专利名称：蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的分离方法
技术领域：
本发明涉及蜂胶的深度利用，更具体地说，本发明涉及蜂胶活性物质的提取方法以及蜂胶活性物质在抑制粉尘螨过敏原中的应用领域。
背景技术：
蜂胶英文Propolis来源于古代希腊语，是由"pro"(在前方)和“lis”(城堡)组成，含义是蜂胶有缩小蜂巢入口的作用(Castaldo and Capasso 2002)。蜂胶一般是由工蜂采集植物的嫩芽、嫩枝，再混以树胶、花粉、蜂蜜等物质送至蜂巢，经由内勤蜂的舌腺、蜡腺等腺体加工转化而形成的不透明胶体状物质，多呈棕褐色、灰褐色、黄褐色、灰绿色、暗绿色，极少数呈深黑色(Rakl996)。由于蜂巢内部空间狭小、潮湿的特性使其有利于微生物的生存，内勤蜂便将蜂胶涂抹于蜂巢缝隙或其他需要的地方，以阻止外部细菌的进入、风干入侵者尸体，保证蜂巢内部环境的整洁，有利于蜂王浆、花粉等蜂产品的保存。
·
蜂胶作为一种汇集了动植物的多种产物和次级代谢产物而存在的天然物质，成分极为复杂(见下表1-1)。现阶段已经分离鉴定出的蜂胶成分达三百多种，其中黄酮类物质71种，氨基酸25种，芳香族酸、酯类59种，以及多种酯、醛、醇类化合物，还有多种维生素和铁、锌、镉等微量元素。化学成分的多样性赋予了蜂胶丰富的生物学活性，目前蜂胶已经被证实的生物学活性主要有抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、护肝等生物学活性，还有资料显示蜂胶制剂对呼吸道疾病、皮肤疾病、心血管疾病等方面的疾病有显著疗效。蜂胶资源稀少，一个五六万只得蜂群蜂胶的年产量仅为100多克，因此国外市场称蜂胶为“紫色黄金”。据调查I支浓度为25%、净含量为30g的蜂胶口服液在美国市场上的零售价为30美元左右，I支普通的蜂胶口服液(15ml，20g)的售价也在20美元以上，尤其是巴西蜂胶在世界上享誉盛名，其相关商品售价远远高于其他产地蜂胶产品，也已经分离出多种具有生物活性的化学成分。表1-1蜂胶的主要成分列表
'主要成分
Mmn iiigredienfcontent
M Hli50%=5%Situ30%=5%
挥发油10%
花粉5%
K Wi 物 ftfi5%中国蜂胶研发起步较晚，早期主要以原材料的形式出口，加工利用率和附加值均较低。但是中国蜂胶相对于外国蜂胶而言具有储量大、分布范围广等资源优势。自2005年起蜂胶被列入《药典》后，蜂胶被广泛应用于在医疗卫生、食品贮藏加工、日用品加工和中医药等方方面面。加大中国蜂胶的活性成分研究，开发具有实际应用价值的蜂胶产品将会为中国蜂胶的产业化和标准化提供更好的理论依据。随着现代分析技术的发展，关于蜂胶活性成分的提取、分离与鉴定成为研究的热点。从九十年代至今国内外对中国蜂胶样品的研究报道万余篇，现阶段也已经明确中国蜂胶化学组分和生物学活性具有丰富的多样性。但是，如上所述，蜂胶的成分复杂，要从中提取出有活性的物质非常困难，本发明人长期致力于蜂胶的深度开发利用，并在长期研究的基础上建立了一套的从蜂胶中提取活性物质的方法体系。而且，在建立优化该方法体系的过程中，意外地发现所提取得到的物质能够有效地抑制粉尘螨过敏原的活性。众所周知，粉尘螨是一类主要存在于室内尘土中的 螨类，在世界范围内有60余种，仅中国就有34种。世界范围内统计结果证明居室内最优势的粉尘螨类是Dermatophagoides farinae品系。由于粉尘螨普遍存在于人类居住环境的灰尘中，可引起人体许多过敏反应如过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮肤疾患等。因此,粉尘螨越来越得到人们的重视。
toon] 粉尘螨过敏原的组成非常复杂，种类繁多。目前国际免疫联合会(mis)已经把粉尘螨过敏原进行了归纳和分类，共有14种之多。粉尘螨属于吸入性过敏原中最重要的一种，当灰尘被扬起时粉尘螨的虫体、尸体、粪便、卵及脱落下的皮壳等过敏原，随之进入人的呼吸系统，进而引发呼吸系统的过敏性疾病。从粉尘螨过敏原的免疫学参数比较可知，90%以上的粉尘螨过敏患者的IgE检测属于25kDa和14kDa两组过敏原，国际上将这两组最重要的过敏原组分分别命名为Der I和Der II过敏原。针对主要过敏原进行筛选确定和研究不仅有助于粉尘螨引发的过敏性疾病的临床诊断、提高免疫学治疗的安全性，而且有助于阐述粉尘螨的发病机理。粉尘螨引发的过敏性疾病引发的过敏性疾病包括支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮肤疾病等疾病。随着人们生活水平的提高、生活方式的变化和环境污染，过敏性疾病的发病率普遍上升。研究发现通过减少环境中的粉尘螨数量，能有效降低儿童和青少年患过敏性疾病的危险，提高免疫治疗的效果。由此为降低过敏反应的发生，就要对粉尘螨相关的指标进行严格干预，如粉尘螨的活体数量、粉尘螨过敏原数量等。