专利名称：一株猪圆环病毒2型毒株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物动物疫苗领域，尤其涉及一株猪圆环病毒2型毒株及其相关应用。
背景技术：
猪圆环病毒为无囊膜单股环状DNA病毒，病毒粒子直径为17-20nm，呈20面体对称。在国际病毒学分类中，已将猪圆环病毒、鸡贫血病毒及鹦鹉喙羽病毒分为ー个新科，即圆环病毒科。该病毒现有两个基因型PCVl和PCV2，基因组含有2个主要阅读框架，其中ORFl基因编码产物与病毒复制酶相关(Itep)，0RF2基因编码产物是构成病毒衣壳蛋白(Cap)成分。PCVl是由Tischer等1974年首次在PK-15细胞培养物中发现，对猪无致病性。猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)可引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、繁殖障碍等相关疾病，其中以PMWS最为严重，PMWS 于1991年首次在加拿大发现，其病原为PCV2感染引起。该病主要侵害6 12周龄仔猪，引起渐进性消瘦、呼吸困难、腹泻和黄疸等，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。国内自2001年报道该病以来，在各省市均有不同程度的流行。为此本研究在对临床样品进行PCV2检测的基础上，将检测为阳性的病例进行了病毒分离，由于PCV2体外培养不产生细胞病变，病毒増殖能力差，给研究工作带来一定困难。为了深入研究PCV2在体外细胞培养增殖的特性，本研究从临床PMWS病料分离PCV2毒株，经细胞连续传代，获得ー株细胞培育适应毒，经聚合酶链式反应(PCR)、间接免疫荧光实验、透射电镜及核酸序列分析等方法鉴定、证实分离株为PCV2。为下一歩深入开展PCV2相关研究提供了一定的物质材料与理论基础。
图1PCV2SD病毒PCR扩增产物1. DNA标准DL 2000 ;2_5病毒培养物PCR产物；6阳性对照7.阴性对照图2IFA法检测PCV2 SD感染PK-15细胞结果图A为感染细胞，图B为未感染细胞对照。图3电镜下观察到的PCV2 SD粒子照片(140，000X)标尺=50nm。
发明内容
本发明通过分离鉴定得到了一株猪圆环病毒2型毒株(PCV2)，并命名为PCV2 SD株，该毒株已于2012年2月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区屯路，中国科学院微生物研究所)，毒株保藏号=CGMCC NO. 5774，其分类命名为猪圆环病毒2型。PCV2的检测通常需要借助免疫荧光实验等方法，应用病毒特异性抗体才能证实病毒在细胞中复制。本研究采用IFA法检测病毒感染细胞中的抗原。荧光显微镜下观察，PCV2单克隆抗体孔可见致密的细胞核内荧光染色及稀疏的胞浆内荧光染色。PCV2在体外细胞培养不呈现细胞病变，病毒在细胞的増殖能力也较差。可能与该病毒复制的过程中过度依赖宿主细胞聚合酶有关，由于这种酶类主要在细胞繁殖S周期中合成，缩短了病毒的繁殖期，从而导致病毒増殖能力下降。D-氨基葡萄糖一方面可以增强细胞S期蛋白的表达，另ー方面可以促进病毒DNA进人细胞核，从而增强病毒的繁殖复制，据报道可使PCV抗原阳性细胞数提高30%。据此，我们在细胞分瓶后12h，细胞处于对数生长期的时候用D-氨基葡萄糖处理，从而更有效地促进了 PCV2的繁殖复制。但在用D-氨基葡萄糖处理细胞培养物时需注意控制时间，处理过程不宜过长，否则将产生毒害作用。PCV2感染已引起世界养猪业的巨大经济损失，PCV2疫苗也在加紧研制。但由于PCV2在细胞上的培养滴度非常低，很多疫苗生产厂家基于成本太高，放弃了开发PCV2疫苗的打算，因此，如何提高PCV2在细胞上的滴度应该也是今后研究的工作重点之一。