专利名称：一种基因及其编码蛋白促进细胞胞质分裂、细胞增殖和在药物研发中应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ALKBH4基因及其编码蛋白ALKBH4在胞质分裂和细胞增殖中的功能及针对ALKBH4抗癌药物研发中的潜在应用价值。
背景技术：
胞质分裂通常经历四个主要的阶段分裂板确立(cleavage planespecification)、分裂沟收缩(cleavage furrow ingression)、中体形成(midbodyformation)和断裂(abscission)。胞质分裂失败通常会导致中心体过度复制基因组不稳定，这些都会导致恶性增值和迁移。为了在空间和时间上保证胞质分裂正确发生，胞质分裂的许多组分和其它细胞通路过程都参与这个紧密的调控过程。胞质分裂通常被认为是通过·肌动蛋白纤维(F-actin)和二型非肌肉肌球蛋白(non-muscle myosin II or NM II)形成的收缩环(contractile ring)收缩完成的,肌动蛋白纤维在分裂沟形成和收缩过程中起到关键性作用。收缩环随着肌动蛋白纤维和二型非肌肉肌球蛋白之间的快速转变而高度动态变化，肌动蛋白纤维在分裂沟处聚集是通过分裂沟处肌动蛋白纤维的成核效应或其他位置已经存在的成核的肌动蛋白纤维传递到分裂沟处的。二型非肌肉肌球蛋白聚集在分裂沟处不依赖其自身的ATP酶活性，而是依赖于轻链的磷酸化修饰。二型非肌肉肌球蛋白是胞质分裂过程中主要的动力蛋白，它沿着肌动蛋白纤维滑动和促进肌动蛋白纤维解聚都是分裂沟收缩所必需的。肌动蛋白和肌球蛋白在分裂沟处的高度变化是受到蛋白质翻译后修饰所(post-translational modifications or PTMs)调控的，有研究表表明在有丝分裂的早后期肌球蛋白招募到分裂沟处是通过磷酸化修饰完成，促进磷酸化的激酶降解会导致肌球蛋白定位及肌动蛋白在分裂沟处解聚，肌动蛋白的解聚和聚合也受到多种翻译后修饰的信号通路调控，例如氧化、精氨酰化、SUMO化和S-亚硝基化，这些对肌动蛋白结构、分布和功能有重要影响，然而在收缩环和中体上的肌动蛋白是否具有类似的修饰、这些修饰是怎样影响收缩环中体的结构和功能现在还不清楚。现在已发现铁离子和α-酮戊二酸依赖的加双氧酶能够氧化多种底物，包括蛋白质、核酸和代谢物，一个候选加双氧酶一大肠杆菌加双氧酶AlkB蛋白催化甲基化试剂导致的各种甲基化修饰的DNA去甲基化，通过生物信息学分析发现在人体内有九种AlkB的同源类似物ALKBHl-8和FT0。像大肠杆菌AlkB蛋白一样，一些人源ALKBH蛋白也具有加双氧酶，它们的底物是多种修饰类型的核酸，这些蛋白参与不同的生物过程。人源ALKBH4具有302个氨基酸，虽然它已被证明具有加双氧酶活性，但是它的底物和生物学功能现在还不清楚胞质分裂是一个令人吃惊的复杂调控过程，需要非常多的相互作用组分和调控通路，胞质分裂的失败可产生于这四个阶段的任何一阶段中某个组分失活或过度激活的结果。虽然许多胞质分裂的蛋白已被鉴定，但是我们只是知道这些蛋白是如何相互作用的如何被调控的。理解胞质分裂失败是很重要的，因为它可能是产生不稳定的四倍体细胞和肿瘤的原因。然而，胞质分裂失败也会生理调节性的发生在一些组织中，甚至那些不会有肿瘤倾向的组织，如心脏。了解如何在应答不同信号或在细胞受到压力和损伤的情况下生理性的调控胞质分裂，仍是未来重点研究的领域。虽然胞质分裂失败伴随着一些病理现象，如癌症，但是药物诱导胞质分裂失败可以作为新药研发的重要方向。Rho激酶抑制剂已被研发成心血管药物,Aurora激酶抑制剂作为抗癌药物正在研发当中。因为这些抑制剂也可诱导正常组织胞质分裂失败，所以确定不同组织对胞质分裂敏感性和不同组织产生四倍体细胞的后果是非常重要的。
发明内容
本发明公开了一种ALKBH4基因及其编码的蛋白ALKBH4在胞质分裂和细胞增殖中的功能及针对ALKBH4抗癌药物研发中的潜在应用价值。所述人ALKBH4 cDNA序列如序列表SEQ ID NO. I所示，所述人ALKBH4H169A-D171A-H254A突变体cDNA序列如序列表SEQ IDNO. 2,所示所述小鼠ALKBH4基因组DNA序列如序列表SEQ ID NO. 3所示,所述人β-actin·cDNA序列如序列表SEQ ID NO. 4所示,所述人β -actin K84A突变体cDNA序列如序列表SEQ ID NO. 5所示，所述人ALKBH4蛋白序列如序列表SEQ ID NO. 6所示，所述人ALKBH4H169A-D171A-H254A突变体蛋白序列如序列表SEQ ID NO. 7所示，所述小鼠ALKBH4蛋白序列如序列表SEQ ID NO. 8所示,所述人β-actin蛋白序列如序列表SEQ ID NO. 9所示,所述人β-actin K84A突变体蛋白序列如序列表SEQ ID NO. 10所示。