减少粉尘螨的数量可以通过物理方法和化学方法来实现常见的物理方法比如降低房间的相对湿度、使用防尘布、更换地毯、家具和及时清洁床上用品等，但是这些方法较为繁琐也难于控制；早在1976年Wharton就总结了 30种化学试剂对尘螨的室内活性测定，仅1%林丹(lindane)的杀螨活性较好。由于林丹毒性较高不容易降解，并没有被应用为室内杀螨剂商品化使用。当前市场上常用的杀螨剂仍主要集中于农用方向的开发，如拟除虫菊酯类(Pyrethroids)、l%虫螨磷(pirimiphos methyl)等多数为薰蒸毒剂,不能在室内长期使用；而且多数化学杀螨剂仅仅能够减少活体的数量，而不能有效的降低粉尘螨排泄物、残体等过敏原的数量，仍然会引起过敏性疾病的发生。所以化学方法控制粉尘螨数量在商品化应用中至今还存在很大的空白。常规物理化学方法的局限性以及现代生物学技术的发展，为治疗粉尘螨引起的过敏反应提出了新的思路有效的规避和减少粉尘螨过敏原在环境中的数量，才是针对致敏源头进行控制的有效措施。
目前急需能够有效抑制灰尘螨过敏原、低毒、绿色环保的抑螨/杀螨剂。本发明人为了解决这个问题。本发明不仅为蜂胶的深度开发提供了高效的方法体系，而且还提供了蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质。
发明内容
蜂胶虽然含有很多不同的活性物质，但是由于蜂胶的成分复杂，特别是由于其含有大量的树脂、蜂蜡和花粉，因此从蜂胶中提取或分离出活性物质一直是一个非常棘手的技术难题。另一方面，蜂胶由于产量低，原料价格高，因此非常希望鉴定出蜂胶中的活性物质以期能够利用任何合成的方式合成出同样的活性物质，从而减少对蜂胶原料的依赖。根据本发明，提供了一种蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的分离方法，其中，所述方法包括如下步骤1)使用乙醇溶剂对蜂胶进行浸提；和2)进行固液分离然后去除液相中的乙醇，获得作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的浸提膏。其中，所述乙醇溶剂为乙醇水溶液，浓度为35体积％至95体积％。
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其中，所述浓度为55体积至95体积％。其中，所述浓度为75%。其中，在浸提时液料比为1:3至1:20，所述液料比为蜂胶克数与乙醇溶剂毫升数的比例。其中，所述液料比为1:5至1:15。其中，所述液料比为1:5。其中，浸提是在4°C至50°C进行。其中，浸提是在25 °C至45 °C进行。其中，所述方法进一步包括利用层析法对所述浸提膏分离的初次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的初次分离物。其中，所述层析法使用薄层层析法进行。其中，所述层析法使用的样品为所述浸提膏在三氯甲烷中的分散体。 其中，所述层析法使用的洗脱剂为三氯甲烷与甲醇的混合洗脱剂。其中，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1至5:5。其中，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1至95:5。其中，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1。其中，所述方法进一步包括利用薄层层析法对所述初次分离物进行分离的二次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的二次分离物。其中，所述薄层层析法为基于玻璃的薄层层析法。其中，所述二次分离物包含作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的山奈酚和/或白杨素。本发明还提供了由以上技术方案的方法分离得到的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质。本发明还提供了由上述技术方案所述的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质在制备用于治疗由粉尘螨过敏原引起的疾病的药物中的用途。本发明方法能够从蜂胶中有效地提取活性物质，并且提供了蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质，因此不仅能够为蜂胶的深度开发利用提供了高效的方法体系，而且粉尘螨过敏原引起的各种疾病提供了新的预防和治疗途径。