本研究所分离的PCV2 SD毒株，毒价比较高，经20代传代之后为106_°TCID50/ml，有作为疫苗研究的价值。另外，不同毒株的毒价差异是否与其致病性有关还待进ー步研究。分离毒株随细胞传代次数的递增，病毒滴度也显著升高，PCV2増殖能力除受宿主细胞合成外源聚合酶的 影响外，也与体外细胞培养的适应性有关。病毒分离株通过体外细胞培养驯化，可以有效改变病毒与细胞表面受体的亲和关系。PCV2可以在BALB/c小鼠和昆明小鼠复制并产生组织病变。据此，本研究采用昆明小鼠作为实验动物，接种病毒培养物，剖检发现60%接毒小鼠颌下淋巴结有明显充血；PCR成功检测到PCV2SD株在小鼠体内増殖。PCV2的致病谱在不断扩展，对于PCV2造成的相关疾病尚无有效的预防措施，迅速有效的诊断、对感染猪进行清除及良好的养殖操作技术规范是目前消除PCV2感染损失的最佳途径，还有学者提出应对PMWS的“二十点计划”，在消除PMWS过程中，也产生了积极的作用。因此开展PCV2的研究工作具有重要的经济意义。本研究成功分离到ー株具有较高滴度的PCV2 SD株，为下一歩深入开展PCV2相关研究及控制提供了一定的基础。分离鉴定得到的猪圆环病毒2型毒株PCV2 SD,并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，毒株保藏号=CGMCC NO. 5774。
具体实施例实施例I.病料、细胞、实验动物病料来自山东某规模化猪场，病猪死亡前主要表现为体温升高、消瘦呼吸困难等，经PCR检测为PCV2阳性。PK-15细胞(无PCV污染)为山东省畜禽疫病防治与繁育点实验室保存。SPF级昆明小鼠购自山东省实验动物中心。2.主要试剂PCV2阳性血清为本实验室保存；PCV2单克隆抗体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠；FITC标记的兔抗猪荧光二抗及D-氨基葡萄糖购自Sigma公司；胰酶、DMEM及胎牛血清均为美国GIBCO公司生产；E. coli DH5a菌种由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室保存，PMD18-T载体、DNA连接试剂盒、PCR试剂盒、DL-2000 Marker等购自大连宝生物生物工程有限公司，质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、氨苄青霉素(Amp)等购自金博生物技术有限公司，其它试剂均为进ロ或国产分析纯品。3.病毒分尚与病毒传代将临床患“PMWS”的病料(脾和淋巴结)研磨粉碎，_20°C反复冻融3次，5000rpm离心5min去除沉淀,孔径为O. 2 μ m滤器过滤除菌。已长满单层的PK-15细胞用O. 05%胰酶消化，接种ImL上述制备的病料上清，12h后弃去培养液，用300mmol ^dnT3D-氨基葡萄糖处理30min，经PBS洗涤后换上新鲜的含3%血清的DMEM培养基继续培养48h。连续盲传4代，每次消化分瓶后12h，均用D-氨基葡萄糖处理30min。设正常未接病料细胞对照。从中分离得到病毒株命名为PCV2 SD株。4. PCR鉴定及核苷酸序列測定
引物根据GenBank发表的PCV2全基因序列，采用Primer软件设计引物，由上海生エ生物技术服务有限公司合成。扩增PCV2全长基因引物序列为Pl :5’-gaaCCgCgggCtggctgaacttttgaaagt_3，, P2 :5，_gcaccgcggaaatttctgacaaacgttaca_3，。4
