专利名称：一种猪繁殖与呼吸综合征nvdc-jxa1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法和应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)弓丨起的猪的一种高度接触性传染病，不同年龄、品种和性别的猪均能感染，但以妊娠母猪和I月龄以内仔猪最易感。该病以母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征。由于目前尚无治疗该病的特效药物，因此使用特异性疫苗成为防控PRRS的主要措施。目前国内外已研制出灭活疫苗和弱毒活疫苗两种类型的疫苗，一般认为弱毒活疫苗免疫效果好，而灭活疫苗安全性更佳。灭活疫苗是较早研制的疫苗，使用后主要刺激猪体产生体液免疫反应。因其是死苗，故最大的优点是安全、不散毒、便于储存和运输。Bayer公司于1997年首次推出了灭活疫苗PRRomiSetM，目前我国已有20家企业被农业部批准生产PRRS灭活疫苗=CH-Ia株(哈尔滨维科生物技术开发公司)和NVDC-JXAI株(广东大华农动物保健品股份有限公司等19家)，主要用于PRRS阴性猪场的免疫，对控制PRRS和降低经济损失起到一定的作用。猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的一种猪的繁殖障碍病，以受感染母猪特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎、弱仔，而母猪无明显症状为特征。猪细小病毒是一种非常顽固的病原，广泛分布于世界各地，猪群感染后很难根除，给养猪业造成巨大的经济损失。目前，该病在我国污染十分严重，阳性率达90%以上，几乎很难找到一个PPV阴性的猪场，且该病常与猪圆环病毒病、猪蓝耳病、猪伪狂犬病等繁殖障碍病混合感染，现已成为了我国较常见的猪病之一。经血凝抑制试验及血清中和试验证明，至今各地分离到的PPV同属一个血清型。本病目前尚无有效的治疗方法，但由于PPV的血清型单一且免疫原性高，所以疫苗接种仍然是公认的有效的防控措施，可对种猪特别是后备种猪进行疫苗接种来预防本病。现已研制成功并大规模投入使用的疫苗有灭活疫苗以及弱毒活疫苗，而目前主要使用的是PPV灭活疫苗。自1976年开始，国外就有关于PPV灭活疫苗的研究报道，并于20世纪80年代在美国、澳大利亚、法国等国家普遍应用。我国潘雪珠(1987)首先成功研制了 PPV灭活疫苗，此后邬捷、韩孝成、肖驰、叶向阳等先后成功研制出PPV灭活疫苗。目前我国已经取得新兽药证书的猪细小病毒疫苗有上海农科院畜牧兽医研究所研制的猪细小病毒油乳剂灭活疫苗、武汉中博生化有限公司猪细小病毒病灭活疫苗(CP-99株)、华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、中牧实业股份有限公司联合研制的猪细小病毒病灭活疫苗(wH-1株)。这些疫苗的应用为我国猪细小病毒病的防控发挥了重要作用。为了有效预防上述2种疫病，各大养猪企业均将这2种传染病的疫苗列入常规免疫程序。因目前市面上仅有单苗出售，要同时预防这2种疫病，同一年龄段猪只往往需要免疫2针，这使得各年龄段猪的免疫密度增大，而疫苗的费用、注苗时的人力和对猪造成的应激以及短时间高密度注苗引起各疫苗之间的相互干扰，使猪场经营者苦不堪言。随着我国集约化养猪业的发展，传统单价疫苗已无法满足免疫需要，迫切需要能一针防多病的疫苗；因此，为了满足养猪业的防疫需求，研制一种安全、稳定且能“一针防两病”的猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗显得尤为迫切和重要。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，使疫苗中的各抗原成分均达到对应单苗的免疫效果，能同时预防猪繁殖与呼吸综合征病和猪细小病毒病这两种疫病。本发明的另一目的在于提供一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法。本发明的又一目的在于用猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗建立猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗质量标准。为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下
一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其是由猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株接种Marc-145细胞，猪细小病毒强毒株接种ST细胞，分别收获感染细胞培养液经甲醛溶液灭活、超滤浓缩后混合得到的混合病毒液再与油佐剂混合乳化制成；其由以重量份计的1-2份油佐剂和I份混合病毒液水相组成。本发明中所述油佐剂由以重量份计的注射用白油90-95份、司本-80 :5_8份、硬脂酸铝1-3份组成。本发明中所述混合病毒液水相由以重量份计的95-98份混合病毒液、2-5份吐温-80组成。本发明所述的混合病毒液是浓缩的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液与浓缩的猪细小病毒感染细胞培养液按照体积比为1:1的比例混合液。其中灭活前，猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液中PRRSV病毒含量为2X 106-7TCID5Q/ml，猪细小病毒感染细胞培养液中PPV病毒含量为2 X 106-7TCID5(l/ml。一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤
1)猪繁殖与呼吸综合征病毒液的制备将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株按体积比5%的量接种已长成单层的Marc-145细胞，旋转培养，当70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液，冻融，经离心或过滤除去细胞碎片，再用甲醛溶液进行灭活处理，之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液；
