专利名称：一种肌氨肽苷提取物及其组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体的说，涉及一种肌氨肽苷提取物及其组合物。
背景技术：
肌氨肽苷是以哺乳动物心肌为原料，采用现代生物技术提取制成的含有多种血管活性物质的药物，主要成分有心房肽、降钙素基因相关肽、腺苷等。其含有大量的多肽、氨基酸、核苷及核苷酸等成分。心房肽具有较强的利钠、利尿、舒张血管平滑肌和抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用。而降钙素基因相关肽是目前已知的体内最强的舒血管活性肽，是由降钙素基因表达和产生的一种37个氨基酸组成的生物活性多肽，可强烈地扩张血管，具有增加冠脉血流量、增强心肌收缩力、保护缺血心肌等作用。肌氨肽苷可用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛、心力衰竭、脑血管疾病、高血压等，作为一种极具潜力的心脑血管药物，临床应用十分广泛。
中国专利CN1522757公开了一种肌氨肽苷制备方法。其包括如下步骤取家兔心肌和肌肉，在5-15°C下，将心肌和肌肉用纯水冲洗至无血色，绞碎；然后加入注射用水匀浆，在-18 22°C冻结2(Γ30小时，再共冻融Γ7次；融化后粗滤，滤液加热至8(T85°C保持5^8分钟，迅速降温至室温，离心，上清液用微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜超滤，既得肌氨肽苷溶液。中国专利CN1824294的方法为，将兔子心肌和肌肉去除结缔组织后，按O. 78-0. 82 1与注射用水混合，用告诉组织捣碎机匀浆，放入_20°C冰柜冷冻3(Γ50小时，室温下融化，重复广3次，最后一次融化的组织液于恒温水浴中55°C保持3 4小时，调pH值为7，加入按组织液于重量Hg/升的活性碳，煮沸后低温下3000rpm离心30min ;上清液调pH值为5. 5飞.O,于室温中加入I. 5-2g升壳聚糖寡糖，然后调pH值为7. 2，用O. 22 μ m微孔滤膜过滤，I万分子量超滤膜超滤得肌氨肽苷溶液。为了提高多肽、次黄嘌呤等成分的提取率，现有技术无一例外的采用了较高温度。但是这种高温提取无疑会破坏其中的有效成分。使得有效成分含量始终难以有显著的提升。
发明内容
本发明第一目的在于提供一种肌氨肽苷提取物，本发明的提取物的制备方法避免了高温对肌氨肽苷有效成分的破坏；本发明第二目的在于提供含有所述肌氨肽苷提取物的肌氨肽苷组合物，本发明提供的肌氨肽苷组合物有效成分含量高。为了实现上述的发明目的，本发明采取了如下的技术方案首先，本发明提供了一种肌氨肽苷的提取物，所述提取物的制备方法包括如下步骤(I) 二氧化碳饱和取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至5 lOPa，保持压力2(T30min，然后分别通入二氧化碳，至压力为15 20MPa，保持压力2(T30min，再抽真充气反复2次；(2)冻融在转速70(T900rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量1(Γ15倍的液体二氧化碳中，加入时间为3(T40min，加毕，搅拌2h，降温至_80°C，保持6 10h，然后5 IOmin将温度升温至4(T50°C，将二氧化碳气化；(3)酶解按照重量比I :3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量O. 5 1%的弹性蛋白酶，3(T40°C下水解O. 5 Ih ;将肌肉组织溶液加入重量I. 2 I. 8%的木瓜蛋白酶，40 45°C下水解O. 5 Ih ；(4)后处理合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入 O. 3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用O. 22、. 30 μ m微孔滤膜过滤既得。常规方法提取无法避免高温的使用，如果采用较高温度，则对活性成分破坏严重；如果采用较低温度，提取效率又很差。本发明利用干冰升华导致的体积迅速膨胀，可以有效破坏细胞结构，使得细胞内有效成分提取率得以显著提升。而干冰的低温又使得有效成分得以最大程度的保留。本发明通过抽真空、通入二氧化碳反复多次，可以使得细胞内二氧化碳达到饱和，并最大限度的排除水分，减少了水分和其他气体对于提取的干扰。本发明经过反复研究，发现兔子心脏和肌肉采用不同方法提取，可以更有效地提取出有效成分。根据本发明所述的肌氨肽苷的提取物，优选所述方法包括如下步骤(I)二氧化碳饱和取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至8Pa，保持压力25min，然后分别通入二氧化碳，至压力为18MPa，保持压力25min，再抽真充气反复2次；(2)冻融在转速SOOrpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量13倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80°C，保持8h，然后7min将温度升温至45°C，将二氧化碳气化；(3)酶解按照重量比I :3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量O. 8%的弹性蛋白酶，35°C下水解O. 8h ;将肌肉组织溶液加入重量I. 6%的木瓜蛋白酶，43°C下水解O. 8h ；(4)后处理合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入O. 3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用O. 22 μ m微孔滤膜过滤既得。根据本发明所述的肌氨肽苷的提取物，优选步骤(4)所述离心为转速3000rpm下离心30min。其次，本发明还提供了一种含有本发明所述肌氨肽苷提取物的肌氨肽苷组合物。根据本发明所述的肌氨肽苷组合物，所述组合物中还加入赋形剂制成水针、粉针或冻干粉针。所述水针、粉针或冻干粉针的制备可以参考现有技术的方法。
