专利名称：一种补骨脂提取物及其制备和应用方法
技术领域：
本发明涉及一种补骨脂提取物，具体地，是以中药补骨脂为原料的提取物及其制备方法和制备治疗慢性阻塞性肺疾病药剂的用途；属于药物领域。
背景技术：
市场现有产品补肺活血胶囊(BFHX)经多年临床使用证明，对于慢阻肺有着显著疗效。其药方组成为黄芪、赤芍和补骨脂三味传统中药。中药及其复方制剂多成分、多靶点和整合协同作用的特点，使得补肺活血胶囊在慢阻肺这ー缓慢进程性疾病的治疗方面凸显出 优势。尽管补肺活血胶囊临床使用有效，可是其生产エ艺粗糙，制剂稳定性较差，物质基础不明，质量标准较低，很难适应中药现代化、产业化和国际化进程。基于此，我们拟对其进行深度开发。前期的预试验显示，补骨脂黄芪、赤芍、三味药材各自单煎的提取物，与三味药材合煎得到的提取物化学成分相同，没有出现单煎时药材成分丢失或者増加的现象。因此我们简化研究对象，先単独研究补骨脂一味药材，后期再合并黄芪、赤芍的研究结果，作为补肺活血胶囊深度开发的一个整体思路。补骨脂是豆科植物补骨脂的干燥成熟果实，作为我国传统治疗腰膝冷痛，肾虚作喘的中药有着悠久的用药历史。以往研究证明其具有扩张冠状动脉、抗菌、抗肿瘤、增强免疫等生理活性(郭秀芝等.中医药学报，2005，33 (5) :52-53)。但是补肺活血胶囊中补骨脂究竟哪些成分起作用，其体内过程如何至今尚不清楚，严重制约了该药物临床使用，加之补骨脂药材质量控制和评价体系尚不完善，生产エ艺十分粗糙，导致了已开发产品的市场竞争カ较弱，如何提高补骨脂产品质量是亟待解决的问题。药动学用于中药研究可为中药制剂生产エ艺的设计、内在质量的评价与监控提供有效手段和方法。目前ロ服给药是中药治疗的主要方式，影响ロ服生物利用度的因素很多，研究药物的吸收对于指导药物给药系统研究有重要意义。评价药物的吸收的模型有很多种，有离体法和在体法，目前较多采用大鼠在体单向肠灌流模型，这种模型以较低的流速某一肠道进行单向灌流，根据进出口处灌流液中的药物浓度差考察药物在该肠段的吸收，其实验条件与ロ服给药后药物接触的肠道环境较接近，吸收速率稳定，与人体有良好相关性(谭晓斌等.中成药，2007，29 (11):1665-1668)。从药物动力学研究角度，采用相应分析手段对大鼠灌胃给药后收集的血液、尿液等生物样品进行分析，结合大鼠在体肠灌流实验技术，找出中药进入体内的成分，筛选出能反映补骨脂物质作用基础的指标成分，可更好的控制该药物的质量，保证用药安全性，深度开发质量可控、物质基础明确的补骨脂药物，以顺应中药现代化的要求。目前尚无针对本发明标准的补骨脂提取物及其制备和应用方法的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种补骨脂提取物及其制备和应用方法。—种补骨脂提取物，是以补骨脂为原料提取得到的，所述的补骨脂提取物含有补骨脂素、异补骨脂素，质量百分比分别为补骨脂素I. 57%-3. 3%，异补骨脂素I. 1%-2. 5%。所述的补骨脂提取物提取物还含有补骨脂素苯并呋喃苷和异补骨脂素苯并呋喃苷。所述的补骨脂来源于豆科植物补骨脂(Psoralen. L)的干燥成熟果实。所述的补骨脂提取物的水分含量不超过6. 0%、炽灼残渣量不超过I. 0%、重金属含量不超过0. 01%0。所述的补骨脂提取物用于制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药剂。包括以补骨脂提取物为主要有效成分与多种医用辅料(赋型剂，稀释剂，香味剂、甜味剂、润滑剂等)配合，制成多种剂型的药物使用，如冻干粉针，注射液，大输液，片剂，胶囊，颗粒剂以及ロ服液等。一种补骨脂提取物的制备方法，包括如下步骤取补骨脂饮片，先用其5-10倍体积量40%_80%こ醇浸泡提取2次，每次30min-l. 5h,滤过,合并提取液,减压浓缩、回收こ醇至无醇味,放冷,加水调至浓度为0. 5g/mL，即每ImL药液中含生药补骨脂量为0. 5g，滤过，然后通过已预处理好的DlOl型大孔吸附树脂柱，树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为I : 1，再依次以3倍柱体积的水洗脱，再用7倍柱体积的70%こ醇洗脱，收集こ醇洗脱液，减压回收こ醇，继续浓缩得干膏，经干燥，得补骨脂提取物粉末。优选包括如下步骤 取补骨脂饮片，先用其8倍体积量60%こ醇，再用其I倍体积量60%こ醇各提取I次，毎次I. 5h，过滤，合并提取液；减压浓缩、回收こ醇至无醇味，放冷，加水调至浓度为
