一种抗癌药物组合物及其制备方法

专利名称：一种抗癌药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物，具体涉及一种抗癌药物组合物，及其制备方法。
背景技术：
肿瘤，尤其是恶性肿瘤，治疗最主要的方法包括手术、放疗和化疗，但目前这些方法的疗效均不理想，一是局部治疗不彻底易复发；二是易发生远处转移；三是通常导致机体免疫功能降低。同时，这些治疗方法的创伤大，毒副作用大，病人难以接受。近几十年来，由于免疫学及其它相关学科的发展，出现肿瘤免疫治疗方法。但尚无统一标准，方法甚多，经验不多，疗效差异甚大。不过免疫治疗最大的优势在于能够阻止或逆转因外科手术、放疗和化疗所致的免疫抑制；引导产生或增强抗瘤免疫，打破免疫耐受， 调整免疫反应功能。目前肿瘤免疫治疗的要点包括1、肿瘤负荷量小，106 107的癌细胞有效。2、适应的剂量，攻击者对靶细胞的比例100 :1，小者无作用，大者又抑制免疫细胞。3、联合治疗。肿瘤免疫治疗的方法包括1、特异性免疫治疗，包括(I)被动免疫治疗(抗体治疗)，(2)主动免疫治疗(瘤苗)，(3)继承免疫(细胞治疗);2、非特异性免疫治疗的制剂(目前应用比较多)，包括(I)微生物(细菌、病毒)，(2)局部变态反应(二硝基氯苯)；3、细胞因子 (白介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、淋巴因子、单核因子等)；4、抗瘤基因(Rb、 P53、MCC、APC、DCC、MTSL) ;5、调整基因(转移基因、抗转移基因、MHC基因)；6、其它(胸腺素等)。以上肿瘤免疫制剂有的处于研究阶段，有的已用于临床。存在的问题包括1、寒颤与发烧；2、单独使用疗效差；3、致敏。上世纪六十年代中期，人们逐渐筛选到的有利用价值的病毒包括风疹病毒、腮腺病毒、单纯疱疹病毒、柯萨奇病毒、腺相关病毒、细小病毒B19等，它们对肿瘤细胞具有直接溶解作用。采用肿瘤局部或静脉注射的方式能够在一定程度达到杀伤或清除肿瘤的效果， 即病毒的介入增强了肿瘤细胞免疫原性(抗原性)。但是，尽管机体在病毒治疗的初级阶段能够产生极其明显的抗肿瘤效应，然而随着病毒对肿瘤溶解作用的发挥，机体很快建立了针对病毒的免疫反应。而且大量病毒对机体产生的神经毒性反应导致的持续的寒颤和高烧无法回避。在上述背景下，本发明的研发人利用新城疫病毒(NDV)只感染人肿瘤细胞，不感染人正常细胞，且以“出芽”方式增殖的细胞非溶解性株对人体没有神经毒性作用等特点，采用新的制备方法研制出一种新型的抗癌生物制剂，获得了优异的效果
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗癌的药物组合物，具有抗肿瘤谱广、治疗作用显著，且无明显毒副作用；又有免疫作用，而且对癌细胞具有直接杀伤作用的优点。本发明的另一个目的在于提供所述抗癌药物组合物的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的提供一种抗癌药物组合物，其活性成分由新城疫病毒(NDV)粒子和神经氨酸酶 (NA)组成，且 NDV 活性为 IO6 107PFU/ml，NA 活性为 O. 01 O. 02u/ml。本发明所述的抗癌药物组合物优选呈冻干制剂。所述的冻干制剂优选进一步含有保护剂；所述的保护剂按占组合物总重量的百分比计包括明胶1%、味精1%、人白蛋白1%、蔗糖10%、尿素O. 5%和L-精氨酸O. 2%。本发明所述的NDV，优选按照以下方法制备得到的NDV a)原代NDV病毒的分离选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡，从病 鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城疫病毒；分离得到的NDV成熟的病毒粒子呈圆形，直径100毫微米，囊膜上纤突长约8毫微米，病毒粒子内部为卷曲的核衣壳，直径17晕微米，核酸分子量7. 