2)猪细小病毒液的制备采用同步接种方法，在ST细胞分瓶传代的同时，按体积比为I 2%的量同步接种猪细小病毒强毒株，培养至70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪细小病毒感染细胞培养液，冻融，经离心或过滤除去细胞碎片，再用甲醛溶液进行灭活处理，之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪细小病毒液；
3)油相制备将注射用白油90-95份、司本-80:5-8份混合后加热、再加入硬脂酸铝1-3份，随加随搅拌到透明为止，灭菌后制得油相；
4)水相制备取步骤I)的浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液和步骤2)中的浓缩猪细小病毒液按体积比为I : I的比例混合，搅拌均匀，得到混合病毒液，然后取混合病毒液95-98份，灭菌冷却后的吐温-80 2-5份，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解，制得水相；
5)乳化取油相1-2份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入I份水相，搅拌使混合物充分乳化，制成猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗。
步骤I)中旋转培养的温度为37°C，旋转速度为8 9转/小时，所用的培养液为含质量浓度为2%胎牛血清的DMEM细胞培养液；用终浓度为0. 1%的甲醛溶液进行37°C灭活处理，灭活时间为16-20小时。步骤2)中培养时温度为37°C，培养时间为72 96小时；用终浓度为0. 1%的甲醛溶液于37°C灭活处理15-20小时。步骤5)中搅拌速度为3000r/min，搅拌时间为30-60分钟。 本发明所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗应用于建立猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗质量标准。本发明的二联灭活疫苗的使用方法为初产母猪4 6月龄免疫I次，2 3周后加强免疫I次；经产母猪于配种前I个月免疫I次；种公猪于6月龄首免，以后每6个月免疫I次。每次肌肉注射，2ml/头。本发明的有益效果在于
1.本发明的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗是一种多联苗，疫苗中的各抗原成分均达到对应单苗的免疫效果，能同时预防猪繁殖与呼吸综合征病和猪细小病毒病这两种疫病，降低各年龄段猪的免疫密度和疫苗的费用，避免了注苗时的人力和对猪造成的应激以及短时间高密度注苗引起各疫苗之间的相互干扰，做到“一针防两病”；
2.本发明的制备方法简单易操作，便于推广和应用；
3.本发明在全国范围内首次建立了猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的质量标准。下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。
具体实施例方式一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤
I)猪繁殖与呼吸综合征病毒液的制备将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株按体积比5%的量接种已长成单层的Marc-145细胞，旋转培养，当70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液，冻融，经离心或过滤除去细胞碎片，再用甲醛溶液进行灭活处理，之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液；
2)猪细小病毒液的制备采用同步接种方法，在ST细胞分瓶传代的同时，按体积比为I 2%的量同步接种猪细小病毒强毒株，培养至70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪细小病毒感染细胞培养液，冻融，经离心或过滤除去细胞碎片，再用甲醛溶液进行灭活处理，之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪细小病毒液；
3)油相制备将注射用白油90-95份、司本-80:5-8份混合后加热、再加入硬脂酸铝1-3份，随加随搅拌到透明为止，灭菌后制得油相；
4)水相制备取步骤I)的浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液和步骤2)中的浓缩猪细小病毒液按体积比为I : I的比例混合，搅拌均匀，得到混合病毒液，然后取混合病毒液95-98份，灭菌冷却后的吐温-80 2-5份，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解，制得水相；
5)乳化取油相1-2份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入I份水相，搅拌使混合物充分乳化，·制成猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗。·以下是本发明优选的实施例。实施例I