0.5g/mL，即每ImL药液中含生药补骨脂量为0. 5g，过滤后通过已预处理好的DlOl型大孔吸附树脂柱；树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为I :レ流速为^!!!!^!!!^1^依次用3倍柱体积纯水，7倍柱体积70%こ醇洗脱；收集こ醇洗脱液，减压回收こ醇，60°C继续浓缩得干膏，经60°C干燥，得补骨脂提取物粉末。所述的补骨脂提取物含有补骨脂素、异补骨脂素，质量百分比分别为补骨脂素
1.57%-3. 3%，异补骨脂素 I. l%-2. 5%o所述的补骨脂提取物还含有补骨脂素苯并呋喃苷和异补骨脂素苯并呋喃苷。所述的补骨脂来源于豆科植物补骨脂(Psoralen. L)的干燥成熟果实。所述的补骨脂提取物的水分含量不超过6. 0%、炽灼残渣量不超过I. 0%、重金属含量不超过0. 01%0。本发明提供了一种补骨脂提取物，以中药材补骨脂为原料提取而成。本发明采用大鼠在体肠单向灌流法，比较药材灌胃液灌流前后经小肠吸收减少的成分是否与灌胃给药吸收入血成分一致；灌流结束后采血，检测血浆样品，进ー步确定补骨脂药材吸收入血成分有补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷、补骨脂素和异补骨脂素，并以这些成分及其含量作为标准。根据其优化提取エ艺和富集纯化工艺，最終获得精制而成的本发明提取物，同时水分含量、炽灼残渣量、重金属含量也作为标准，在优化提取エ艺和富集纯化工艺时考虑。本发明可更好的控制该药物的质量，保证用药安全性，深度开发质量可控、物质基础明确的补骨脂药物，以顺应中药现代化的要求。。
以下通过实 施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进ー步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图I补骨脂灌胃液HPLC指纹图谱；图2大鼠灌胃补骨脂后血浆HPLC典型图谱a.空白血浆，b.含药血浆；图3大鼠灌胃补骨脂后尿液HPLC典型图谱；a.大鼠空白尿样，b.大鼠灌胃给药后0_24h尿样，c.大鼠灌胃给药后24_48h尿样；图4大鼠灌胃给药前后粪样及提取物灌胃液图谱；a.空白粪样；b.大鼠灌胃给药后0_48h粪样图谱；c.补骨脂提取物灌胃液。
具体实施例方式实施例I :补骨脂药材中特征成分为主的色谱指纹图谱的建立以及大鼠在体肠灌流方法确定补骨脂吸收成分的方法I. I材料和仪器I. I. I药品和试剂补骨脂饮片购自湖南九芝堂药业，经鉴定为豆科植物补骨脂盐炙的干燥成熟果实。补骨脂素、异补骨脂素和萘普生对照品购自中国药品生物制品检定所。甲醇为色谱纯(Tedia公司)，こ酸铵等其他试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。1.1.2 仪器Agilent Technologies 1200 (Agilent Chemstation エ作站，DAD 检测器)；Finnigan LCQAdvantage MAX ；KromasiI 100-5C18 (250X4. 6mm, 5 u m) ;JA2003H 型千分之一天平(上海精密科学仪器有限公司)；CP22 型十万分之ー电子天平(Sartorious)；KL-R0-10型艾柯超纯水机(台湾艾柯)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；MTN-2800D氮气吹干仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；RE_5298A系列旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);3700M071型代谢笼(Tecniplast公司);DDB-320多功能电子蠕动泵(上海之信仪器有限公司)。