高危”成人)或2岁以下幼儿中获得所述CD4T-细胞免疫应答。改进的⑶4 T-细胞免疫应答可通过检测产生任何以下细胞因子的细胞数来评价·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL_2、IFN Y , TNF α )的细胞·产生至少CD40L和另ー种细胞因子(IL-2、TNF a , IFN Y )的细胞·产生至少IL-2和另ー种细胞因子(CD40L、TNF a , IFN Y )的细胞·产生至少IFNy和另ー种细胞因子(IL_2、TNFa、⑶40L)的细胞·产生至少TNF a和另ー种细胞因子(IL-2、CD40L、IFN Y )的细胞当与给予不含佐剂的组合物相比在给予含有佐剂的组合物后产生任何以上细胞因子的细胞的量较高时，将存在改进的CD4 T-细胞免疫应答。通常，上文提及的5种状况中的至少ー种、优选两种将被实现。在ー个具体实施方案中，与无佐剂组相比，含有佐剂的组中生产全部4种细胞因子的细胞将以更高量存在。由本发明的含有佐剂的流感组合物赋予的改进的CD4 T-细胞免疫应答理想地可在单次给予后获得。例如在快速发展的爆发情况下单剂方法将有极为重大的意义。在某些情况下，尤其是对于老年人群，或者对于首次进行抗流感接种的小孩(9岁以下)或在大流行的情况下，给予两剂相同的用于该季的组合物可能是有益的。第二剂所述相同组合物(仍被看作是‘用于首次接种的组合物’)可在初次免疫应答正在发展的过程中给予，并有足够的时间间隔。通常，第二剂组合物在首剂后数周或约I个月(例如首剂后2周、3周、4周、5周或6周)给予，以帮助激发无应答或低应答个体的免疫系统。在另ー实施方案中，与用不含佐剂的组合物免疫的个体中诱导的B记忆细胞应答相比，给予所述免疫原性组合物在给予含有佐剂的免疫原性组合物的患者中诱导改进的B-记忆细胞应答。改进的B-记忆细胞应答意指在遭遇抗原时能够分化为分泌抗体的浆细胞的外周血B淋巴细胞的频率增加，这通过体外分化刺激进行检测。
在另ー实施方案中，与用不含佐剂的组合物免疫的个体中诱导的体液应答相比，给予所述免疫原性组合物在给予含有佐剂的免疫原性组合物的患者中诱导改进的体液应答。所述体液免疫应答可以根据实施例I，特别是I. 1(1. I. 1)、I.2(I.2. I)和I. 3 (I. 3. 5. 2)部分详细描述的任何程序进行测量。当免疫原性组合物是流感病毒组合物时，特别地，所述体液应答是针对同源或异源病毒株获得的。具体地，所述异源体液免疫应答表示流感病毒株之间的体液应答，并且称作“交叉反应性”体液免疫应答。所述“交叉反应性”体液免疫应答涉及诱导抗ー种流感病毒株的应答，所述流感病毒株是用于接种的流感病毒株的变体(漂移)。所述应答的一个实例在实施例III. 3. I和图2中举例说明。在ー种特定实施方案中，给予所述含有佐剂的免疫原性组合诱导以下应答中的至少两种与用不含佐剂，即不含任何外源佐剂的相应组合物(本文也称作“普通组合物”)相比，⑴改进的⑶4 T-细胞免疫应答，(ii)改进的B-记忆细胞应答，(iii)改进的针对至少ー种组分抗原或抗原性组合物的体液应答。 在进ー步的特定实施方案中，采用用于第一次接种的含佐剂的组合物进行接种，对CD8应答没有可测量的影响。本发明的ー个特定实施方案是用以脂质体形式存在的皂苷佐剂，特别是胆固醇猝灭形式的QS21皂苷配制包含流感病毒或其抗原性制剂的组合物，能够在免疫受损的人群中有效促进T细胞应答。在一种实施方案中，所述佐剂进ー步包含3D-MPL。具体地，通过流感疫苗保护的关联性评价，与用不含佐剂的流感疫苗接种相比，给予单剂如本发明所述的用于首次接种的免疫原性组合物，在对老年人群进行抗流感接种后能够提供更好的血清保护作用。相比于用不含佐剂的制剂获得的免疫应答，要求保护的含有佐剂的制剂还能够诱导抗流感病毒的改进的CD4 T-细胞免疫应答。该观察结果可能与接种或由于流感抗原暴露导致的感染时增加的应答性相关。而且，其还可能与交叉反应性相关，即对变体流感株应答的能力较高。这种改进的应答可能在免疫受损的人群如老年人群(65岁和以上)以及尤其是高危老年人群中特别有益。这可导致降低整体的发病率和死亡率，并防止肺炎和其它流感类疾病的紧急入院。这还可对婴儿群体(5岁以下，优选2岁以下)有益。而且，与用不含佐剂的制剂诱导的应答相比，其允许诱导时间更持久的CD4T细胞应答，例如在首次接种后I年仍存在。在ー个特定方面，CD4T-细胞免疫应答，例如在未初免受试者中获得的改进的CD4T-细胞免疫应答，包括诱导交叉反应性CD4T辅助细胞应答。具体地说，增加交叉反应性CD4T细胞的量。