5 X IO6D,构型单链(单股)；RNA基因数14，多肽数6。NDV的化学组成(干物质)包括蛋白质65%、RNA4%、脂质25%、 碳水化合物6% ；NDV的核酸碱基组成为腺嘌呤24%、鸟嘌呤24%、胞嘌呤23%、尿嘌呤29% ； NDV的多肽种类包括糖蛋白G1 74KD、囊膜衣壳蛋白NP56KD、核衣壳糖蛋白G256KD、囊膜内膜蛋白M41KD ；b ) NDV毒种的传代将步骤a)分离得到的NDV病毒以常规方法在9_11日龄鸡胚尿囊腔中接种传代， 直至收获能够产生足量病毒的鸡胚尿囊液，得到NDV悬液；c ) NDV病毒扩增用步骤b)得到的NDVlO代以内的生产用毒种通过鸡胚单层原代细胞培养法进行病毒扩增，具体包括以下步骤Cl)按照常规方法进行孵鸡蛋、取鸡胚、剪胚、消化、分散吹打，得到细胞悬液I ;c2)在步骤Cl)得到的细胞悬液I内加入细胞生长液，按照常规方法静止培养2 天，待细胞形成单层后，洗去单层细胞的残余牛血清，加入细胞维持液，得到细胞悬液2 ；c3)将步骤b)得到的NDV悬液以l/5(Tl/25的体积比加入步骤c2)得到的细胞悬液2中，36°C静置培养2-3天后，即完成NDV病毒的扩增，最终得到的NDV悬液血凝效价为 1:640 1:1280，滴度为 6LogPFU/ml 7LogPFU/ml。步骤c2)所述的细胞生长液是现有常规产品，也可以按照现有方法和试剂配置得到，其配方如下(以IOOmL计)Eagle (MEM) 60mL、0. 5%水解乳蛋白溶液30mL、小牛血清 5-10mL、2%NaHC03 2mL (pH值至7· 2)、卡那霉素100U/mL ;或用199培养基90mL代替上述 Eagle (MEM)和O. 5%水解乳蛋白液。步骤c2)所述的细胞维持液也是现有常规产品，也可以按照现有方法和试剂配置得到，其配方如下(以IOOmL计)Eagle (MEM) 9OmL (或O. 5%水解乳蛋白液90mL)、小牛血清 3-5mL、2%NaHC03 3_5mL (pH 值 7. 4-7. 6)、卡那霉素 100U/mL ;或用 199 培养基 90mL 代替 Eagle或O. 5%水解乳蛋白液。本发明所述的神经氨酸酶可以通过多种现有方法提取或合成得到，也可以通过市购获得。本发明还提供所述的抗癌药物组合物的制备方法，包括以下步骤
I)制备NDV悬液I. I)选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡，从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城疫病毒；分离得到的 NDV病毒以常规方法在9-11日龄鸡胚尿囊腔中接种传代，直至收获能够产生足量病毒的鸡胚尿囊液，得到NDV悬液；I. 2) NDV 病毒扩增用步骤I)得到的NDVlO代以内的生产用毒种通过鸡胚单层原代细胞培养法进行病毒扩增，具体包括以下步骤I. 2. I)按照常规方法进行孵鸡蛋、取鸡胚、剪胚、消化、分散吹打，得到细胞悬液；I. 2. 2)在步骤I. 2. I)得到的细胞悬液内加入细胞生长液，按照常规方法静止培养 2天，待细胞形成单层后，洗去单层细胞的残余牛血清，加入细胞维持液，得到细胞悬液；所述的细胞生长液是现有常规产品，也可以按照现有方法和试剂配置得到，其配方如下(以IOOmL计)=Eagle (MEM) 60mL、0. 5%水解乳蛋白溶液30mL、小牛血清5-1OmL, 2%NaHC03 2mL (pH值至7. 2)、卡那霉素100U/mL ;或用199培养基90mL代替 上述Eagle (MEM)和O. 5%水解乳蛋白液。