I. I. 3实验动物SD大鼠(清洁级)，雄性，体重180_220g，购于中南大学湘雅医学院实验动物学部。I. 2溶液配制(I) K-R 液(Krebs-Ringer’ s 液)的配制分别称取氯化钠7. 8g、葡萄糖I. 4g、碳酸氢钠I. 37g、氯化钙0. 37g、氯化钾0. 35g、磷酸ニ氢钠0. 32g、氯化镁0. 02g，加适量蒸馏水溶解，加水稀释至IOOOmL,超声混匀即得K-R 液。(2)补骨脂提取物肠灌流供试品溶液的配制參照文献(中国专利申请号02135035. 3)，取补骨脂饮片适量，加入10倍量水，カロ热回流lh，过滤，再加入8倍量纯水，继续加热回流lh，滤液合并、浓缩至一定密度，再加入こ醇至含醇量约为60%，静置24h，过滤，挥去こ醇，浓缩得补骨脂稠膏。按100 60(ff V)溶于一定量的纯水中，涡旋混匀，制得补骨脂灌胃液，每毫升补骨脂灌胃液约相当于0. 6g补骨脂药材。补骨脂灌胃液按体积比I : 9加入K-R液，混和摇匀即得灌流样品。1. 3色谱条件、质谱条件色谱条件色谱柱Kromasil100-5C18 (250 X 4. 6mm, 5 u m);流动相0_5min,A: 30% ；5-30min, A:30%-60% ；30-55 min, A:60%-95% ；55-60min, A :95%_5%，其中 A 为甲醇，B为0. 1%甲酸、IOmmol じ1こ酸铵水溶液；流速1. OmL min—1 ;柱温30°C ；DAD扫描范围190-400nm ;检测波长320nm，245nm ;进样量20 y し质谱条件电喷雾离子化源(ESI)，源电压3. 5KV，干燥气流速IOL mirT1，干燥气温度350°C，喷雾气压カ30psi，目标离子分子量366，化合物稳定性100%，MS2打碎电压I. 0V，扫描的范围为150-1000。采集正离子模式下的MS和MS2图谱。数据分析采用软件FinniganLCQ Advantage MAX Xcalibur。I. 4样品收集、处理禁食12h的SD大鼠6只称重后，按0. 3mL/100g腹腔注射10%的水合氯醛，麻醉后将大鼠分别固定在手术板上，沿腹中线剪开腹部，在十二指肠上部及回肠下部结扎，在结扎的两端开ロ后肠管插管，用37°C的生理盐水冲净肠内容物，经乳胶管接通蠕动泵，构成循环回路，并用经37°C生理盐水浸溃的纱布覆盖创ロ。I只大鼠灌流空白K氏液，5只大鼠用K-R液配制成的补骨脂供试药液灌流。先将药液快速泵入肠段，使肠段内充满药液，后将流速降至(0. 2mL/min)，同时开始记时，进ロ处用已知质量的装有供试液的小瓶进行灌流，于出口处收集流出的灌流液直至实验结束，记录流出液质量并将所灌流的肠段内残液冲出。灌流结束后，大鼠心脏取血。所取灌流液样品高速离心，经0. 45um微孔滤膜过滤，取续滤液进行HPLC分析，血浆样品经处理后进样分析，比较灌流液中药物减少成分是否与血浆中入血成分一致。I. 5 结果I. 5. I补骨脂灌胃液指纹图谱的建立补骨脂水提醇沉提取物320nm处补骨脂灌胃液图谱色谱峰指纹信息最多，60min内可完成所有成分的分析，且补骨脂各成分峰分离良好，相互间没有干扰，保留时间适中。其中主要成分峰A、B、C、D的保留时间分别为10. 7min, 13. Omin, 25. 5min, 27. Omin,按峰面积归ー化法计算，峰面积总和达到90%以上(见图I)。方法学考察结果显示，以湖北补骨脂药材的提取物为供试品，分别于0、2、4、6、8、
10、12h測定，各色谱峰的保留时间漂移在±0. 15min范围内，各色谱峰面积的RSD值不超过3. 6%，说明供试品溶液在12h内稳定。以湖北补骨脂药材的提取物为供试品，连续进样6次，结果表明，各色谱峰的保留时间漂移在±0. 15min范围内，各色谱峰面积的RSD值不超过2.9%。该分析方法具有较好的精密度和重现性。I. 5. 2补骨脂提取物肠灌流结果补骨脂提取物灌流液各成分在在空白灌流液中至少4h内稳定。补骨脂提取物给予大鼠单向肠灌流2-3h后，灌流液中多种成分均有所減少，其中保留时间分别为10. 7min、13. Omin,25. 8min和27. 5min的主要成分A、B、C、D均有不同程度的吸收。确定其为SD大鼠进行补骨脂提取物肠灌流时小肠吸收的主要成分，且极有可能是补骨脂吸收入血发挥补肺活血作用的有效成分。