一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备，按照以下步骤进行I)将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株按体积比5%的量接种已长成单层的Marc-145细胞，于37°C以8转/小时的转速旋转培养，当70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液，冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，再用终浓度为0. 1%的甲醛溶液于37°C灭活18小时，之后再超滤浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液；2)采用同步接种方法，在ST细胞分瓶传代的同时，按体积比为2%的量同步接种猪细小病毒CG03株毒株，培养至70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪细小病毒感染细胞培养液，冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，再用终浓度为0. 1%的甲醛溶液于37°C灭活16小时；之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪细小病毒液；3)将注射用白油94份、司本-80 6份混合后加热、再加入硬脂酸铝2份，随加随搅拌到透明为止，灭菌后制得油相；4)取浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液和浓缩猪细小病毒液按体积比为I : I的比例混合，搅拌均匀，得到混合病毒液，然后取混合病毒液96份，灭菌冷却后的4份吐温-80，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解，制得水相；5)取油相I. 5份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入I份水相，3000r/min搅拌30分钟，使混合物充分乳化，制成猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗。实施例2
一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备，按照以下步骤进行I)将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株按体积比5%的量接种已长成单层的Marc-145细胞，于37°C以9转/小时的转速旋转培养，当70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液，冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，再用终浓度为0. 1%的甲醛溶液于37°C灭活18小时，之后再超滤浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液；2)采用同步接种方法，在ST细胞分瓶传代的同时，按体积比为2%的量同步接种猪细小病毒CG03株毒株，培养至70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪细小病毒感染细胞培养液，冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，再用终浓度为0. 1%的甲醛溶液于37°C灭活16小时；之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪细小病毒液；3)将注射用白油90份、司本-80 8份混合后加热、再加入硬脂酸铝I份，随加随搅拌到透明为止，灭菌后制得油相；4)取浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液和浓缩猪细小病毒液按体积比为I : I的比例混合，搅拌均匀，得到混合病毒液，然后取混合病毒液98份，灭菌冷却后的2份吐温-80，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解，制得水相；5)取油相I份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入I份水相,3000r/min搅拌30分钟，使混合物充分乳化，制成猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗。实施例3
一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备，按照以下步骤进行I)将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株按体积比5%的量接种已长成单层的Marc-145细胞，于37°C以9转/小时的转速旋转培养，当70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液，冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，再用终浓度为0. 1%的甲醛溶液于37°C灭活18小时，之后再超滤浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液；2)采用同步接种方法，在ST细胞分瓶传代的同时，按体积比为2%的量同步接种猪细小病毒CG03株毒株，培养至70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪细小病毒感染细胞培养液，冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，再用终浓度为0. 1%的甲醛溶液于37°C灭活16小时；之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪细小病毒液；3)将注射用白油95份、司本-80 5份混合后加热、再加入硬脂酸铝3份，随加随搅拌到透明为止，灭菌后制得油相；4)取浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液和浓缩猪细小病毒液按体积比为I : I的比例混合，搅拌均匀，得到混合病毒液，然后取混合病毒液95份，灭菌冷却后的5份吐温-80，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解，制得水相；5)取油相2份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入I份水相,3000r/min搅拌30分钟，使混合物充分乳化，制成猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗。本发明所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗应用于建立猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗质量标准，步骤如下
