专利名称：mTOR作为标靶在筛选治疗尼古丁成瘾药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及mTOR作为标靶在筛选治疗尼古丁成瘾药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
吸烟有害健康已成为全社会关注的公共卫生问题，吸烟会引发癌症、心脑血管、呼吸道及消化道疾病等疾病，全世界每年因吸烟死亡的人数达500多万，与烟草相关的疾病占全球死因第一位。据卫生部《2007年中国控制吸烟报告》报道中国是世界上最大的烟草生产国和消费国，烟草生产量占世界总量的三分之一，至2006年末，我国吸烟者达3. 5亿，占全球吸烟总人数的三分之一，被动吸烟者5. 4亿，每年约有100万人死于吸烟相关疾病，因吸“二手烟”导致死亡的人数已超过10万，预计到2020年我国每年将有200万人死于吸、烟相关疾病。这相当于每Ils就有I人被烟草夺去生命。研究表明，吸烟成瘾性物质主要是尼古丁，但是目前市场上缺乏有效的戒烟产品。戒烟难，无有效药，主要与烟中的尼古丁有关。吸烟成瘾其实质是尼古丁依赖，1998年WHO《国际疾病分类(第10版)》已将烟草依赖列为一种慢性病，即属于精神和行为障碍的烟草依赖综合征。戒烟是对一种慢性病的治疗，本质是戒除对尼古丁的依赖。目前，戒烟主要采用针对尼古丁受体的替代疗法(nicotine replacementtherapy, NRT)和对症治疗，现在在中国比较流行的戒烟产品“如烟”就是此类产品，但是根据使用该产品的人群表示，产品的戒烟作用十分有限。目前针对戒烟的有效靶标有限，导致药物开发受到限制，寻求戒烟新靶点对于尼古丁成瘾治疗迫在眉睫。已有的研究表明，尼古丁通过作用于中枢神经系统的中脑边缘多巴胺系统产生强烈的奖赏和兴奋效应，同时使中脑边缘多巴胺系统发生长期神经可塑性变化Ueuroplasticity)导致强烈的心理渴求及精神依赖和敏化作用。中脑边缘多巴胺系统包括腹侧被盖区(ventral tagmental area, VTA)、伏隔核(nucleus accumbens, NAc)、杏仁核(amygdala, Amg)、前额叶皮层(prefrontal cotex, PFC)、海马(hippocampus, Hip)等。最新研究报道尼古丁主要激活伏隔核shell (nucleus accumbens shell, Nac shell)和基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala, BLA),伏隔核shell与药物奖赏有关，而基底外侧杏仁核主要与药物敏化有关(Dao JM, et al. Neuropsychopharmacology. 2011Jun; 36 (7) :1319-31)。尼古丁作用于中脑边缘多巴胺系统的不同靶点，如伏隔核、杏仁核、引起多巴胺释放异常增加，激活特异性受体及受体后一系列信号转导通路后，一方面直接激活神经元内功能蛋白发挥奖赏和敏化效应；另一方面，信号转导通路中的信号分子通过跨膜转运进入细胞核，从而对基因的表达进行调控，生成新的蛋白，导致神经发生结构和功能长期可塑性改变，形成持久稳固依赖和敏化。因此，抑制神经发育过程中异常神经可塑性是尼古丁物质成瘾对因治疗的关键所在，从而针对其研发新药有望达到根除烟瘾的效果。哺乳动物雷帕霉素革E蛋白(mammalian target of Rapamycin, mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其参与的信号转导通路控制的蛋白合成参与了神经可塑性形成(Dash PK, et al. J Neurosci, 2006, 26 (31) : 8048-56. Parsons RG, et al. JNeurosci, 2006, 26 (50) : 12977-83)。但目前是否在尼古丁成瘾中起着关键的作用以及是否可以作为戒烟药物作用的靶标未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供mTOR作为标靶在筛选治疗尼古丁成瘾药物中的应用。本发明经腹腔注射急、慢性给予大鼠尼古丁 lmg/kg、0. 35mg/kg造模，采用ffestern-blot检测mTOR激活情况；在此基础上，注射尼古丁受体抑制剂，观察对尼古丁激活mTOR活性的影响；且于mTOR活性特异性变化的脑区给予其抑制剂雷帕霉素，观察对大鼠条件位置偏爱和敏化形成情的影响。