经对照品峰位及光谱核对、液质联用结合化学成分转化性质的方法，判断其分别是补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷、补骨脂素和异补骨脂素。实施例2 :补骨脂提取物血清药物化学研究2. I材料和仪器同实施例I。2. 2大鼠血样、尿样、粪样采集2. 2. I补骨脂灌胃液的制备參照文献(中国专利申请号02135035. 3)，制得补骨脂稠膏。按100 60 (ff V) 溶于一定量的纯水中，涡旋混匀，制得补骨脂灌胃液，每毫升补骨脂灌胃液约相当于0. 6g补骨脂药材。2. 2. 2灌胃给药，收集血浆、尿样、粪样取6只大鼠，实验前禁食12h，自由饮水。补骨脂提取物按I. 6g生药/IOOg的剂量给与大鼠灌胃。将灌胃后采集血浆与自身灌胃前采集的空白血浆进行对比。即分别于补骨脂提取物灌胃前(Omin)和灌胃后30min、60min、90min、120min> 180min>240min于大鼠眼眶采血约lmL，置于I. 5mL肝素化EP管中，12000rpm离心lOmin，分取血浆置于I. 5mLEP管中，-20°C保存。另取2只SD大鼠置于代谢笼中，收集其空白尿。以2g补骨脂生药/IOOg体重的剂量灌胃给药，收集灌胃给药后0-24h、24-48h尿样。同时收集大鼠空白粪样和灌胃给药后0-48h粪样。2. 3大鼠血浆、尿样、粪样的处理取灌胃给药后3h大鼠血浆样品400 ii L，加入3倍量こ腈，涡旋2min混匀，12000rpm离心IOmin除去蛋白。离心得到的上清液转移至玻璃离心管中，60°C微弱氮气吹干。加入100 ii L流动相复溶,润旋振荡3min,转移至I. 5mLEP管，12000rpm离心IOmin,取上清液进样检測。血药浓度浓缩至原先的4倍。每个大鼠尿样分别给予离心、こ酸こ酯萃取两种不同方式处理。对比SD大鼠空白尿样、给药后尿样色谱图，分析吸收入血后经代谢由尿样排泄的补骨脂成分。粪样自然风干，研成粉末，称取一定量，加甲醇超声30min，静置6h后，经0. 45 y m滤膜过滤，续滤液进HPLC检测。2. 4 结果2. 4. I血浆分析补骨脂药材主成分峰A、B、C、D在给药后血浆的色谱图中都有出现。这ー结果与大鼠小肠单向灌流试验中灌流液主要減少成分相吻合。不同大鼠血浆色谱峰的个数和峰位一致，峰面积有所变化。提示我们，A、B、C、D成分以原型进入大鼠体内，且大鼠对于补骨脂药材提取物吸收代谢等体内过程，存在个体间差异。肠灌流大鼠血浆样品与灌胃给药大鼠血浆样品共有峰的峰位相吻合，进ー步验证了 SD大鼠肠灌流试验中減少的成分，是由大鼠吸收入血而引起。初步认定药材中4种主要成分A、B、C、D是补骨脂发挥药效的物质基础，也是后续研究所要追踪的目标成分。典型图见图2。2. 4. 2尿样分析对比空白尿样可知,给药后0-24h、24-48h的尿样中均出现了药材A、B、C、D四种主成分峰。可初歩推断这些成分为补骨脂灌胃液进入大鼠体内经肾脏代谢后以原型排出的成分，典型图见图3。2. 4. 3粪样分析之前肠灌流试验、以及血样尿样图谱推断吸收入血的药材A、B、C、D4个主要成分中，A这ー药材中含量最高、血浆样品中含量却极少的成分在粪样中没有出现，排除了经过肠道不吸收而直接排出体外的可能性，从另ー个角度佐证了 A成分经胃肠道吸收进入体内。综合之前灌流试验以及灌胃大鼠血浆、尿样分析結果，A、B、C、D这4种成分均吸收入血，且入血的比例都较高，极有可能是补骨脂吸收入血发挥补肺活血作用的有效成分。经对照品峰位及光谱核对、液质联用结合化学成分转化性质的方法，判断其分别是补骨脂素 苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷、补骨脂素和异补骨脂素。实施例3 :本发明补骨脂提取物的制备根据实施例I和2的结果用补骨脂素苯并呋喃苷、异补骨脂素苯并呋喃苷、补骨脂素和异补骨脂素为指标成分，正交试验法优化补骨脂提取物提取エ艺。依据提取预试验结果，采用L9 (34)正交试验表进行设计，对提取时的こ醇浓度、提取溶媒用量和提取时间等因素进行考察，每个因素设置3个水平。因素水平见表I。将补骨脂药材混匀，称取18份(每个试验平行操作2份)，每份20g，按表2安排实验，D项为空白项，用来做方差分析。以提取液中补骨脂素苯并呋喃苷与异补骨脂素苯并呋喃苷的峰面积、补骨脂素与异补骨脂素的含量作为考察指标，进行数据分析。试验数据用SPSS13. 0软件统计，结果见表2-表6。表I正交实验因素水平表