1)性状(包括外观、剂型、稳定性、黏度)、无菌检验和甲醛、汞类防腐剂残留量按《中国兽药典》附录测定，应符合相应的标准；
2)安全检验取3 6周龄PRRSV抗原、抗体阴性且PPV抗原抗体阴性(HI抗体效价不高于I : 8)仔猪5头，每头肌肉注射疫苗4ml，观察21日，应不出现由疫苗引起的局部和全身不良反应；用3 5日龄乳鼠5只，各皮下注射疫苗0. 1ml，观察10日，均应健活；
3)效力检验
猪繁殖与呼吸综合征部分用3 6周龄PRRSV抗原、抗体阴性猪10头，其中5头肌肉注射疫苗2ml，另5头作为对照，同等条件下隔离饲养。28日后，所有猪对侧耳后部肌肉注射PRRSV NVDC-JXAI株强毒3ml (含IO5TCID5tl),每日测温并观察21日。5头对照猪应全部发病，且至少2头死亡，免疫猪应至少4头健活；
猪细小病毒部分下列方法任择其一
用体重350 400g的PPV抗原、抗体阴性(HI抗体效价不高于I : 8)健康豚鼠5只，每只分别注射疫苗0. 5ml, 28日后，连同相同条件下的对照豚鼠4头，采血，分离血清，测定HI抗体；免疫豚鼠至少4只抗体阳性，其HI抗体效价几何平均值应不低于I : 64，对照豚鼠HI抗体效价均不高于I : 8;
用4 6周龄PPV抗原抗体阴性(HI抗体效价不高于I : 8)猪10头，其中5头肌肉注射疫苗2ml，另5头作为对照，同等条件下隔离饲养，28日后，所有猪采血，分离血清，测定HI抗体。免疫猪至少4头抗体阳性，其HI抗体效价几何平均值应不低于I : 64，对照猪HI抗体效价均不高于1:8。根据上述质量标准，对本发明的实施例1-3所制备的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗进行安全性和免疫效力的检验。疫苗安全性检验
将本发明实施例制备的3批疫苗分别进行了安全性试验。试验内容包括对3 5日龄乳鼠、3 6周龄断奶仔猪、4 6月龄后备母猪、种公猪及怀孕30 50天的妊娠母猪分别 进行I次单剂量接种、超剂量接种、单剂量重复接种的安全性试验。试验结果表明，3批疫苗接种动物后，均未出现红肿、瘙痒、破溃等局部反应，采食和精神状态正常，无全身反应，妊娠母猪一直观察到分娩，无流产、早产、死胎、弱仔等临床症状表现，从其所产全部胎儿的血液或脏器中均不能分离出PRRSV和PPV，可见疫苗安全可靠。疫苗免疫效力
取6月龄初产后备母猪30头(PRRSV和PPV抗原、抗体均阴性)，随机分成三组，每组10头；第一组于6月龄首免本发明实施例I中的疫苗，2 3周后加强免疫I次；第二组于配种前一个月免疫I次本发明实施例I中的疫苗；第三组不免疫作为对照；每次免疫均为肌肉注射，2ml/头；接种后定期采血，分离血清，测定血清中PRRSV抗体水平及PPV HI抗体水平；结果第一组试验猪(即初产母猪二次免疫组)于首免后14天即可检测到PRRSV抗体及PPV HI抗体，随后逐渐升高，21 28天免疫力建立完全，免后2 4个月出现抗体高峰，5个月后其抗体水平开始下降，至6个月抗体效价降至28天左右水平；而第二组试验猪(即初产母猪一次免疫组)的抗体变化规律与第一组基本相同，但抗体高峰值低于第一组，且至4个月时抗体效价已降至28天时水平。可见，对于初产后备母猪，于配种前免疫2次其免疫效果优于配种前仅免疫I次的效果。取经产母猪35头，其中20头于配种前一个月免疫本疫苗，肌肉注射，2ml/头，另15头作为对照，同等条件下隔离饲养；免疫后定期采血，分离血清，测定血清中PRRSV抗体水平及PPV HI抗体水平，并于妊娠30 50天时，将上述免疫猪及对照猪各随机抽出10头，分为2组，每组5头，一组耳后部肌肉注射PRRSV NVDC-JXAI株强毒3ml (含IO5TCID5tl),另一组颈部肌肉注射猪细小病毒PPV7909标准强毒株2ml (含IO5TCID5tl),观察至分娩；结果经产母猪于配种前免疫I次其免疫效果同上述初产母猪二次免疫组，抗体高峰出现在免后2 4个月，至6个月时抗体效价降至28天时水平；攻毒保护结果表明，对照猪攻毒PRRSV后全部发病，且2头死亡，攻毒PPV后4头出现流产、死胎、木乃伊胎或胎儿重吸收等繁殖障碍症状，而免疫猪均5/5保护；免疫猪所产仔猪出生后在第3天即可检测到PRRSV抗体及PPV HI抗体，第10 14天达到高峰，3 4周后PRRSV抗体持续下降，6 7周后PPV HI抗体也开始持续下降。取6月龄公猪15头(PRRSV和PPV抗原、抗体均阴性)，其中10头以2ml/头剂量肌肉注射实施例I中的疫苗，另5头作为对照，同等条件下隔离饲养，免疫后定期采血，分离血清，测定血清中PRRSV抗体水平及PPV HI抗体水平；结果公猪免疫I次的的抗体变化规律与经产母猪、加强免疫初产母猪基本相同，接种后28天免疫猪PRRSV抗体全部为阳性，PPVHI效价均彡I 128，而对照猪PRRSV抗体全部为阴性，PPV HI抗体均彡I 8，免后2 3个月出现抗体高峰，但抗体高峰值低于经产母猪及加强免疫的初产母猪，至4个月时抗体效价降至28天时水平。根据上述试验结果显示疫苗的免疫持续期定为4个月。田间试验
将本发明实施例所制备的3批猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗在广东温氏集团属下的猪场进行田间试验，试验猪品种包括经产母猪、后备母猪、种公猪，通过对免疫后猪群的采食、饮水、体温情况的观察，以及定期的抗体检测，评价疫苗免疫效果。结果表明，免疫猪群采食、饮水、体温等均无异常；经产母猪于配种前I个月以2ml/头的剂量免疫本疫苗，免后21 28日即可产生坚强的免疫力，免疫期为6个月，其所生仔猪的PRRSV母源抗体可持续3 4周，PPV母源抗体可持续6 7周；后备母猪于4 6月龄免疫I次本疫苗，2 3周后再加强免疫I次，每次2ml/头，产生的免疫效果同经产母猪；种公猪于6月龄首免本疫苗，2ml/头，免疫期可达4个月，以后每6个月免疫I次，免疫期达6个月。通过对整个生产期的追踪，免疫猪群均无高致病性猪繁殖与呼吸综合征及猪细小病毒病的发生。表明本发明制备的猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗对免疫猪安全、 有效。上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
权利要求