所述ALKBH4 siRNA序列 SEQ ID NO. 27，SEQ ID NO. 28 和 SEQ ID NO. 29 作用是将 ALKBH4 基因沉默，降解 ALKBH4cDNA和降低内源ALKBH4蛋白表达，这三条序列的靶点位于ALKBH4 mRNA的3’端非编码区，所以不能沉默外源表达ALKBH4基因。所述NM II siRNA序列SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31和SEQ ID NO. 32作用是将匪II基因沉默，降解匪II cDNA和降低匪II蛋白表达。首先，本发明通过免疫荧光与免疫印迹实验检测到ALKBH4蛋白定位在收缩环(contractile ring)、中体(midbody)和中心体(centrosome)上。发现 ALKBH4 蛋白的细胞定位具有特异性，主要存在于与细胞有丝分裂及胞质分裂相关的重要细胞器。所以本发明解决技术问题一提供ALKBH4蛋白一种新的细胞器特异性定位表型，这个表型可以应用于病理检测的指标。其次，本发明通过基因沉默、免疫共沉淀及免疫印迹实验发现ALKBH4蛋白与肌动蛋白(actin)和二型非肌肉肌球蛋白(匪II)相互作用，并能够将actin K84mel去甲基化，这个去甲基化修饰反应对匪II在actin上结合和沿着actin纤维滑动是至关重要的，影响到胞质分裂的效率。因此本发明解决技术问题二提供ALKBH4蛋白两种新的相互结合蛋白、actin K84mel的去甲基化功能和促进收缩环收缩。最后，本发明通过基因沉默、免疫荧光和流式细胞技术发现ALKBH4基因沉默会导致中心体过度复制、细胞分裂期阻滞和胞质分裂失败，最终引起细胞凋亡及多核细胞生成，ALKBH4蛋白的缺失或抑制会导致细胞增殖迁移缺陷最终走向死亡。所以本发明解决技术问题三为抑制恶性增殖迁移的肿瘤细胞诱导其死亡提供基础研究证据，这就为我们研究针对ALKBH4蛋白的抗肿瘤药物研发提供强有力的理论基础。众所周知，恶性肿瘤细胞是能够无线增殖和迁移的细胞，它的恶性扩增侵占了正常细胞的生存空间，引起众多器官衰竭夺走病人生命。而我们发现ALKBH4基因在细胞分裂尤其是胞质分裂过程起到关键调控作用，那如果将肿瘤细胞的ALKBH4基因抑制掉，那么肿瘤细胞将无法增殖和迁移最终导致其死亡，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。综上所述，说明ALKBH4可以用于研发抗肿瘤药物。
图I人加双氧酶AlkB蛋白家族组成及酶活性关键结构域图2加双氧酶AlkB蛋白家族与组蛋白去甲基化酶JHDM蛋白家族具有相同的去甲基化机制图3亲和层析纯化6 X H1S-ALKBH4野生型和HDH突变体融合蛋白图4浓缩6 XHiS-ALKBH4野生型和HDH突变体融合蛋白及验证这两个蛋白的纯度 图5验证GST-ALKBH4融合蛋白可溶性表达，亲和层析和离子交换层析分离纯化GST-ALKBH4融合蛋白图6亲和层析纯化用于免疫荧光实验的兔源ALKBH4抗体图7免疫荧光实验验证兔源ALKBH4抗体的特异性图8制备用于免疫印迹实验的抗体及免疫印迹实验验证抗体的特异性图9免疫荧光实验证明内源ALKBH4蛋白定位在中心体(centrosome )和中体(midbody)上图10免疫荧光实验证明外源3XFlag_ALKBH4定位在中心体上，中心体分离实验证明内源ALKBH4定位在中心体上图11免疫荧光实验及收缩环中体分离实验证明ALKBH4定位在收缩环(contractile ring)和中体上图12ALKBH4免疫共沉淀质谱分析结果，actin K84mel和NM II存在于ALKBH4免疫共沉淀样品中图13免疫共沉淀实验证明内源和外源的ALKBH4都与actin相互作用图14免疫共沉淀实验证明HA- β -actin K84A突变体干扰ALKBH4结合，Flag-GFP-ALKBH4 HDH突变体与actin的结合能力增强图15免疫共沉淀实验证明ALKBH4与NM II相互作用，HA- β -actin K84A突变体干扰其与匪II间的结合图16免疫共沉淀实验证明ALKBH4基因沉默不影响actin与匪II间的相互作用图17免疫共沉淀实验证明匪II基因沉默不影响ALKBH4与actin间相互作用图18免疫共沉淀实验证明NM II抑制剂Blebbistatin不影响ALKBH4与actin间相互作用图19免疫共沉淀实验证明actin聚合抑制剂Cytochalasin D破坏了 ALKBH4与actin、NM II间的相互作用图20兔源actin K84mel抗体可以特异性识别含有K84mel的多肽和HA-β -actin，不能识别非甲基化的多肽和HA-β -actin K84A突变体图 21 在体内 ALKBH4 可以使 actin K84mel 去甲基化，ALKBH4 与 actin K84mel 结合而匪II与没有甲基化修饰的actin结合图22免疫荧光实验证明ALKBH4基因沉默导致收缩环位置异常、中体结构异常和中心体过度复制
图23流式细胞技术证明ALKBH4基因沉默导致G2/M期和M期细胞增多图24过表达3XFlag-ALKBH4 HDH和HA-β -actin K84A突变体导致M期细胞增