譬如，将得到的组合物冻结至-30°C以下，抽真空至真空度15Pa以下，升温至_5、°C，升华干燥，再升温至3(T40°C，干燥3小时，分装得到粉针。或者将得到的组合物加入注射用水稀释，分装后得到水针。或者加入步骤(4)得到的组合物重量2倍的甘露醇，加入组合物重量5倍的注射用水，搅拌均匀，分装后降温至-3(T-50°C，保温5小时，抽真空至真空度为10Pa，按照f 2°C /小时升温，至0°C，保温2小时，再按5 10°C /小时升温至3(T40°C，保温4小时，压塞既得。根据本发明所述的肌氨肽苷组合物，优选所述赋形剂选自甘露醇、右旋糖酐或葡萄糖。本发明所提供的肌氨肽苷组合物有效成分含量高，故治疗效果优于现有技术产品O
具体实施方式
以下用实施例对本发明的技术方案作更详细的解释说明，但其并非是对本发明的限制。实施例I二氧化碳饱和取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至8Pa，保持压力25min，然后分别通入二氧化碳，至压力为18MPa，保持压力25min，再抽真空、充气反复2次；冻融在转速SOOrpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量13倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80°C，保持8h，然后7min将温度升温至45°C，将二氧化碳气化；酶解按照重量比I :3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量O. 8%的弹性蛋白酶，35°C下水解O. 8h ;将肌肉组织溶液加入重量I. 6%的木瓜蛋白酶，43°C下水解 O. 8h ；后处理合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入O. 3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用O. 22 μ m微孔滤膜过滤既得。实施例2二氧化碳饱和取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至5Pa，保持压力25min，然后分别通入二氧化碳，至压力为16MPa，保持压力28min，再抽真空、充气反复2次；冻融在转速SOOrpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量11倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80°C，保持7h，然后7min将温度升温至40°C，将二氧化碳气化；酶解按照重量比I :3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量O. 9%的弹性蛋白酶，35°C下水解O. 5h ;将肌肉组织溶液加入重量I. 7%的木瓜蛋白酶，40°C下水解 O. 8h ；后处理合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入O. 3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用O. 22 μ m微孔滤膜过滤既得。实施例3二氧化碳饱和取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至8Pa，保持压力22min，然后分别通入二氧化碳，至压力为15MPa，保持压力30min，再抽真空、充气反复2次；冻融在转速SOOrpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量14倍的液体二氧化碳中，加入时间为30min，加毕，搅拌2h，降温至_80°C，保持6h，然后IOmin将温度升温至50°C，将二氧化碳气化；酶解按照重量比I :3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量1.0%的弹性蛋白酶，39°C下水解O. 9h ;将肌肉组织溶液加入重量I. 2%的木瓜蛋白酶，44°C下水 解 I. Oh ；后处理合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入O. 3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用O. 22 μ m微孔滤膜过滤既得。实施例4二氧化碳饱和取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至IOPa,保持压力20min,然后分别通入二氧化碳，至压力为20MPa,保持压力25min,再抽真空、充气反复2次；冻融在转速900rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量13倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80°C，保持8h，然后7min将温度升温至45°C，将二氧化碳气化；酶解按照重量比I :3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量O. 5%的弹性蛋白酶，32°C下水解I. Oh ;将肌肉组织溶液加入重量I. 