所述‘交叉反应性’ CD4应答指CD4 T-细胞靶向流感株之间的共有表位。通常，可用的流感疫苗通常仅有效对抗具有相似抗原性特征的血细胞凝集素的流感病毒感染株。当感染(循环)性流感病毒已经历了表面糖蛋白(具体地说是血细胞凝集素)的微小变化(例如点突变或点突变的累积，导致例如氨基酸改变)时(抗原漂移变体病毒株)，疫苗仍可提供一些保护作用，但其可能仅提供有限的保护作用，因为新产生的变体可能逃脱先前流感感染或接种诱导的免疫性。抗原漂移是两次大流行期间发生的年度流行的原因(ffiley&Skehel, 1987，Ann. Rev. Biochem. 56，365-394)。交叉反应性 CD4T 细胞的诱导为本发明组合物提供了额外的优势，因为其还可提供交叉保护作用，换句话说是抗异源感染的保护作用，所述异源感染即由为免疫原性组合物中包含的流感病毒株的变体(例如漂移变体)的循环流感病毒株引起的感染。这在循环毒株难以在卵中繁殖或难以在组织培养物中生产时可能是有利的，使漂移株用作备选工作株。这在受试者以几个月或一年间隔接受第一次和第二次接种时也可能有利，用于第二次免疫的免疫原性组合物中的流感株是用于首次接种的组合物中使用的毒株的漂移变体株。因此，本文定义的含有佐剂的流感免疫原性组合物具有更高的诱导接种的老年受试者中的血清保护和交叉反应性CD4T细胞的能力。这种特征可能与针对免疫原性组合物中存在的病毒株的变异株的更高应答能力相关。可以证 实这是大流行情况下的重要优点。例如，包含H5、H2、H9、H7或H6株中的任一或几个株的多价流感免疫原性组合物在接种后或受到大流行变体，即所述大流行株的漂移株感染后，可以提供更高的针对所述漂移株的应答。用流感疫苗接种后交叉反应性CD4 T-细胞的检测能够识别同源和漂移的流感株两者的CD4 T-细胞在本文件中已命名为“交叉反应性”。如本文所述的含有佐剂的流感组合物己能够显示出异亚型的交叉反应性，因为存在可观测的抗漂移流感株的交叉反应性。如上所述，大流行疫苗制剂有效对抗漂移大流行株的能力在大流行情况下可证明是重要的特征。与以上观测结果相一致，已在人中鉴别出不同流感株共有的CD4T-细胞表位(Gelder C 等，1998，Iht Immunol. 10(2) :211-22 ；Gelder CM 等，1996 J Virol. 70(7)4787-90 ；Gelder CM 等，1995 J Virol. 199569(12) :7497-506)。在ー个特定实施方案中，含有佐剂的组合物可提供额外益处，该益处提供了抗循环株的更好的保护作用，所述循环株经历了血细胞凝集素的大改变(例如基因重组，例如两个不同物种之间的基因重组)(抗原转变)，目前可用疫苗对其无效。再次接种和用于再次接种的组合物(加强组合物)在一种实施方案中，本发明提供流感病毒或其抗原性制剂在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再次接种先前用本文要求保护的免疫原性组合物接种过的人。在本发明的ー个方面，提供了来自第一次大流行的流感病毒株的流感病毒或其抗原性制剂在制备本文定义的含有佐剂的免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于提供抗流感病毒株导致的流感感染的保护作用，所述病毒株是所述第一次流感病毒株的变体。另ー方面，本发明提供流感病毒或其抗原性制剂在制备流感免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再次接种先前用本文要求保护的含佐剂的流感组合物或用含变异流感病毒株的含佐剂的流感组合物接种过的人，所述佐剂是本文定义的佐剂。另ー方面，本发明提供了对人群或个体进行抗ー种流感病毒株的接种，然后对所述人或人群进行抗变异流感病毒株的再次接种的方法，所述方法包括给所述人施用(i)第ー组合物，其包含来自第一流感病毒株的流感病毒或其抗原性制剂和本文定义的佐剂，和