结果可见，急、慢性给药后增加中脑边缘多巴胺系统伏隔核和杏仁体的mTOR活性，于与奖赏相关的脑区伏隔核shell给予雷帕霉素可抑制大鼠条件位置偏爱的形成，于与敏化相关的脑区基地外侧杏仁体给予雷帕霉素可抑制大鼠敏化的形成。表明mTOR在尼古丁成瘾中起着重要的作用，针对其设计药物有望戒除烟瘾。本发明中所述的哺乳动物雷帕霉素祀蛋白(mammalian target ofRapamycin, mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，雷帕霉素(rapamycin)是其天然的抑制齐U，其信号转导通路在外周组织中的作用已经比较明确，上游信号如生长因子、营养物质、氨基酸、葡萄糖等激活mTOR激酶，mTOR进一步磷酸化下游靶分子，从而参与细胞周期的调控及基因转录后蛋白翻译的调控，促进细胞的生长(。在中枢神经系统中的作用目前研究的较少，已知mTOR信号转导通路控制的蛋白合成参与了突触可塑性的长时程增强及长时程易化的过程，并在空间记忆及恐怖性记忆的形成、巩固及再巩固的过程中起重要作用。体外神经元培养研究表明，神经营养因子BDNF、神经递质谷氨酸、多巴胺可作用于神经细胞激活mTOR激酶,进一步激活下游祀分子核糖体蛋白S6激酶(ribosomal proteinS6 kinases, S6K)和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白I (the eIF4E_binding protein1，4E-BPI)启动胞体及树、轴突中多种蛋白的合成，从而参与细胞的生长及长时程增强等神经可塑性过程。在实验研究中，多采用P70s6k磷酸化状态间接反应mTOR信号转导通路的激活情况。本发明为治疗尼古丁物质成瘾提供了一种针对病因维持治疗的靶点，有望从根本上治疗尼古丁物质成瘾及防止停药后的复发。
图I为尼古丁激活大鼠伏隔核中shell脑区内p70s6k磷酸化。由图可见Nicotine组大鼠伏隔核中shell脑区内p70s6k磷酸化水平明显高于生理盐水组，而p70s6k总蛋白的含量两组水平相当(*代表P〈0. 05 )。图2为尼古丁激活大鼠BLA脑区内p70s6k磷酸化。由图可见Nicotine组大鼠BLA脑区内p70s6k磷酸化水平明显高于生理盐水组，而p70s6k总蛋白的含量两组水平相当(* 代表 P〈0. 05)。图3为尼古丁抑制剂Mecamylamine阻断尼古丁激活大鼠伏隔核中shell脑区内p70s6k磷酸化。由图可见Nicotine组大鼠伏隔核中shell脑区内p70s6k磷酸化水平明显高于生理盐水组，Mecamylamine与对照组没有显著性差异,而p70s6k总蛋白的含量两组水平相当代表P〈0. 05)。图4为尼古丁抑制剂Mecamylamine阻断尼古丁激活大鼠BLA脑区内p70s6k磷酸化。由图可见Nicotine组大鼠BLA脑区内p70s6k磷酸化水平明显高于生理盐水组，Mecamylamine与对照组没有显著性差异，而p70s6k总蛋白的含量两组水平相当(*代表P〈0.05)。图5为mTOR抑制剂Rapamycin阻断尼古丁条件位置偏爱的形成(A)和大鼠伏隔核中shell脑区内p70s6k磷酸化激活(B)。由图A可见Nicotine组大鼠条件位置偏爱形成，Rapamycin组与对照组没有显著性差异；由图B可见Nicotine组大鼠伏隔核中shell脑区内p70s6k磷酸化水平明显高于生理盐水组，Rapamycin组与对照组没有显著性差异，而p70s6k总蛋白的含量两组水平相当(*代表P〈0. 05)。 图6为mTOR抑制剂Rapamycin阻断尼古丁敏化的形成(A)和大鼠BLA脑区内p70s6k磷酸化激活(B)。由图A可见Nicotine组大鼠敏化形成，Rapamycin组与对照组没有显著性差异；由图B可见Nicotine组大鼠BLA脑区内p70s6k磷酸化水平明显高于生理盐水组，Rapamycin组与对照组没有显著性差异,而p70s6k总蛋白的含量两组水平相当(*代表 P〈0. 05)。