所述的细胞维持液也是现有常规产品，也可以按照现有方法和试剂配置得到，其配方如下(以IOOmL计):Eagle (MEM)90mL (或(λ 5%水解乳蛋白液90mL)、小牛血清3_5mL、 2%NaHC03 3-5mL (pH 值 7. 4-7. 6)、卡那霉素 100U/mL ;或用 199 培养基 90mL 代替 Eagle 或 O. 5%水解乳蛋白液。I. 2. 3)将步骤I. I)得到的NDV悬液以1/50 1/25的体积比加入步骤I. 2. 2)得到的细胞悬液中，36°C静置培养2-3天后，即完成NDV病毒的扩增，最终得到的NDV悬液血凝效价为 1:640 1:1280，滴度为 6LogPFU/ml 7LogPFU/ml，备用；2)制备抗癌药物组合物将步骤I)得到的NDV悬液中加入市售的NA，每3000mLNDV悬液中加入3(T60U的 NA，充分摇匀，然后将NDV和NA的混悬液用O. 22 μ m微孔的滤膜过滤(这样既可以防止有细胞碎片和杂菌混入滤液中，又不会把NDV粒子滤去，以达纯化NDV目的)，得到滤液，然后将该滤液按照常规方法制备成药物学上可接受的各种剂型。步骤2)所述的药物学上可接受的各种剂型，优选冻干粉剂，制备方法是在步骤2) 得到的滤液中再进一步加入所述比例的保护剂，然后送到冻干室，立即分装小瓶，分为Iml/ 瓶，加胶塞；装入冻干机，按照冻干曲线操作；冻干完成后，轧紧胶塞和外加铝盖，即得到本发明所述的抗癌药物组合物的冻干粉剂，本发明人将其称为“双联生物抗癌冻干粉剂”，该冻干粉剂于_30°C以下贮存。本发明所述的抗癌药物组合物中，鸡新城疫病毒(NDV)具有只感染人肿癌细胞和提高机体非特异性免疫的作用，神经氨酸酶(NA)能去除肿瘤细胞表面糖蛋白末端唾液酸， 提高免疫原性。本发明将二者结合，显著提高了抗癌疗效。由于鸡新城疫病毒缺乏自身所需的完整酶系统，增殖时必须靠宿主细胞合成核酸 (RNA)和蛋白质，甚至直接利用宿主细胞的某些成份，这就决定了它在细胞内专性寄生的特性，而人和动物的肿瘤组织恰好为其所寄生的活细胞组织，所以该病毒能直接破坏癌细胞。 同时，该病毒对肿瘤组织还有以下四种作用1、机体产生抗病毒免疫反应时，该病毒能使机体或致敏淋巴结与感染的肿瘤细胞表面抗原起反应，破坏肿瘤细胞；2、该病毒是一种干扰素诱导剂，进入机体后，产生内源性干扰素，干扰素抑制肿瘤细胞增殖，引起肿瘤细胞行为的改变，使肿瘤细胞恶性变型逆转；同时产生肿瘤坏死因子，使肿瘤细胞破坏。3、间接和直接干扰肿瘤病毒；4、增强机体对肿瘤的非特异性免疫力。此外，当病毒进入癌细胞后，溶酶体膜的通透性增高，溶酶体渗出于癌细胞浆内，引起癌细胞自溶。新城疫病毒具有导向癌细胞作用的机理I、新城疫病毒具有对增殖旺盛的肿瘤细胞特异的感染性；2、病毒粒子的胺基与肿瘤细胞膜中增高的环磷鸟甙的磷酸基易结合；3、 带正电荷的病毒粒子与带负电荷的肿瘤细胞相吸引，形成静电结合；4、病毒粒子膜中含有脂质体，是天然的导向介质。总之，NDV可以提高机体免疫力，激活机体自然杀伤细胞活性和淋巴细胞及巨噬细胞的作用，但这些细胞无法识别表面含有唾液酸的癌细胞，无法发挥间接杀伤作用。本发明药物组合物中的神经氨酸酶(NA)，能去除肿瘤细胞表面糖蛋白末端唾液酸，从而消除了识别抗原的空间障碍，使瘤细胞表面抗原外露而提高其免疫原性，也有利于发挥机体免疫活细胞的攻击作用。加之能使细胞表面电荷减少，硬度降低和变形增加，从而易为巨噬细胞所吞噬。但肿瘤患者的免疫力低下，虽然免力细胞可以识别，却无力消灭，所以NA的单独抗癌效果不佳，只能作佐剂。