1.一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于其是由猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株接种Marc-145细胞，猪细小病毒强毒株接种ST细胞，分别收获感染细胞培养液经甲醛溶液灭活、超滤浓缩后混合得到的混合病毒液再与油佐剂混合乳化制成；其由以重量份计的1-2份油佐剂和I份混合病毒液水相组成。
2.根据权利要求I所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于所述油佐剂由以重量份计的注射用白油90-95份、司本-80 :5-8份、硬脂酸铝1-3份组成。
3.根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于所述混合病毒液水相由以重量份计的95-98份混合病毒液、2-5份吐温-80组成。
4.根据权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于所述混合病毒液是浓缩的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液与浓缩的猪细小病毒感染细胞培养液按照体积比为1:1的比例混合液。
5.根据权利要求I所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于其中灭活前，猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液中PRRSV病毒含量为2X106_7TCID5(l/ml，猪细小病毒感染细胞培养液中PPV病毒含量为2X 106_7TCID5(I/ml o
6.一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于其包括以下步骤 1)猪繁殖与呼吸综合征病毒液的制备将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株按体积比5%的量接种已长成单层的Marc-145细胞，旋转培养，当70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液，冻融，经离心或过滤除去细胞碎片，再用甲醛溶液进行灭活处理，之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液； 2)猪细小病毒液的制备采用同步接种方法，在ST细胞分瓶传代的同时，按体积比为I 2%的量同步接种猪细小病毒强毒株，培养至70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪细小病毒感染细胞培养液，冻融，经离心或过滤除去细胞碎片，再用甲醛溶液进行灭活处理；之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪细小病毒液； 3)油相制备将注射用白油90-95份、司本-80:5-8份混合后加热、再加入硬脂酸铝1-3份，随加随搅拌到透明为止，灭菌后制得油相； 4)水相制备取步骤I)的浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液和步骤2)中的浓缩猪细小病毒液按体积比为I : I的比例混合，搅拌均匀，得到混合病毒液，然后取混合病毒液95-98份，灭菌冷却后的吐温-80 2-5份，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解，制得水相； 5)乳化取油相1-2份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入I份水相，搅拌使混合物充分乳化，制成猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗。
7.根据权利要求6所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤I)中旋转培养的温度为37°C，旋转速度为8 9转/小时，所用的培养液为含质量浓度为2%胎牛血清的DMEM细胞培养液；用终浓度为0. 1%的甲醛溶液进行37°C灭活处理，灭活时间为16-20小时。
8.根据权利要求6所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤2)中培养时温度为37°C，培养时间为72 96小时；用终浓度为0. 1%的甲醛溶液于37°C灭活处理15-20小时。
9.根据权利要求6所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤5)中搅拌速度为3000r/min，搅拌时间为30-60分钟。
10.一种如权利要求I所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXAl株-猪细小病毒病二联灭活疫苗应用于建立猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗质量标准。
全文摘要
本发明具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法和应用。猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗由猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株接种Marc-145细胞，猪细小病毒强毒株接种ST细胞，分别收获感染细胞培养液经甲醛溶液灭活，经超滤浓缩混合得到的混合病毒液与油佐剂混合乳化制成；其由以重量份计的1-2份油佐剂和1份混合病毒液水相组成，经过制备猪繁殖与呼吸综合征病毒液、猪细小病毒液、油相、水相，再经乳化制成，并建立NVDC-JXA1株猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗质量标准。
文档编号A61P31/14GK102716479SQ201210229550
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者周智, 唐满华, 曲萍, 林绮萍, 田克恭, 练炳洲, 翟新验, 遇秀琳, 邓小熊, 陈瑞爱 申请人:中国动物疫病预防控制中心, 广东大华农动物保健品股份有限公司