专利名称：一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法
技术领域：
本发明属于miRNA的应用领域，特别涉及一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法。
背景技术：
心血管疾病作为人类的第一杀手，其高发病率和死亡率一直颇受世界关注。因此，积极探询动脉粥样硬化的发病机制将对冠心病的治疗和预后起重要作用。迄今为止，人们对动脉粥样硬化的发病机理仍未完全明了。目前，科学界比较公认的是内皮细胞的炎症反应学说。当内皮细胞暴露于诸多危险因素如血管紧张素II的刺激吋，内皮细胞便处于炎症状态，其特点是上调的炎症基因如血管细胞粘附分子I (Vascular CellAdhesion Molecule 1，VCAMl)等能够大量锚定循环血中的炎症细胞并且在单核细胞化学趋化蛋白I (Monocyte Chemoattractant Protein-l, MCP-1)的作用下迁移至血管内膜 下形成巨曬细胞，它能够吞曬内皮下沉积的氧化低密度脂蛋白(oxidative Low DensityLipoprotein, oxLDL)形成泡沫细胞和脂质斑块,最终形成动脉粥样硬化。因此,炎症内皮细胞对炎性细胞的募集是动脉粥样硬化发生的关键步骤。在血管内皮炎症发生的起始阶段，血管紧张素(angiotensin) II等血管活性物质刺激下，内皮细胞发生炎性活化。活化的内皮细胞主要表现为ETS-I等转录因子的激活以启动下游炎性基因VCAMl，ICAMl，MCPl等的表达。其中ETS-I属于E26转化特异序列(E26Transformation-specific Sequence, ETS)转录因子家族。该家族成员表达谱广泛并且含有相同的ETS功能域，该功能域能够识别并特异结合于含有GGA(A/T)序列的启动/增强区的基因，从而调控下游基因的转录。Zhan等运用ETS-I+的小鼠模型研究发现，该模型采用血管紧张素-II刺激后内皮募集炎性细胞的能力以及血管重构的程度大大降低，这与ETS-I下游基因VCAM-1，MCP-1, PAI-I和p21CIP的表达抑制相关。因此血管紧张素-II的促血管炎症和血管重构作用主要是通过转录因子ETS-I引起的。MicroRNA是ー类由多细胞动物或植物基因的内含子、miRNA独立转录单位或基因簇编码的19 — 25个核苷酸(nucleotide, nt)大小的内源性单链RNA,它们在转录后水平沉默靶基因的翻译从而对生物体基因表达起到精细调节的作用。如果miRNA与靶mRNA的3’非翻译区(3’ UTR)匹配完全或接近完全，则该复合体降解靶mRNA;若两者序列部分匹配则通过抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因的表达。现已明确，它们在进化上有高度保守性，对诸如心血管疾病、肿瘤、干细胞分化和自我更新等生理病理过程起重要的调控作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法，该方法エ艺简单，成本低，采用化学合成的miR-222有效的抑制了炎症状态下内皮细胞对炎性细胞的募集，从而进一歩明确了动脉粥样硬化的发病机制，同时为冠心病的防治提供有效干预靶点。
本发明的一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法，包括(I)筛选miR-222靶基因并进行验证，利用重组血管紧张素II刺激内皮细胞，模拟动脉粥样硬化状态下内皮细胞的炎症反应；(2)利用化学合成的miR-222模拟物增加该miRNA在炎症内皮细胞的表达量；(3)利用实时荧光定量PCR技术检测步骤(2)中miR-222对内皮细胞炎症基因VCAMl和MCPlmRNA表达的抑制作用；(4)利用BCECF-AM荧光探针作为炎性细胞示踪因子，检测miR-222抑制炎症内皮细胞募集炎性细胞的能力。所述步骤(I)中的重组血管紧张素II的浓度为I U M，刺激时间为6h。
所述步骤(2)中的miR-222模拟物为包含miR-222核酸序列“茎-环”结构的发夹状结构，其主序列如下5’ -AGCUACAUCUGGCUACUGGGU-3’。所述步骤(4)中的BCECF-AM荧光探针浓度为50 y M，使用时稀释为5 y M。
_4] 有益.效果本发明エ艺简单，成本低，采用化学合成的miR-222有效的抑制了炎症状态下内皮细胞对炎性细胞的募集，从而进一歩明确了动脉粥样硬化的发病机制，同时为冠心病的防治提供有效干预靶点。
图I为计算机软件分析显示ETS-I的3’非翻译区存在ー个miR-222的作用靶点；图2为miR-222能够抑制携带ETS-I靶序列萤光素酶的相对活性；图3为miR-222能够抑制内皮细胞相关炎症基因VCAMl和MCPlmRNA水平的表达；图4为miR-222能够有效减少炎症状态下内皮细胞对炎性细胞的募集。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例II. miR-222靶基因的筛选方法运用TargetScan、PicTar等软件检索miR-222可能的祀基因，发现ETS-1基因的3’非翻译区(3’ UTR)含有I个miR-222的靶位点(附图I)。选定内皮细胞炎症相关的ETS-I作为候选被调控基因。2. miR-222靶基因的验证构建pGL3-ETSl-3’ UTR重组质粒，与miR-222模拟物共转染工具细胞293T，转染24h后冻融细胞一次,用专用裂解液裂解细胞,姆孔IOOii I,吹打均匀，充分裂解后样品备用。