多图25免疫荧光、流式细胞技术和活细胞成像实验证明ALKBH4基因沉默导致胞质分裂失败最终产生多核细胞、细胞凋亡图26Flag-GFP_ALKBH4野生型可以修复ALKBH4基因沉默导致的胞质分裂现象，包括收缩环定位异常，多核细胞产生和M期细胞增多，而Flag-GFP-ALKBH4 HDH突变体却不能图27ALKBH4在细胞内的功能模型图28流式细胞技术证明U20S细胞中ALKBH4基因沉默导致G2/M期、M期细胞增 多和细胞凋亡图29流式细胞技术证明0SC20和T0C2细胞中ALKBH4基因沉默导致细胞凋亡图30ALKBH4基因敲除小鼠敲除的蛋白位置及传统型ALKBH4基因敲除小鼠死于胚胎期图31条件型ALKBH4基因敲除小鼠设计方案及southern blotting和RT-PCR验证图32诱导ALKBH4基因敲除小鼠成纤维细胞ALKBH4基因敲除引起actin K84mel表达量增加图33诱导ALKBH4基因敲除小鼠成纤维细胞ALKBH4基因敲除导致多核细胞产生及中心体过度复制图34ALKBH4基因敲除小鼠成纤维细胞的增殖和迁移能力缺失具体实施例实施例一本发明实施例中应用到的实验方法和材料实验材料I、所用细胞系的信息
细胞系中文名培养条件
293T人肾上皮细胞RPMI1640+10% FBS~
MRC5人胚胎肺成纤维细胞 RPMI1640+10% FBS
U20S人骨肉瘤细胞DMEM+10%FBS
OSC20口腔鳞状细胞癌细胞 RPMI 1640+10%FBS
TOC2卵巢癌细胞RPMI1640+10% FBS
MEF小鼠成纤维细胞DMEM+10% FBS2、所用抗体信息
权利要求
1.一种预防或治疗癌症的人ALKBH4 SiRNA序列，其序列如下述核苷酸序列之一SEQID NO. 27-29。
2.一种预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于包含权利要求I所述的人ALKBH4siRNA序列以及药学上可接受的赋形剂或载体。
3.权利要求I所述的人ALKBH4siRNA序列在制备预防或治疗癌症的药物中的用途。
4.一种人ALKBH4的反义RNA序列在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，所述人ALKBH4的反义RNA序列如下述核苷酸序列之一 i)与SEQ ID NO : I完全互补的核苷酸序列； )与i)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在核苷酸序列上不同的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列； iii)与编码SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。
5.一种人ALKBH4在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，所述人ALKBH4的氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示。
6.一种人ALKBH4突变体H169A-D171A-H254A的cDNA序列，其核苷酸序列如下述核苷酸序列之一 i)SEQ ID NO 2中所示的核苷酸序列； )与i)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在核苷酸序列上不同的核苷酸序列；或 iii)编码SEQ ID NO :7所示氨基酸序列的核苷酸序列。
7.一种人ALKBH4突变体蛋白H169A-D171A-H254A，其氨基酸序列如SEQ ID NO :7所/Jn ο
8.一种免疫原性高、制备ALKBH4抗体的人ALKBH4抗原表位序列在制备预防或治疗癌症的药物中的用途，所述人ALKBH4抗原表位序列的氨基酸序列是QSGRKKQDYGPK。
全文摘要
本发明公开了ALKBH4基因及其编码的蛋白ALKBH4在胞质分裂和细胞增殖中的功能及针对ALKBH4抗癌药物研发中的潜在应用价值。ALKBH4蛋白与肌动蛋白actin和二型非肌肉肌球蛋白NM II相互作用，并能够将actin K84me1去甲基化，这个去甲基化修饰反应对NM II在actin上结合和沿着actin纤维滑动是至关重要的，影响到胞质分裂的效率。ALKBH4基因沉默会导致中心体过度复制、细胞分裂期阻滞和胞质分裂失败，最终引起细胞凋亡及多核细胞生成，ALKBH4蛋白的缺失或抑制会导致细胞增殖迁移缺陷最终走向死亡。ALKBH4可以用于研发抗肿瘤药物。
文档编号A61K48/00GK102952799SQ201210155088
公开日2013年3月6日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者杨运桂, 李明明, 史悦 申请人:中国科学院北京基因组研究所