(ii)第二免疫原性组合物，其包含所述第一流感病毒株的流感病毒株变体。在ー种特定实施方案中，所述第一病毒株与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的可能。在另ー特定实施方案中，所述变异株与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的可能。具体地，再次接种是用包含作为循环大流行株的至少ー种病毒株的流感组合物进行的。初免组合物和加强组合物都可以是多价的，即可以含有至少两种流感病毒株。当组合物是多价时，至少ー种病毒株与大流行爆发相关，或具有与大流行爆发相关的可能。通常，再次接种于首次接种后至少6个月进行，优选于首次接种后8-14个月进行，更优选于首次接种后约10-12个月进行。用于再次接种的免疫原性组合物(加强组合物)可包含任意类型的抗原制齐U，其是灭活的或者是减毒的活病毒。其可包含相同类型的抗原制剂，即分裂流感病毒或其分裂流感病毒抗原性制剂、全病毒体、纯化的HA和NA(亚单位)疫苗或病毒颗粒，作为首次接种用的免疫原性组合物。或者，加强组合物可包含首次接种所使用流感抗原类型之外的另ー种类型的流感病毒抗原，即分裂流感病毒或其分裂流感病毒抗原性制剂、全病毒体、纯化的HA和NA(亚单位)疫苗或病毒颗粒。优选地，使用分裂病毒或全病毒体疫苗。加强组合物可有佐剂或无佐剂。无佐剂的加强组合物可为肌内给予的Fluarix /a-Rix /Influsplit 。所述制剂包含3种由WHO推荐的合适流感季毒株制备的灭活分裂病毒体抗原。 加强组合物可含有佐剂或不含佐剂。在ー个特定实施方案中，加强组合物包含本文定义的皂苷佐剂。在ー个特定实施方案中，用于再次接种的免疫原性组合物(下文也称为‘加强组合物’)包含流感病毒或其抗原性制剂，它们与用于首次接种的流感病毒或其抗原性制剂共有共同的CD4 T-细胞表位。共同的CD4 T-细胞表位意指可由相同CD4细胞识别的不同抗原的肽/序列/表位(參见例如以下文献描述的表位Gelder C等，1998, IntImmunol. 10(2) :211-22 ；Gelder CM 等，1996J Virol. 70(7) :4787-90 ;Gelder CM 等，1995J Virol. 1995 69(12) :7497-506)。在本发明的一个实施方案中，加强组合物为ー种单价流感组合物，其包含与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能的流感株。具体地，加强组合物中的所述病毒株是循环大流行株。合适的病毒株是但不限于H5N1、H9N2、H7N7和H2N2。所述病毒株可与存在于首次接种用组合物中的病毒株相同，或与其中ー种病毒株相同。在ー个替代实施方案中，所述病毒株可为首次接种用组合物中存在的病毒株的变体株，即漂移株。在另ー个具体实施方案中，加强组合物为多价流感疫苗。具体地说，当加强组合物为多价疫苗如ニ价、三价或四价疫苗时，至少ー种病毒株与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能。在ー个具体实施方案中，加强组合物中的两种或多种病毒株是大流行株。在另ー个具体实施方案中，加强组合物中的至少ー种大流行株与首次接种用组合物中存在的病毒株相同，或与其中ー种病毒株相同。在一个备选实施方案中，至少ー种病毒株可为首次接种用组合物中存在的至少ー种大流行株的变体株，即漂移株。具体地，加强组合物中的至少ー种病毒株是循环大流行株。加强组合物可以含佐剂或不含佐剂。通常，加强组合物在使用时于下ー个流感季给予，例如在第一个免疫原性组合物之后约I年给予。加强组合物还可随后毎年给予(第三次、第四次、第五次接种等)。加强组合物可与用于首次接种的组合物相同。合适地，加强组合物包含流感病毒或其抗原性制齐U，其为用于首次接种的流感病毒的变异株。具体地说，流感病病毒株或其抗原性制剂按照世界卫生组织发布的參考材料选择，使得它们适合于在再次接种年循环的流感株。用于再次接种的流感抗原或抗原性组合物优选合适地包含上文描述的佐剂。所述佐剂可为如上文所述的以脂质体形式存在的皂苷，优选任选地包含额外的佐剂，如3D-MPL。一方面，相比于用无佐剂的流感病毒或其抗原性制剂第一次接种后诱导的等同应答，再次接种诱导以下的任ー种、优选两种或全部a)抗流感病毒或其抗原性制剂的改进的CD4应答，或(ii)改进的B细胞记忆应答或(iii)改进的体液应答。优选地，用本文定义的含有佐剂的流感病毒或其抗原性制剂再次接种后诱导的免疫应答高于用不含佐剂的组合物再次接种后诱导的对应应答。优选地，在用含有佐剂的、优选分裂的流感病毒组合物首次接种的人群中，用无佐剂的、优选分裂的流感病毒再次接种后诱导的免疫应答高于在用无佐剂的、优选分裂的流感病毒组合物首次接种的人群中的对应应答。