采用Promega公司的萤光素酶检测试剂盒，在1.5ml离心管中加入LARII 50 和裂解液5 u I混匀，酶标仪检测萤火虫萤光素酶；加入50 u I Stop&Glo溶液灭活萤火虫萤光素酶，酶标仪检测海肾萤光素酶。结果显示，转染从10-60nM到不同浓度的miR-对照对萤光素的表达均无影响。而转染10，30，60nM不同浓度的miR-222模拟物后萤光素的表达分别下降了约20%，40%和50%左右(见附图2)。3.实时荧光定量PCR检测内皮细胞炎症相关基因mRNA的表达以miR-222模拟物转染内皮细胞48h后，miR-222在细胞中的表达量增加了 25倍。此时再加入重组血管紧张素II，使其在培养液中的浓度为I PM，刺激内皮细胞6h。抽提内皮细胞总RNA。取Iu g反转录-实时荧光定量PCR反应，检测VCAMl，MCPl的表达。结果发现，同未增加miR-222表达量的内皮细胞相比，炎症因子VCAMl和MCPlmRNA的表达量均下降约20%左右(见附图3)。4.内皮细胞募集炎性细胞实验(I)内皮细胞的转染miR-222模拟物或miR-对照各40nM与转染试剂混合，内皮细胞按I X 105/ml密度 接种于12孔板进行转染。24h后换液，继续培养24h，总共48h。换无生长因子的内皮细胞培养液继续培养细胞12h对其进行饥饿干预。此时细胞应布满培养板底，形成单层细胞。(2).重组血管紧张素II激活内皮细胞的炎症反应更换上述步骤中的培养液，加入重组血管紧张素II，使其在培养液中的浓度为
IPM，刺激内皮细胞6h。(3).炎性细胞的荧光标记BCECF-AM荧光探针溶解于去离子水中，使其浓度为50 y M，超静台内采用超滤膜过滤以去除杂质和细菌，_20°C避光保存。炎症细胞培养于含10%FBS的1640培养液中。使用时将细胞吹散并计数。随后收集细胞于15ml无菌离心管中室温下7500rpm离心5min,弃上清。加入培养液重悬细胞，使其浓度达到I X 107/ml。取9ml上述细胞悬液加入新的无菌15ml离心管中，加入Iml浓度为50 ii M的BCECF-AM荧光探针溶液使其终浓度为5 y M。放入37°C培养箱中孵育30min，注意避光。将孵育后的细胞于室温下7500rpm离心5min，弃上清，加入1640培养液吹打数次以清洗细胞并重复此步骤2次。随后以IOml 1640培养液重悬细胞井吹打均匀。(4).内皮细胞与BCECF-AM荧光探针标记的炎症细胞粘附实验将上述刺激完毕的内皮细胞吸去培养液并以PBS清洗2次。加入BCECF-AM荧光探针标记的炎症细胞悬液lml，37°C培养箱中孵育45min。吸去培养液，以PBS清洗内皮细胞2-4次以洗去未与内皮细胞粘附的炎症细胞，注意避光。在荧光倒置显微镜下观察荧光，并在每个孔中随机选取5个视野对荧光进行计数。结果显示，采用血管紧张素II (I U M)刺激6h后，内皮细胞与炎症细胞的粘附能力明显升高，每视野有15-18个左右被内皮细胞粘附的炎症细胞。但转染miR-222模拟物的内皮细胞与炎症细胞的粘附能力明显下降，每视野只有6-10个粘附的炎症细胞。(见附图4)
权利要求
1.一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法，包括 (1)筛选miR-222靶基因并进行验证，利用重组血管紧张素II刺激内皮细胞，模拟动脉粥样硬化状态下内皮细胞的炎症反应； (2)利用化学合成的miR-222模拟物增加该miRNA在炎症内皮细胞的表达量； (3)利用实时荧光定量PCR技术检测步骤⑵中miR-222对内皮细胞炎症基因VCAMl和MCPlmRNA表达的抑制作用； (4)利用BCECF-AM荧光探针作为炎性细胞示踪因子，检测miR-222抑制炎症内皮细胞募集炎性细胞的能力。
2.根据权利要求I所述的一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法，其特征在于所述步骤(I)中的重组血管紧张素II的浓度为I μ Μ,刺激时间为6h。
3.根据权利要求I所述的一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法，其特征在于所述步骤(2)中的miR-222模拟物为包含miR-222核酸序列“茎-环”结构的发夹状结构，其主序列如下5’ -AGCUACAUCUGGCUACUGGGU-3’。
4.根据权利要求I所述的一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法，其特征在于所述步骤(4)中的BCECF-AM荧光探针浓度为50 μ Μ，使用时稀释为5 μ Μ。
全文摘要
本发明涉及一种应用miRNA抑制内皮细胞炎症反应的方法，包括(1)筛选miR-222靶基因并进行验证，利用重组血管紧张素II刺激内皮细胞，模拟动脉粥样硬化状态下内皮细胞的炎症反应；(2)利用化学合成的miR-222模拟物增加该miRNA在炎症内皮细胞的表达量；(3)利用实时荧光定量PCR技术检测miR-222对内皮细胞炎症相关基因VCAM1和MCP1mRNA表达的抑制作用；(4)检测miR-222抑制炎症状态的内皮细胞对炎性细胞募集的能力。本发明采用化学合成的miR-222有效的抑制了炎症状态下内皮细胞对炎性细胞的募集，从而进一步明确了动脉粥样硬化的发病机制，同时为冠心病的防治提供有效干预靶点。
文档编号A61K48/00GK102764441SQ201210179749
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者朱霓, 秦永文, 袁文俊, 赵仙先 申请人:中国人民解放军第二军医大学