图I是不同蜂胶样品处理后粉尘螨SDS凝胶电泳图。M为分子标记(Marker,Bio-Rad All Blue:Catalog#161-0373);C为空白对照粉尘螨浸提液蛋白质条带；1 13为经YP-I YP-13处理的粉尘螨浸提液蛋白质条带。图2是YP-7初次分离产物薄层层析色谱图。展开剂为三氯甲烷甲醇=9:1。图3是YP-7初次分离产物处理后粉尘螨SDS凝胶电泳图。注M为MarkeKBio-RadAll Blue:Catalog#161-0373);C为空白对照粉尘螨浸提液蛋白质条带；C1 C8为经Cl CS处理的粉尘螨浸提液蛋白质条带。图4是YP-7-C2第二次分离产物色谱图。对C21、C22、C23进行粉尘螨过敏原抑制活性分析。C21和C22组分的抑制活性均较好，可以进行深入的分析，确定其化学组成。·图5是YP-7-C2 二次分离产物处理后粉尘螨SDS凝胶电泳图，M为分子标记(Marker, Bio-Rad All Blue:Catalog#161_0373);C为空白对照粉尘螨浸提液蛋白质条带；C21 C23为经C21 C23处理的粉尘螨浸提液蛋白质条带。图6是YP-7-C21高效液相色谱图。图7是YP-7-C21多级质谱图。图8是YP-7-C21核磁共振波谱图。图9是YP-7-C22高效液相色谱图。图10是YP-7-C21多级质谱图。 图11是YP-7-C22核磁共振波谱图。
具体实施例方式下面将对本发明的具体实施方式
进行说明，但是这些实施方式仅为举例说明目的，不应解释为是对本发明的范围进行的限制。如上所述，蜂胶的成分非常复杂，并且由于含有树脂、蜂蜡、花粉等物质，非常难以将其中的活性物质进行提取或分离。而且蜂蜡产量少，价格高，非常需要确认其中的活性物质，以期使用其他途径来源的活性物质来代替蜂蜡。本发明人长期致力于蜂蜡的深度开发利用，意外地发现蜂蜡浸提物的产率在特定的溶剂、溶剂浓度、液料比和/或温度条件下可以得到明显的提高，从而建立了一种高效的用于蜂蜡浸提的方法体系。于是，在本发明的第一方面，提供了一种从蜂胶中分离抗粉尘螨过敏活性物质的方法，其中，所述方法包括如下步骤1)使用乙醇溶剂对蜂胶进行浸提；和2)进行固液分离然后去除液相中的乙醇，以由液相获得作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的浸提膏。在一些实施方式中，所述乙醇溶剂优选为乙醇水溶液，该水溶液的浓度优选为35体积％至95体积％，更优选为所述浓度为55体积至95体积％，最优选为75%。在一些实施方式中，在浸提时蜂胶与乙醇溶剂的体积重量比(g/mL，简称液料比)为1:3至1:20，更优选为1:5至1:15，最优选为1:5。在一些实施方式中，浸提是在4°C至50°C进行，更优选在在25°C至45°C进行，最优选为在45°C进行。
本发明方法对固液分离方式没有特别限制，例如可以过滤或离心的方式进行。本发明对去除固液分离后得到的液相中的乙醇的方式也没有特别限制，但是考虑到乙醇具有易挥发性，因此优选采用旋转蒸发的方式进行。由以上方法得到的浸提膏可以直接用于制备抑制粉尘螨过敏原的药物，也可以用于活性物质的进一步分离纯化。在一些实施方式中，所述方法进一步包括利用层析法对所述浸提膏分离的初次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的初次分离物。优选的是，所述层析法使用柱层析法和/或薄层层析法进行。在一些优选的实施方式中，所述层析法优选为薄层层析法。用于进行层析法的样品优选为将以上方法得到的浸提膏分散在三氯甲烷中的分散体。本发明对于分散体中的浸提膏与三氯甲烷的比例没有特别限制，只要浸提膏能够充分分散在三氯甲烷中即可。在一些优选的实施方式中，所述层析法使用的洗脱剂为 三氯甲烷与甲醇的混合洗脱剂，更优选的是，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1至5:5，进一步优选的是，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1至95:5，最优选的是，所述三氯甲烷和甲醇的体积比为99:1。在一些优选的实施方式中，所述方法进一步包括利用柱层析法和/或薄层层析法对所述初次分离物进行分离的二次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的二次分离物。在一些实施方式中，优选使用薄层层析法。更优选的是，所述薄层层析法为基于玻璃的薄层层析法。在一些优选的实施方式中，所述二次分离物包含作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的山奈酚和/或白杨素，更优选的是，所述二次分离物包含作为主要活性物质的山奈酚和/或白杨素。在一些实施方式中，所述二次分离物包含作为主要活性物质的山奈酚。在一些实施方式中，所述二次分离物包含作为主要活性物质的白杨素。本发明的方法对于蜂胶的来源没有特别限制，但是优选所述蜂胶为中国蜂胶。