在ー个特定实施方案中，用含流感病毒和本文定义的脂质体形式的皂苷佐剂的加强组合物再次接种受试者显示出的抗体滴度高于用不含佐剂的组合物首次接种并用不含佐剂的组合物加强的人群中的对应值。佐剂增强针对再次接种的抗体应答的效カ在已知对流感病毒接种或感染具有低应答的老年人中尤其重要。就改善再次接种后的CD4 T-细胞应答而言，含有佐剂的组合物相关的益处也是显著的。具体地，相比于对照疫苗赋予的保护作用，本发明的含有佐剂的组合物能够诱导抗漂移株(下一流感季的流感株)的更好的交叉反应性。所述交叉反应性表现出的持久性比用无佐剂制剂获得的持久性高。所述佐剂增强抗漂移株的交叉反应性的作用对于大流行情况很重要。在再一个实施方案中，本发明涉及一种接种方案，其中首次接种用含至少ー种流感病毒株的流感组合物、优选分裂流感组合物进行，其中所述流感病毒株可能引起大流行爆发，再次接种用为大流行株或经典株的循环病毒株进行。HA中的CD4表位此抗原漂移主要存在于病毒表面蛋白血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)的表位区。已知被病毒用于逃避宿主免疫系统的适应性应答的不同流感株之间CD4和B细胞表位的任意差异都将在流感接种中起重要作用，并确实如此。已在人中鉴别出不同流感株共有的⑶4 T-细胞表位(參见例如Gelder C等，1998, Int Immunol. 10(2) :211-22 ；Gelder CM等，1996J Virol. 70(7) :4787-90 ;和GelderCM 等，1995 J Viroi. 199569(12) :7497-506)。在ー个具体的实施方案中，再次接种使用含流感病毒或其抗原性制剂的加强组合物进行，所述流感病毒或其抗原性制剂与用于第一次接种的流感病毒抗原或其病毒抗原性制剂共有共同的CD4 T-细胞表位。因此，本发明涉及含大流行流感病毒或其抗原性制剂和脂质体形式的皂苷，特别是胆固醇去毒形式的QS21，以及任选3D-MPL的免疫原性组合物在制备多剂疫苗的首次接种组分中的用途，所述多剂疫苗还包含作为加强剂量的流感病毒或其抗原性制剂，它们与第一次接种时所给予剂量的大流行流感病毒抗原或其病毒抗原性制剂共有共同的CD4 T-细胞表位。接种方法本发明的免疫原性组合物可通过任意合适的传递途径施用，例如皮内、粘膜如鼻内、ロ服、肌内或皮下。其它送递途径在本领域众所周知。肌内送递途径对含有佐剂的免疫原性组合物是优选的。皮内送递是另一个适宜的途径。任意合适的装置都可用于皮内传递，例如在US4, 886, 499,US 5，190, 52UUS 5, 328, 483,US 5, 527, 288,US 4, 270, 537,US 5, 015, 235,US5，141，496、US 5，417，662中描述的短针装置。皮内疫苗还可通过限制针头进入皮肤的有效穿透长度的装置施用，例如描述于W099/34850和EP1092444的装置及其功能等同物，这两个文献通过引用结合到本文中。射流喷射装置也是适宜的，其经液体射流喷射器或经刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针头传递液体疫苗至真皮。射流喷射装置描述于例如US5, 480, 38UUS 5, 599, 302,US 5,334，144,US 5, 993, 412,US 5, 649, 912,US 5,569，189,US5, 704, 91UUS 5, 383, 85UUS 5, 893, 397,US 5, 466, 220,US 5,339，163,US 5, 312, 335,US5, 503, 627,US 5, 064, 413,US 5, 520, 639,US 4, 596, 556,US 4, 790, 824,US 4, 941, 880,US4，940，460、W0 97/37705和WO 97/13537。喷射粉末/颗粒送递装置也是适宜的，其使用压缩气体加速粉末形式的疫苗通过皮肤外层至真皮。另外，常规注射器可用于皮内施用的经典結核菌素皮内试验法。另ー个合适的施用途径是皮下途径。任意合适的装置都可用于皮下送递，例如经典的针。优选地，使用例如在 WO 01/05453、W001/05452、WO 01/05451、WO 01/32243、WO 01/41840、WO 01/41839、WO 01/47585、WO 01/56637、WO 01/58512、WO 01/64269、WOO1/78810, WO 01/91835, WO 01/97884, WO 02/09796, WO 02/34317 中公开的无针射流喷射器装置。更优选地，所述装置用液体疫苗制剂预填充。或者，疫苗鼻内施用。典型地，疫苗局部施用于鼻咽部，优选没有吸入到肺中。理想的是使用将疫苗制剂送递入鼻咽部而没有或基本没有使其进入肺中的鼻内送递装置。本发明疫苗的优选鼻内施用装置是喷雾装置。适宜的商用鼻喷雾装置包括Accuspray (Becton Dickinson)。