具体实施例方式下面以实施例对本发明做进一步的说明，但是不对本发明的保护范围构成任何限制。实施例I :尼古丁单次给药对大鼠中脑边缘多巴胺系统伏隔核shell和基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala, BLA)的p70s6k磷酸化活性的影响p70s6k是mTOR下游激活蛋白，控制蛋白合成的作用，其激活状态可反应mTOR的活性。材料与方法药品及试剂Nicotine sigma-N0267 ;DMS0等试剂均为市售分析纯试剂。动物SPF级SD雄性大鼠，体重220_250g。武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为NO. 00014833，生产许可证号SCXK (鄂)2003-2004。鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。实验方法动物分组与处理大鼠随机分为生理盐水和尼古丁给药组。给药均采用腹腔注射，与给药后I小时断头取脑进行蛋白质活性检测。动物造模大鼠(n=16)分为2组，分别腹腔注射给于生理盐水和2. 5mg/kg尼古丁，I小时后断头处死，速剥离全脑，速冻后取脑区伏隔核shell (nucleus accumbensshell, Nacshell)和基底外侧杏仁核(Basolateral amygdala, BLA),裂解组织,提取蛋白，变性保存。检测指标各组大鼠样本处理后，米用Western blot检测尼古丁引起p70s6kNAc shell和BLA中磷酸化水平变化。扫描蛋白胶片进行定量分析，得出尼古丁实验组较对照组的变化比值。实验结果I.尼古丁单次给药增加大鼠隔核shell和BLA的p70s6k磷酸化活性大鼠皮下注射尼古丁(lmg/kg)后可引起中脑边缘多巴胺系统伏隔核(nucleusaccumbens shell, NAc shell)和 BLA 的 p70s6k 憐酸化水平增高 Ac shell F(I, 49)=9. 525, p<0. 01 ；BLA F (1,49) = 12. 325，p〈0. 01 )，而 p70s6k 总蛋白的含量两组水平相当，如图1、2所示。
实施例2 :尼古丁受体拮抗剂对其引起大鼠中脑边缘多巴胺系统伏隔核shell和BLA的p70s6k磷酸化活性变化的影响本实施例选择Mecamylamine作为抗尼古丁作用的拮抗剂，探讨Mecamylamine是否可以减弱尼古丁对伏隔核shell的mTOR激活。材料与方法药品及试剂Mecamylamine sigma-M9020 ；DMS0等试剂均为市售分析纯试剂。动物SPF级SD雄性大鼠，体重220_250g。武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为NO. 00014833，生产许可证号SCXK (鄂)2003-2004。鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。实验方法动物分组与处理大鼠随机分为4组，分别是生理盐水组、生理盐水+Mecamylamine组、尼古丁给药组和Mecamylamine+尼古丁给药组。给药均采用腹腔注射。动物造模大鼠(n=32)分为4组，分别预先腹腔注射溶媒、Mecamylamine、溶媒和Mecamylamine, 30min后再分别给予生理盐水、生理盐水、尼古丁和尼古丁，1小时后断头处死，速剥离全脑，速冻后取脑区伏隔核shell和BLA，裂解组织，提取蛋白，变性保存。检测指标各组大鼠样本处理后，米用Western blot检测尼古丁引起p70s6kNAc shell和BLA中磷酸化水平变化。扫描蛋白胶片进行定量分析，得出Mecamylamine组相对于尼古丁组变化的比值。实验结果I.尼古丁受体拮抗剂阻断尼古丁激活伏隔核shell和BLA的p70s6k磷酸化活性大鼠皮下注射Mecamylamine后可阻断尼古丁引起中脑边缘多巴胺系统伏隔核(nucleus accumbens shell, NAc shell)和 BLA 的 p70s6k 憐酸化水平增高(NAc shell F(3,49)= 16. 152，p〈0. 01 ；BLA F (3,49)= 19. 364，p〈0. 01)，而 p70s6k 总蛋白的含量四组水平相当，如图3、4所示。实施例3 :伏隔核shell定位注射mTOR抑制剂雷帕霉素对尼古丁条件位置偏爱形成的影响本实施例选择大鼠条件位置偏爱形成模型作为检测尼古丁成瘾的动物模型和雷帕霉素(Rapamycin)作为抑制尼古丁对mTOR激活效应的制剂,探讨Rapamycin是否可以抑制尼古丁对伏隔核shell的mTOR激活并抑制条件位置偏爱的形成(即成瘾的形成)。材料与方法