在本发明的第二方方面，提供了由以上方法浸提或分离得到的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质。在本发明的第三方面，提供了由以上方法浸提或分离得到的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质在制备用于治疗由粉尘螨过敏原引起的疾病的药物中的用途。实施例为了进一步更容易理解本发明，本发明在下文将以实施例的形式对本发明进行更为详细地说明，但是这些实施例仅为说明目的，不应理解为式对本发明的范围进行限制。实施例I蜂胶浸提方法体系的建立I材料和方法I. I 材料I. I. I材料的采集实验人员从2009年在以湖北省康思农蜂产品有限公司为依托，通过与蜂农直接联系及自己采样的方式，获得了蜂胶样品。该蜂胶呈棕褐色、团块状，蜂种为意蜂采集地环境多有杨树和松树等。将采集样品置于一 20°C下冷藏数日，待其处于坚硬状态后，粉碎为小块状，存放于4 °C冰箱中备用。表2-1中国不同地域蜂胶样品特征
代码采集时间采集地点颜色外形蜂种胶源植物
12009.12.25湖北武汉棕褐色团块状意蜂楊树，松树等
22010.04,02山东沂蒙山E蒙阴县棕绿色团块状意蜂杨树、松树等
32010.04.18山东济宁黄绿色团块状意蜂+ 蜂揚树、松树等
42010.04.18山东济宁灰褐色团块状意蜂蜂杨树、松树等· 52010.03.22湖北黄陂深黄色肢块状意蜂杨树、松树等
62010.04.18山东济宁黑色胶体状意蜂杨树、松树等
72010.03.20河北燕山山脉毛家裕黄棕色团块状意蜂杨树、松树等 §2010.04.09山东枣庄黃棕色固块状意蜂杨树、松树等
92010.04.18山东济宁墨绿色固块状意蜂杨树，松树等
102010.04.05河南漯河舞阳县黄褐色团块状意蜂场树，松树等
112010.04.05山东枣庄黃褐色國块状意蜂杨树，松树等
122010.03.15湖北武汉洪山S黄褐色碎渣状意蜂杨树、松树等
132010.03.27哈尔滨虎林市褐色片块状意蜂輪树、松财等I. I. 2主要仪器
恒温水浴锅KAB-201EYELA
微型试样输碎机FW80江苏国华电器有限公司
旋转蒸发仪NAJ-160EYELA
紫外分光光度计 UV-1700SHIMADZU
电子天平FA1004上海天平仪器厂1.1.3主要试剂无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷，均为分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司；I. 2 方法I. 2. I中国不同地域产蜂胶样品有效物质提取工艺优化蜂胶有效物质的提取产量由有机溶剂类型、液料比、提取温度、提取时间等因素影响，不同环境条件下所需要的最佳条件有很大差异。以湖北采集I号样品为例对以上因素进行考察，寻找最适合的实验室提取工艺。首先将经冷冻粉碎的I号蜂胶样品(10g)，分别溶于200mL的95%甲醇、乙醇、乙酸乙酯和三氯甲烷中，静置3d，过滤后在25°C条件下旋转蒸发，每种溶剂进行三次重复，计算其蜂胶提取率，进而筛选出最佳有机溶剂。同理依次对有机溶剂的浓度梯度、液料比和最佳温度进行单因素实验。以最佳组合条件对所有样品进行提取，各个样品取得的有效物质EEP (蜂胶乙醇提取物)编码为YP-I YP-13 ；2结果与分析
2. I中国不同地域产蜂胶样品有效物质提取最佳工艺2. I. I有机溶剂的选择用极性大小不同的有机溶剂对蜂胶样品进行粗提取，结果如表2-2。当选用甲醇、乙醇作为提取溶剂时，无显著性差异提取率均为40%以上，原则上均可以选为常用提取试剂。但是本研究以探索高效无毒的天然产物为目标，尽量避免有毒试剂的使用，故选择乙醇为浸提溶剂。表2-2不同有机溶剂对蜂胶有效物质产量的影响
^有效物质得率,％'·
溶剩重复I重复1丨重复 +
__IIl_
'~f W40.2840.6743.76 41.570±1.907 ab
乙醇41.3544.5746.22 44.047±2.477 a
乙酸乙酯39.9935.4140.23 38.543±2.716 b
三氯甲烷35.4133.2333.19 33.943土 1.270 c注提取温度为25°C，样品量为IOg (n=3)，显著水平p < 0. 05。2. I. 2乙醇溶液浓度的选择在选定提取液为乙醇后，对不同浓度的乙醇提取物进行有效物质得率的测定，选定最佳的浓度，结果如表2-3所不。表2-3不同乙醇浓度对蜂胶有效物质产量的影响
—乙...........................................................^tTog蜂胶的提取量/g 平均值土标准差有效物质
浓度/% 重复I重复n重复in%_得率/%
35 0.634 0.547 0.584 0.588士0.0445.88遗44 d~