雾化器产生非常细小的雾滴,其可被轻易地吸入到肺中，因此不能有效到达鼻粘膜。因此不优选雾化器。用于鼻内用途的优选喷雾装置的性能与使用者提供的压カ无关。这些装置称为压カ阈装置。只有在提供阈压カ时才由喷嘴释放液体。这些装置更容易获得液滴大小规则的喷雾。适用于本发明的压カ阈装置在本领域是已知的，描述于例如WO 91/13281和EP311863B和EP516636，这些文献通过引用结合到本文中。这种装置可由Pfeiffer GmbH购买，还描述于 Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, 1999 年 9 月。优选的鼻内装置产生的液滴(使用水作为液体检测)范围为1-200μηι,优选10-120 μ m。小于10 μ m存在吸入风险，因此理想的是10 μ m以下的液滴不超过约5%。120μπι以上的液滴扩散得不如较小的液滴好，所以理想的是120 μ m以上的液滴不超过约5%。双剂量送递是用于本发明疫苗的鼻内送递系统的更优选特征。双剂量装置包含单剂疫苗的两个亚剂量，每个鼻孔施用一个亚剂量。一般来说，两个亚剂量存在于ー个容器中，装置的构造允许每次有效送递单个亚剂量。或者，可使用单剂量装置施用本发明疫苗。或者，本发明还设想了表皮或透皮接种途径。在本发明的ー个具体实施方案中，首次施用的含有佐剂的免疫原性组合物可肌内施用，含有佐剂的或不含佐剂的的加强组合物可通过不同途径施用，例如皮内、皮下或鼻内。在另ー个具体实施方案中，首次施用的组合物可包含每个流感病毒株15 μ g的标准HA含量，加强组合物可包含低剂量的HA，即低于15 μ g，并根据施用途径可以较小体积施用。接种群体接种的目标群体可为免疫受损的人。和健康成人相比，免疫受损的人一般不能很好地对抗原、尤其是流感抗原应答。优选地，目标群体是未进行抗流感初免的群体，他们或者是原初态的(例如相对于大流行病毒株)，或者先前不能对流感感染或接种应答。优选地，目标群体是老年人，合适地为65岁和以上，较年轻的高危成人(即18-64岁)，例如在健康机构工作的人，或者具有高危因素如心血管病和肺病或糖尿病的年轻成人。另ー个目标群体是所有6个月和以上的儿童，尤其是6-23个月龄的儿童，他们经历了相对高的流感相关住院率。优选地，目标群体是65岁以上的老年人。接种方案、给药和附加的效カ标准合适地，本发明的免疫原性组合物在大部分情况下为标准0.5ml注射剂量，根据单辐射免疫扩散(SRD) (J. M. Wood 等J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247 ；J. M. Wood 等，J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)检测，含各个流感株的15 μ g血细胞凝集素抗原组分。合适地，疫苗剂量体积在O. 5ml至Iml之间,具体地说是标准O. 5ml或O. 7ml疫苗剂量体积。根据原液样品中的HA浓度，可常规地轻微调整剂量体积。合适地，所述免疫原性组合物含低剂量的HA抗原一例如每流感病毒株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 或 14μ gHA 中的任ー个剂量。有利地，本发明的疫苗剂量，尤其是低剂量疫苗，可以以比一般为每剂约0. 5、
0.7或Iml的常规注射分裂流感疫苗小的体积提供。本发明的小体积剂量优选每剂不到500 μ 1，更优选每剂不到300 μ 1，最优选每剂不超过约200 μ I或以下。因此，按照本发明ー个方面的优选小体积疫苗剂量是在小体积中具有低抗原剂量的剂量，例如在约200 μ I体积中有约15 μ g或约7. 5 μ gHA或约3. O μ gHA (每病毒株)。本发明的流感药物优选满足疫苗的某些国际标准。国际上应用了检测流感疫苗效カ的标准。在下表I中显示了有效抗流感疫苗的欧盟官方标准。理论上，为满足欧盟要求，对疫苗中包含的所有流感株来说，流感疫苗仅需满足表中的ー项标准。本发明的组合物合适地满足这些标准中的至少ー项。然而，在实践中，所有病病毒株必须满足所述标准中的至少两项或全部三项，特别是对于新型疫苗(例如经不同途径送递的新型疫苗)而言。在某些情况下，两项标准可能足够了。例如，可以接受所有病病毒株满足三项标准中的两项，而部分但不是全部病病毒株满足第三项标准(例如三种病病毒株中的两种)。对成年人群体(18-60岁)和老年人群体(大于60岁)的要求是不同的。表I
权利要求