3%的木瓜蛋白酶，45°C下水解 O. 5h ；后处理合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入O. 3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用O. 22 μ m微孔滤膜过滤既得。实施例5二氧化碳饱和取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至9Pa，保持压力30min，然后分别通入二氧化碳，至压力为18MPa，保持压力20min，再抽真空、充气反复2次；冻融在转速700rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量15倍的液体二氧化碳中，加入时间为40min，加毕，搅拌2h，降温至_80°C，保持10h，然后5min将温度升温至45°C，将二氧化碳气化；酶解按照重量比I :3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量O. 7%的弹性蛋白酶，30°C下水解O. 8h ;将肌肉组织溶液加入重量I. 8%的木瓜蛋白酶，43°C下水解 O. 6h ；后处理合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入O. 3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用O. 30 μ m微孔滤膜过滤既得。实施例6取实施例I得到的组合物，加入组合物重量2倍的甘露醇，加入组合物重量5倍的注射用水，搅拌均匀，分装后降温至-3(T-50°C，保温5小时，抽真空至真空度为10Pa，按照Γ2Γ /小时升温，至0°C，保温2小时，再按5 10°C /小时升温至3(T40°C，保温4小时，压
塞既得。实施例7取实施例I得到的组合物，加入组合物重量3倍的右旋糖酐，加入组合物重量5倍的注射用水，搅拌均匀，分装后降温至-3(T-50°C，保温5小时，抽真空至真空度为lOPa，按照f 2°C /小时升温，至0°C，保温2小时，再按5 10°C /小时升温至3(T40°C，保温4小时，压塞既得。 试验例I本试验例比较了本发明方法制备的肌氨肽苷组合物与现有技术常规方法制备的有效成分含量比。其中实施例I飞为按照重量比I :3取家兔心脏和肌肉共Ikg制备；为了平行对比，对比I飞也按照重量比I :3取家兔心脏和肌肉共Ikg制备，并在最后均用注射用水将产品调整到相同体积。检测条件为仪器waterS1525高效液相色谱仪(2487双通道可调波长紫外检测器)色谱柱C18(3. 9X150mm)试剂磷酸二氢钾(优级纯)甲醇(色谱纯)流动相:磷酸二氢钾(O.001mol/l ρΗ6· 9)-甲醇(100 :0. 2)色谱条件检测波长260nm，柱温32°C流速I.Oml/min
表I组合物中多肽、次黄嘌呤含量(mg/ml)
产品实施例I 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
~WW39. 57 38.95 38. 14 38. 34 39. 10~
次黄嘌呤 12. 54 11.25 10. 12 9 9710.24~
产品对比I 对比2 对比3 对比4 对比5~
~WW27. 52 17.95 Τδ9 Γθ3 Τ δ
次黄嘌呤 4 81 L24 Γ25 70 025其中对比I制备为按I :3比例取家兔心脏和肌肉，除去脂肪，洗净，加2倍注射用水，匀浆，调节pH值为3. O，按O. 2%比例加入胃蛋白酶，加热至4(T45°C，保温搅拌8h，调节pH为7，按O. 1%比例加入木瓜蛋白酶，控制温度45 521，搅拌211，调节？!1为3.0，煮沸20min,迅速冷却至室温后于(Γ5冷藏12h，取上清液，调节pH至10. 5，煮沸20min，迅速冷却至室温后于(T5°C冷藏12h，取上清液，调节pH至7，按1%比例加入活性碳，煮沸30min，滤除活性碳，用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，再用分子量为10000的超滤柱超滤，滤液置_20°C冷藏。对比2制备为按I :3比例取家兔心脏和肌肉，肌肉除去脂肪，洗净，绞碎，按重量I :0. 5加纯化水，匀浆两次，细度5 μ m，-30°C以下冷冻12小时，置于30°C水浴箱中融化，反复冻融2次。加热至80°C，20min后降温至30°C，用滤布过滤；心脏除去脂肪，洗净，绞碎，加入I倍O. 14mol/L NaCl溶液搅拌lOmin，匀浆2次，细度5 μ m，用冰醋酸调节pH至3. O，匀浆液以3000rpm离心lOmin，上清液加入乙醇，使含醇量达60%，置(T4°C空气中静置12小时，虹吸上清液，沉淀物以3000rpm离心15min，反复2次，取沉淀物用O. 9%NaCl溶解，再以3000rpm离心15min，取上清液，合并上清液。合并心脏与肌肉的提取液，加入O. 01%活性碳脱色，再用O. 22 μ m滤膜过滤，既得。