药品及试剂Mecamylamine sigma-M9020 ；DMS0等试剂均为市售分析纯试剂。动物SPF级SD雄性大鼠，体重220_250g。武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为NO. 00014833，生产许可证号SCXK (鄂)2003-2004。鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。实验方法动物分组与处理大鼠随机分为4组，分别是生理盐水组、生理盐水+Rapamycin组、尼古丁给药组和Rapamycin+尼古丁给药组。Rapamycin采用核团定位给药,尼古丁腹腔注射。动物造模大鼠(n=32)分为4组，手术，置套管于伏隔核shell，各组分别预先微注射溶媒、Rapamycin、溶媒和Rapamycin, 30min后再分别腹腔注射生理盐水、生理盐水、尼古丁和尼古丁后进行条件位置偏爱训练，经过4轮训练后，实验大鼠分为两部分，一部分检测条件位置偏爱的形成情况，另一部分平行检测伏隔核shell的p70s6k磷酸化活性变化。检测指标各组大鼠样本处理后，采用条件位置偏爱检测尼古丁成瘾情况，Western blot检测尼古丁引起p70s6kNAc shell中磷酸化水平变化。实验结果I.雷帕霉素定位注射于伏隔核shell抑制尼古丁条件位置偏爱的形成各组大鼠伏隔核shell核团定位给予rapamycin后可阻断尼古丁引起中脑边缘多巴胺系统伏隔核(nucleus accumbens shell,NAc shell)磷酸化水平增高(F (3,49)=12. 182，p〈0. 01)和条件位置偏爱的形成(F (3,49) = 20. 254，p〈0. 01)，如图 5A、B 所示。
实施例4 =BLA定位注射mTOR抑制剂雷帕霉素对尼古丁敏化形成的影响本实施例选择大鼠敏化模型作为检测尼古丁成瘾致兴奋的动物模型和雷帕霉素(Rapamycin)作为抑制尼古丁对mTOR激活效应的制剂,探讨Rapamycin是否可以抑制尼古丁对BLA的mTOR激活并抑制敏化的形成。材料与方法药品及试剂Mecamylamine sigma-M9020 ；DMS0等试剂均为市售分析纯试剂。动物SPF级SD雄性大鼠，体重220_250g。武汉大学动物实验中心提供，动物合格证号为NO. 00014833，生产许可证号SCXK (鄂)2003-2004。鼠饲料，购于武汉大学实验动物中心。实验方法动物分组与处理大鼠随机分为4组，分别是生理盐水组、生理盐水+Rapamycin组、尼古丁给药组和Rapamycin+尼古丁给药组。Rapamycin采用核团定位给药,尼古丁腹腔注射。动物造模大鼠(n=32)分为4组，手术，置套管于BLA，各组分别预先微注射溶媒、Rapamycin、溶媒和Rapamycin, 30min后再分别腹腔注射生理盐水、生理盐水、尼古丁和尼古丁后进行敏化训练，经过5轮训练后，实验大鼠分为两部分，一部分检测敏化的形成情况，另一部分平行检测BLA的p70s6k磷酸化活性变化。检测指标各组大鼠样本处理后，采用自主活动箱检测尼古丁致敏化情况，Western blot检测尼古丁引起p70s6k在BLA中磷酸化水平变化。实验结果I.帕霉素定位注射于BLA抑制尼古丁敏化的形成各组大鼠BLA核团定位给予rapamycin后可阻断尼古丁引起中脑边缘多巴胺系统BLA磷酸化水平增高(F (3,49) = 19. 367，p〈0. 01)和敏化的形成(F (3,49)=18. 325，p〈0. 01)，如图 6A、B 所示。实验结论总之，急性尼古丁给药可以引起中脑边缘多巴胺系统与尼古丁奖赏关键脑区伏隔核(nucleus accumbens, NAc) shell、与尼古丁敏化相关的脑区基底外侧杏仁核 (Basolateral amygdala, BLA)p70s6k磷酸化水平增高,而且此作用可被预先给予尼古丁受体抑制剂所阻断，说明尼古丁可通过激活mTOR信号转导通路在中脑边缘多巴胺系统起效。微注射mTOR抑制剂于伏隔核shell和基底外侧杏仁核可分别抑制尼古丁成瘾和敏化的形成，说明mTOR信号分子在尼古丁所致的成瘾行为中起着关键的作用，针对其设计药物抑制器活性可达到戒烟的效果。
权利要求
1.mTOR作为标靶在筛选治疗尼古丁成瘾药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了mTOR作为标靶在筛选治疗尼古丁成瘾药物中的应用。在制备治疗尼古丁物质成瘾药物作用靶标的作用。本发明为治疗尼古丁物质成瘾的成瘾性、兴奋性的症状提供了一种有效的药物作用靶标，有望从根本上治疗尼古丁物质成瘾。
文档编号A61K49/00GK102698293SQ20121021608
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者彭淑娴, 李艳琴, 林觉, 温泉, 郑春明 申请人:武汉大学