1.适于人类使用的剂量体积的免疫原性组合物，包含与佐剂组合的抗原或抗原性制齐IJ，所述佐剂包含免疫活性皂苷级分和脂多糖，所述皂苷级分来源于南美皂皮树的树皮并以脂质体形式存在，其中所述皂苷级分和所述脂多糖都以低于30 y g的水平存在于所述人类剂量中。
2.权利要求I的免疫原性组合物，其中所述佐剂组合物进一步包含留醇，其中皂苷甾醇的比是I : 1-1 : 100w/wo
3.权利要求2的免疫原性组合物，其中皂苷甾醇的比是I: 1-1 10w/w。
4.权利要求2的免疫原性组合物，其中皂苷甾醇的比是I: 1-1 5w/w。
5.权利要求1-4的任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫活性皂苷级分是QS21。
6.权利要求2-5的任一项的免疫原性组合物，其中所述留醇是胆固醇。
7.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述脂多糖是脂质A衍生物。
8.权利要求7的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。
9.权利要求7或8的免疫原性组合物，其中QS21 3D-MPL的比是I : I。
10.权利要求1-9的任一项的免疫原性组合物，进一步包含载体。
11.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以l-30i!g的量存在。
12.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以25y g的量存在。
13.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以1-15^g的量存在。
14.权利要求13的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以IOyg的量存在。
15.权利要求13的免疫原性组合物，其中所述脂多糖以g的量存在。
16.权利要求11-15的任一项的免疫原性组合物，其中所述脂多糖是脂质A衍生物。
17.权利要求16的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。
18.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述皂苷以1-25Ug的量存在。
19.权利要求18的免疫原性组合物，其中所述皂苷以25iig的量存在。
20.权利要求18的免疫原性组合物，其中所述皂苷以I-IOiig的量存在。
21.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述皂苷以IOiig的量存在。
22.权利要求20的免疫原性组合物，其中所述皂苷以5u g的量存在。
23.权利要求18-22的任一项的免疫原性组合物，其中所述免疫活性皂苷级分是QS21。
24.前述任一项权利要求的免疫原性组合物，其中所述适于人类使用的剂量体积是0. 5-1. 5ml o
25.权利要求24的免疫原性组合物，其中所述剂量体积是0.5ml。
26.权利要求24的免疫原性组合物，其中所述剂量体积是0.7ml。
27.权利要求24的免疫原性组合物，其中所述剂量体积是I.0ml。
28.以适用于人类剂量的免疫原性组合物的体积存在的佐剂组合物，包含l-30i!g脂多糖和1-30 y g以脂质体形式存在的免疫活性皂苷级分。
29.权利要求28的佐剂组合物，其中所述脂多糖是脂质A衍生物。
30.权利要求29的佐剂组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。
31.权利要求28-30的任一项的佐剂组合物，其中所述免疫活性皂苷级分是QS21。
32.权利要求28-31的任一项的佐剂组合物，其中所述脂多糖和所述免疫活性皂苷级分以相同量存在于佐剂组合物中。
33.权利要求28-32的任一项的佐剂组合物，其中所述适用于人类剂量的体积是250 μ I。
34.权利要求28-32的任一项的佐剂组合物，其中所述适用于人类剂量的体积是360 μ I ο
35.权利要求28-34的任一项的佐剂组合物，其中所述脂多糖以25μ g的量存在。
36.权利要求28-34的任一项的佐剂组合物，其中所述脂多糖以10μ g的量存在。
37.权利要求28-34的任一项的佐剂组合物，其中所述脂多糖以5μg的量存在。
38.权利要求28-37的任一项的佐剂组合物，其中所述免疫活性皂苷以25μ g的量存在。
39.权利要求28-37的任一项的佐剂组合物，其中所述免疫活性皂苷以10μ g的量存在。