45 0.876 0.961 0.847 0.895±0.0598.95±0.59 d
55 2.652 2.938 2.99 2.86ft±0.18228.60士 1.82 c
65 3.593 3.302 3.957 3.617±0.32836.17±3.28b
75 4.645 4.789 4.888 4.774+0.12247.74+1.22 a
85 4.356 4.746 4.389 4.497土0.21644.97土2.16 a
95_4.683_4.792_4.462 4.646土0.16846.46土丨.68 a注提取温度为25°C，样品量为IOg (n=3)，显著水平p=0. 05。统计分析表明，乙醇浓度在35% 75%的范围内进行梯度变化时，其有效物质的含量随乙醇浸提液浓度的升高而逐渐增加，平均提取率也逐步上升。各个浓度下的提取率存在显著性差异；乙醇浓度在75% 95%时有效物质的平均提取率无显著性差异。综合比较实验的可操作性，并为了更好的进行产业化推广应用，选取75%的乙醇浓度作为蜂胶提取的最佳浓度，进行后续提取操作。2. I. 3液料比的选择在对天然物质的有效物质进行提取的过程中，当样品量一定时，增加溶剂的量可以降低样品粒子周围的浓度极差，更有利于有效成分的溶出。因此实际生产过程中常常采用加大溶剂用量来获得较高的有效物质提取率。由表2-4统计分析表明，当蜂胶样品与75%乙醇溶液的液料比(蜂胶克数与乙醇毫升数的比例)在1:5 1:15范围内时，其有效物质的得率大于45%且均显著性差异。但是在天然物质的提取过程中，液料比过高虽然也可以将有效物质提取，但是会降低液料中蜂胶样品的浓度，大大延长了有效物质浓缩所需时间和能耗，不利于实际生产的使用。综合比较选取1:5的液料比作为75%的乙醇溶液提取过程中最佳液料比。表2-4不同液料比对蜂胶有效物质产量的影响
权利要求
1.一种蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的分离方法，其中，所述方法包括如下步骤 1)使用乙醇溶剂对蜂胶进行浸提；和 2)进行固液分离然后去除液相中的乙醇，获得作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的浸提膏。
2.如权利要求I所述的方法，其中，所述乙醇溶剂为乙醇水溶液，浓度为35体积％至95体积％。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述浓度为55体积至95体积％。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述浓度为75%。
5.如权利要求I至4任一项所述的方法，其中，在浸提时液料比为1:3至1:20，所述液料比为蜂胶克数与乙醇溶剂毫升数的比例。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述液料比为1:5至1:15。
7.如权利要求I至6任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括利用层析法对所述浸提膏分离的初次分离步骤，以得到作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的初次分离物。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述层析法使用柱层析法和/或薄层层析法进行。
9.由权利要求I至8任一项所述的方法分离得到的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质。
10.权利要求9所述的蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质在制备用于治疗由粉尘螨过敏原引起的疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的分离方法。在所述方法中，首先使用乙醇溶剂对蜂胶进行浸提。其次，进行固液分离然后旋转蒸发除去乙醇，获得作为蜂胶抗粉尘螨过敏活性物质的浸提膏。所述方法还通过柱层析和薄层层析法对浸提膏进一步分离得到活性组份。在所述方法中还可以包括对活性组份的化学结构鉴定，该步骤鉴定得到的物质为山奈酚和/或白杨素。本发明提供了从蜂胶中分离得到天然活性物质的方法以及该活性物质在抗粉尘螨过敏中的新用途。本发明不仅为蜂胶的深度开发利用提供了高效的方法体系，而且为粉尘螨过敏原引起的疾病提供了新的预防和治疗途径。
文档编号A61P33/14GK102784170SQ20121016244
公开日2012年11月21日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者安龙濬, 王沫, 陶文琦 申请人:华中农业大学