的ΡΚ-15细胞提取基因组，使用上述引物进行PCR扩增，将从中PCR扩增得到的PCR产物克隆到pMDlS-T载体上，纯化后送上海生エ生物技术服务有限公司测序，采用DNAStar软件进行序列分析。提取细胞基因组进行PCR扩增发现接种病料的细胞中出现1700bp左右的PCV2特异条带，正常细胞中未扩增出任何条带(參见图I)，将PCR阳性质粒送上海生エ生物有限公司进行测序鉴定测序结果进行序列比对发现，其全基因组与已知毒株最高同源性为95%。5. IFA 检测步骤3中盲传4代得到的PK-15细胞同样方法用O. 05%胰酶消化，分装96孔板(2 X IO4细胞每孔)，培养12h后，用300mmol ^dnT3D-氨基葡萄糖处理30min，洗涤后添加新鲜的含3%血清的DMEM培养液继续培养48h。弃去培养液，用PBS (pH7. 2)洗漆，拍干；用V (丙酮)V (无水こ醇)=6 4固定5-10min,弃去固定液，自然晾干；用PBS洗漆,拍干；加人100 yL标准PCV2单抗(I 200稀释)，37で作用111，？85洗涤5次；滴加5(^しFITC标记的兔抗猪荧光二抗(I 200稀释)，37°C作用45min，同样洗涤后拍干，荧光显微镜观察。设未接种细胞阴性对照。在荧光显微镜下观察发现，感染PCV2 SD的PK-15细胞(图2A)中可见致密的核内荧光染色和稀疏的细胞浆荧光染色。而正常未接种细胞(图2B)无荧光出现。6.病毒的TCID5tl测定将盲传4代和20代PCV2 SD阳性的PK-15细胞_20°C反复冻融3次，将长势良好的PK-15细胞(无PCV污染)用O. 05%胰酶消化，分装96孔板，90 μ L每孔，然后加入用含10%血清的DMEM培养基KT1-KT12稀释的病毒液。每个稀释度接种6个孔，混匀后放入CO2培养箱中继续培养。12h后弃去培养液，用300mmol · dm_3D_氨基葡萄糖处理30min，PBS洗涤后加入含2%血清的DMEM培养液继续培养48h ;弃去培养液，按步骤5作间接免疫荧光试验(IFA)判定结果。按Reed-Muench法计算病毒株的TCID5(i。分离的PCV2 SD盲传4代后毒价为105_°TCID5(l/mL,传代至第20代病毒毒价为106 0TCID50/mLo7.电镜观察将第20代细胞病毒液反复冻融3次，SOOOrpm离心30min，弃去沉淀，将上清液40000rpm超速离心3h，弃上清液，用PBS重悬沉淀并收集，透射电镜观察是否存在病毒。透射电子显微镜下观察到病毒粒子呈圆形，直径约17nm见图3。8.动物实验10只3周龄SPF级昆明小鼠(母鼠)随机分成两组，每组5只，对照组每只腹腔接种O. 2mL的病毒细胞培养物(PCV2 SD，106_°TCID5(l/mL)，对照组同样方法接种PBS。一周后剖杀，分别从血液、淋巴、脾脏等实体组织器官中检测病毒。结果5只接种培养物小鼠中均 检测到病毒，而对照组小鼠均没有检测到病毒。结果攻毒组中3只小鼠下颌淋巴结有明显充血，对照组正常；PCR检测结果，在4只接毒小鼠的实质组织检测到PCV2 SD ;对照组均未检出。
权利要求
1.ー种猪圆环病毒2型毒株PCV2 SD，其特征在于其保藏编号为CGMCC NO. 5774。
2.权利要求I所述的猪圆环病毒2型毒株PCV2SD在制备治疗猪圆环病毒2感染的药物中的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物为疫苗。
4.权利要求4所述的猪圆环病毒2型毒株PCV2SD在治疗猪圆环病毒2感染的动物中的应用。
全文摘要
本发明通过分离鉴定得到了一株猪圆环病毒2型毒株(PCV2)，并命名为PCV2 SD株，毒株保减号为CGMCC NO.5774。PCV2 SD毒株具有较高滴度，在盲传4代后毒价为105.0TCID50/mL，传代至第20代病毒毒价为106.0TCID50/mL，该毒株的分离鉴定为下一步深入开展PCV2相关研究及控制提供了一定的基础。
文档编号A61K39/12GK102732486SQ20121013908
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者吴家强, 徐绍建, 时建立, 李俊, 王金宝 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所