40.权利要求28-37的任一项的佐剂组合物，其中所述免疫活性皂苷以5μ g的量存在。
41.权利要求1-27的任ー项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于水痘-帯状疱疹病毒(VZV)。
42.权利要求1-27的任ー项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于肺炎链球菌。
43.权利要求1-27的任ー项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于巨细胞病毒(CMV)。
44.权利要求1-27的任ー项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于恶性疟原虫。
45.权利要求1-27的任ー项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于流感病毒。
46.权利要求1-27的任ー项的免疫原性组合物，其中所述抗原或抗原性制剂来源于人乳头瘤病毒(HPV)。
47.免疫原性组合物，包含与佐剂组合物组合的流感病毒或其抗原性制剂，所述佐剂组合物包含以脂质体形式存在的免疫活性皂苷。
48.权利要求47的免疫原性组合物，其中所述佐剂进ー步包含脂质A衍生物。
49.权利要求48的免疫原性组合物，其中所述脂质A衍生物是3D-MPL。
50.(a)抗原或其抗原性制剂和(b)权利要求1-49的任一项定义的佐剂在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于诱导人类的以下至少ー种或至少两种或全部应答(i)改进的针对所述抗原或其抗原性制剂的CD4T-细胞免疫应答，(ii)改进的针对所述抗原或其抗原性制剂的体液免疫应答，(iii)改进的针对所述抗原或其抗原性制剂的B-记忆细胞应答。
51.接种方法，包括给有需要的个体或群体送递抗原或抗原性组合物，和权利要求1-49的任一项定义的佐剂。
52.权利要求50或51的用途或方法，所述用途或方法是用于老年人或免疫受损的人类个体或群体。
53.权利要求50-52的任ー项的用途或方法，其中所述免疫原性组合物的施用诱导改进的CD4T细胞免疫应答和改进的B-记忆细胞应答。
54.权利要求50-53的任ー项的用途或方法，其中所述CD4T-细胞免疫应答涉及诱导交叉反应性CD4T辅助细胞应答。
55.权利要求50-54的任ー项的用途或方法，其中所述体液免疫应答涉及诱导交叉反应性体液免疫应答。
56.权利要求50-55的任ー项的用途或方法，其中所述目标群体是超过65岁的老年人。
57.权利要求50-56的任ー项的用途或方法，用于提供抗病原体引起的感染或疾病的保护作用，所述病原体是免疫原性组合物中的抗原所来源的病原体的变体。
58.权利要求50-56的任ー项的用途或方法，用于提供抗病原体引起的感染或疾病的保护作用，所述病原体包含抗原，所述抗原是免疫原性组合物中的抗原的变体。
59.权利要求57或58的任ー项的用途或方法，其中再次接种后的免疫应答是以下任意ー种或两种或全部改进的针对所述抗原或抗原性制剂的CD4应答、改进的体液应答或改进的B细胞记忆应答。
60.权利要求57或58的用途或方法，其中所述保护作用是通过受感染个体或群体的体温而评估的。
61.权利要求1-60的任一项的组合物、用途或方法，其中所述免疫原性组合物包含具有CD4T细胞表位的抗原。
62.权利要求1-60的任一项的组合物、用途或方法，其中所述免疫原性组合物包含具有B细胞表位的抗原。
63.ー种抗原在制备免疫原性组合物中的用途，所述免疫原性组合物用于再次接种以前用抗原或抗原性组合物或其片段或变体和权利要求1-49的任ー项所定义的佐剂接种过的个体。
64.权利要求63的用途，其中所述用于再次接种的抗原与用于前一次接种的抗原或抗原性组合物具有共同的CD4T-细胞表位。
65.权利要求63或64的用途，其中所述用于再次接种的抗原或抗原性组合物是含有佐剂的。
66.权利要求65的用途，其中所述佐剂如权利要求1-49的任ー项所定义。
67.权利要求1-27的任ー项的人类剂量的免疫原性组合物，用于医药。
68.权利要求1-67的任一项的组合物、用途或方法，其中所述抗原或抗原性制剂来源于选自下组的生物流感病毒、HPV、CMV、VZV、肺炎链球菌、恶性疟原虫、间日疟原虫、呼吸道合胞病毒(RSV)。
69.权利要求68的组合物、用途或方法，其中所述流感抗原选自分裂流感病毒、纯化的完整流感病毒、亚基流感病毒及其抗原性制剂。