权利要求
1.一种补骨脂提取物，其特征在于是以补骨脂为原料提取得到的，所述的补骨脂提取物含有补骨脂素、异补骨脂素，质量百分比分别为补骨脂素I. 57%-3. 3%，异补骨脂素I. 1%-2. 5%。
2.根据权利要求I所述的补骨脂提取物，其特征在于所述的补骨脂提取物提取物还含有补骨脂素苯并呋喃苷和异补骨脂素苯并呋喃苷。
3.根据权利要求I所述的补骨脂提取物，其特征在于所述的补骨脂来源于豆科植物补骨脂(Psoralen. L)的干燥成熟果实。
4.根据权利要求I所述的补骨脂提取物，其特征在于所述的补骨脂提取物的水分含量不超过6. 0%、炽灼残洛量不超过I. 0%、重金属含量不超过0. 01%0。
5.权利要求1-4任意一项所述的补骨脂提取物的应用方法，其特征在于，用于制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药剂。
6.一种补骨脂提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 取补骨脂饮片，先用其5-10倍体积量40%-80%こ醇浸泡提取2次，每次30min-l. 5h，滤过，合并提取液，减压浓缩、回收こ醇至无醇味，放冷，加水调至浓度为0. 5g/mL，即每ImL药液中含生药补骨脂量为0. 5g，滤过，然后通过已预处理好的DlOl型大孔吸附树脂柱，树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为I : 1，再依次以3倍柱体积的水洗脱，再用7倍柱体积的70%こ醇洗脱，收集こ醇洗脱液，减压回收こ醇，继续浓缩得干膏，经干燥，得补骨脂提取物粉末。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤 取补骨脂饮片，先用其8倍体积量60%こ醇，再用其7倍体积量60%こ醇各提取I次，每次I. 5h，过滤，合并提取液；减压浓缩、回收こ醇至无醇味，放冷，加水调至浓度为0. 5g/mL,即每ImL药液中含生药补骨脂量为0. 5g，过滤后通过已预处理好的DlOl型大孔吸附树脂柱；树脂重量与加水调节浓度后的药液重量之比为I : 1，流速为广2!111^1^11_1;再依次用3倍柱体积纯水，7倍柱体积70%こ醇洗脱；收集こ醇洗脱液，减压回收こ醇，60°C继续浓缩得干膏，经60 V干燥，得补骨脂提取物粉末。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述的补骨脂提取物含有补骨脂素、异补骨脂素，质量百分比分别为补骨脂素I. 57%-3. 3%，异补骨脂素I. 1%-2. 5%。
9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述的补骨脂提取物还含有补骨脂素苯并呋喃苷和异补骨脂素苯并呋喃苷。
10.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述的补骨脂提取物的水分含量不超过6. 0%、炽灼残洛量不超过I. 0%、重金属含量不超过0. 01%0。
全文摘要
本发明提供了一种补骨脂提取物及其制备和应用方法，该提取物以中药补骨脂为原料提取而成，其中含有补骨脂素和异补骨脂素，质量百分比分别为1.57%-3.3%，异补骨脂素含量为1.1%-2.5%。本发明提取物的制备方法以该提取物中的补骨脂素和异补骨脂素含量、水分含量、炽灼残渣量、重金属含量为指标进行优化得到。本发明可更好的控制补骨脂提取物的质量，保证用药安全性，深度开发质量可控、物质基础明确的补骨脂药物，以顺应中药现代化的要求。
文档编号A61K131/00GK102641328SQ20121015449
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者云筠筠, 张超, 王霆, 程泽能, 蔡凝芳, 袁玉 申请人:中南大学