对比3制备为按I :3比例取家兔心脏和肌肉，肌肉除去脂肪，洗净，加入2倍注射用水，绞碎匀浆。浆液于_20°C冻48小时，取出，室温化冻，加热煮沸分离上清液，上清液用NaOH调pH9-10，煮沸20-30分钟，冷却，取上清液，调pH至7-7. 5，上述溶液再调pH至9_10，煮沸30分钟，冷却，取上清液，上清液调pH7-7. 5，分级超滤，先过分子量I万道尔顿的中空纤维超滤器，然后再过分子量3000道尔顿超滤柱一次。超滤液于121°C热压15分钟，冷却至室温，于-20°C冷冻过夜，取出自然化冻，过I万分子量超滤器一次，既得。对比4制备为按I :3比例取家兔心脏和肌肉，肌肉除去脂肪，洗净，加入2倍注射用水混合，匀浆，放入-20°C冷冻48小时，室温融化，反复3次，得到的组织液于55°C恒温4小时，调pH为7，加入2%。的活性碳，煮沸20分钟，低温3000rpm离心30min。上清液调pH为5. 5-6. O,室温加入I. 5g/升壳聚糖寡糖，调pH为7. 2，用O. 22 μ m滤膜过滤，I万分子量超滤膜超滤得肌氨肽苷溶液。对比5制备为按I :3比例取家兔心脏和肌肉，肌肉除去脂肪，洗净，加入2倍注射用水混合，高速匀浆机匀浆，冷却至4°C放置2h，加Ig/升硅藻土，105°C加热8min，板框压滤机压滤，用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，8000分子量超滤膜超滤，既得。
权利要求
1.一种肌氨肽苷提取物，其特征在于，所述提取物的制备方法包括如下步骤 (1)二氧化碳饱和取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至5 lOPa，保持压力2(T30min，然后分别通入二氧化碳，至压力为15 20MPa，保持压力.2(T30min，再抽真空、充气反复2次； (2)冻融在转速70(T900rpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量1(Γ15倍的液体二氧化碳中，加入时间为3(T40min，力口毕，搅拌2h，降温至-80°C，保持6 10h，然后5 IOmin将温度升温至4(T50°C，将二氧化碳气化； (3)酶解按照重量比I:3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量O. 5^1%的弹性蛋白酶，3(T40°C下水解O. 5 Ih ;将肌肉组织溶液加入重量I. 2^1. 8%的木瓜蛋白酶，.40 45°C下水解O. 5 Ih ； (4)后处理合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入O.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用O. 22、. 30 μ m微孔滤膜过滤既得。
2.根据权利要求I所述的肌氨肽苷提取物，其特征在于，所述方法包括如下步骤 (O 二氧化碳饱和取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，分别匀浆，然后再分别抽真空至.8Pa，保持压力25min，然后分别通入二氧化碳，至压力为18MPa，保持压力25min，再抽真空、充气反复2次； (2)冻融在转速SOOrpm下，将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别缓慢加入到体积分别为兔子心脏和肌肉重量13倍的液体二氧化碳中，加入时间为35min，加毕，搅拌2h，降温至-80°C，保持8h，然后7min将温度升温至45°C，将二氧化碳气化； (3)酶解按照重量比I:3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入2倍重量的注射用水中，搅拌均匀，分别得心脏组织溶液和肌肉组织溶液，将心脏组织溶液加入重量O. 8%的弹性蛋白酶，35°C下水解O. 8h ;将肌肉组织溶液加入重量I. 6%的木瓜蛋白酶，43°C下水解 O. 8h ； (4)后处理合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入O.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，用O. 22 μ m微孔滤膜过滤既得。
3.根据权利要求I或2所述的肌氨肽苷提取物，其特征在于，步骤(4)所述离心为转速.3000rpm 下离心 30min。
4.含有权利要求f3任意一项所述肌氨肽苷提取物的肌氨肽苷组合物。
5.根据权利要求4所述的肌氨肽苷组合物，其特征在于，所述组合物中还加入赋形剂制成水针、粉针或冻干粉针。
6.根据权利要求5所述的肌氨肽苷组合物，其特征在于，所述赋形剂选自甘露醇、右旋糖酐或葡萄糖。
全文摘要
本发明涉及一种含多肽、氨基酸、核苷及核苷酸等药物组合成份的肌氨肽苷提取物及其组合物，其制备包括如下步骤取兔子心脏和肌肉，去除脂肪，匀浆，抽真空，通入二氧化碳，再抽真空、充气反复2次；将二氧化碳饱和的兔子心脏和肌肉浆分别加入到液体二氧化碳中，搅拌，降温至-80℃，保持6～10h，升温至40～50℃，按照重量比1∶3分别取冻融后的兔子心脏和肌肉，分别加入注射用水中，将心脏组织溶液加入弹性蛋白酶，将肌肉组织溶液加入木瓜蛋白酶；合并酶解后的心脏组织溶液和肌肉组织溶液，离心，取上清液，加入0.3倍重量的活性碳，室温下搅拌30min，微孔滤膜过滤即得。所述提取物制备的组合物中还加入赋形剂制成水针、粉针或冻干粉针。
文档编号A61P9/10GK102697810SQ20121020324
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者夏智红 申请人:夏智红