70.权利要求69的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂来自至少两种流感病毒株。
71.权利要求70的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂来自至少三种流感病毒株。
72.权利要求71的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂来自至少四种流感病毒株。
73.权利要求69-72的任一项的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒的至少ー种株或其抗原性制剂与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能。
74.权利要求73的组合物、用途或方法，其中所述所述流感病毒的至少两种株或其抗原性制剂与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能。
75.权利要求74的组合物、用途或方法，其中所述所述流感病毒的至少三种株或其抗原性制剂与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能。
76.权利要求73-75的任一项的组合物、用途或方法，其中所述至少ー种、至少两种、至少三种大流行流感病毒株选自H5N1、H9N2、H7N7和H2N2。
77.权利要求68-76的任一项的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制 剂含有每流感病毒株I-Kyg HA。
78.权利要求68-76的任一项的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂含有姆流感病毒株少于15 μ g HA。
79.权利要求77或78的组合物、用途或方法，其中所述流感病毒或其抗原性制剂含有每株 2. 5-7. 5 μ g HA0
80.权利要求51-53的任ー项的用途或方法，其中所述用于再次接种的流感病毒或其抗原性制剂来自至少两种不同的流感病毒株。
81.权利要求80的用途或方法，其中用于再次接种的流感病毒或其抗原性制剂来自至少三种不同的流感病毒株。
82.权利要求57-59的任ー项的用途或方法，其中用于再次接种的流感病毒或其抗原性制剂含有至少ー种与大流行爆发相关或具有与大流行爆发相关的可能的流感病毒株。
83.权利要求82的用途或方法，其中所述大流行株选自H5N1、H9N2、H7N7和H2N2。
84.权利要求57-59和80-83的任ー项的用途或方法，其中第一次接种是用含有可能导致大流行爆发的流感病毒株的流感组合物进行的，再次接种是用含有循环大流行株的流感组合物进行的。
85.权利要求57-59和80-84的任ー项的用途或方法，其中所述流感抗原或其抗原制剂是姆剂少于15 μ g HA抗原。
86.权利要求68-85的任ー项的用途或方法，其中所述流感抗原或其抗原性制剂来源于卵或来源于细胞培养物。
87.权利要求86的组合物、用途或方法，其中所述HPV抗原与癌症或生殖器疣相关。
88.权利要求68的组合物、用途或方法，其中所述癌症相关HPV是16型HPV和/或18MHPV0
89.权利要求88的组合物、用途或方法，其中与HPV16和/或18抗原一起使用ー种或多种来自致癌HPV类型的额外抗原，所述抗原选自以下HPV类型HPV 31、45、33、58和52。
90.权利要求88或89的组合物、用途或方法，其中所述抗原是病毒样颗粒(VLPs)的形式。
91.权利要求90的组合物、用途或方法，其中所述VLPs是LIVLPs。
全文摘要
本发明涉及包含皂苷佐剂的疫苗组合物。具体地，本发明提供了人类剂量的免疫原性组合物，包含与佐剂组合的抗原或抗原制剂，该佐剂包含以脂质体形式存在的来源于南美皂皮树的树皮的免疫活性皂苷级分和脂多糖，其中所述皂苷级分和所述脂多糖都以低于30μg的水平存在于所述人类剂量中。本发明进一步提供了人类剂量合适体积的佐剂组合物，包含1-30μg脂多糖和以脂质体形式存在的1-30μg免疫活性皂苷级分。
文档编号A61K39/09GK102631670SQ20121010890
公开日2012年8月15日 申请日期2006年12月12日 优先权日2005年12月13日
发明者P·范德帕佩利耶 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司