本发明的抗癌药物组合物使新城疫病毒NDV和霍乱弧菌提取的神经氨酸酶NA联合，二者协同作用，能够导向靶细胞(肿瘤细胞)直接杀伤，又能够去除靶细胞(肿瘤细胞)表面伪装膜唾液酸，使癌细胞表面抗原外露，利于机体免疫活细胞的攻击，由此显著提高了抗癌效果。本发明的抗癌药物组合物治疗荷瘤小鼠的肿癌抑制率可达到55 85%。总之，本发明的抗癌药物组合物在治疗肿瘤方面具有以下显著特点I、直接杀伤肿瘤细胞。2、间接杀伤瘤细胞(免疫作用)⑴特异性，NDV感染肿瘤细胞，提高了肿瘤细胞的免疫原性。(2)多价性，NDV与肿瘤结合，形成内源性多价疫苗，更易获得有效的抗肿瘤反应。(3)NDV进入人体后，激活机体免疫细胞释放白细胞介素-2、干扰素(α、β、Y)肿瘤坏死因子、集落刺激因子。(4)NDV进入人体后，激活机体内自然杀伤细胞活性(NK细胞、LAK 细胞、K细胞)。(5) NDV进入人体后，激活机体T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核巨噬细胞的抗肿瘤作用。3、安全性，由于该病毒属于一种禽类副黏膜病毒，其基因组不与人细胞DNA整合， 没有人工转基因的风险，且不能在人正常细胞中复制，对人无感染性。4、神经氨酸酶，对多种肿瘤细胞膜具有吸附作用，增强肿瘤细胞表面抗原性，发挥机体免疫细胞识别肿瘤细胞而杀灭。5、协同性，这种制剂治疗肿瘤可增强化学治疗药物向肿瘤组织内渗透，提高病灶局部药物浓度。长期配合化疗、减少化学药物用药剂量，降低化疗对人体的毒副作用。6、控制癌瘤转移和复发。此外，现有技术中，本发明的发明人曾研制过同类的抗癌药物组合物，但它们都是由多种成份组成，各成份之间是否会发生反应，形成新的物质，目前还无法确定。而且这些现有技术中的鸡新城疫病毒(NDV)都是利用鸡胚尿囊液培养得到的，收集的病毒液中含有尿酸和鸡胚血红蛋白，无法除去，形成无法克服的毒副作用；而且这种培养方式只能在实验室进行，必然导致生产量少，成本高，易污染。本发明的制备方法采用了不同于以往的“鸡胚原代单层细胞培养法”生产鸡新城疫病毒(NDV)，克服了现有技术的弊端和局限性。而且本发明的药物组合物去掉了有可能导致不确定反应发生的多种成份，由此也简化了工艺、降低了成本，避免了各成份之间的不确定反应的发生。
总之，与现有技术相比，本发明抗癌组合物突出的有益效果表现在NDV组分的纯度得到了显著的提高，由此使得组合物对小鼠多种恶性肿瘤的抑瘤率，比现有的多种复杂成分的抗癌制剂，平均提高了 18-25%。
具体实施例方式实施例I.一种双联生物抗癌冻干粉剂，由活性成分和保护剂组成，每瓶的活性成分是NDV 和NA组成，NDV的活性为106PFU/ml，NA的活性为O. 01u/ml ;每瓶的保护剂是由以下重量百分比的组分组成明胶1%、味精1%、人白蛋白1%、蔗糖10%、尿素O. 5%和L-精氨酸O. 2%。所述的双联生物抗癌冻干粉剂，由以下具体方法制备一、鸡新城疫病毒(NDV):制备方法和检定(—)原代鸡新城疫病毒的选择和培养首先选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡。然后，从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城疫病毒。选择健康母鸡孵育的鸡胚，最好为CIO日龄的鸡胚，将上述分离的鸡新城疫病毒接种于鸡胚的尿囊腔中。置于37 38°C下培养48 72小时，至胚尿囊腔内含大量病毒。从鸡胚尿囊腔中抽出尿囊液，利用血凝集试验方法，测定血凝效价(HA);利用血凝集抑制试验方法，进行病毒定性。-30°C保存，供扩增用毒种。经上述分离得到的鸡新城疫病毒(NDV)，成熟的病毒粒子呈圆形，直径100毫微米，囊膜上纤突长约8晕微米，病毒粒子内部为卷曲的核衣壳，直径17晕微米，核酸分子量 7. 5 X IO6D,构型单链(单股)。RNA，基因数14，多肽数6。NDV的化学组成(干物质)蛋白质65%、RNA4%、脂质25%、碳水化合物6%。NDV核酸碱基组成腺嘌呤24%、鸟嘌呤24%、胞嘌呤23%、尿嘌呤29%。NDV多肽种类糖蛋白G1 74KD、囊膜衣壳蛋白NP56KD、核衣壳糖蛋白G2 56KD、囊膜内膜蛋白M41KD。(二)扩增(鸡胚单层原代细胞培养法)，用NDVlO代以内的生产用毒种。I、孵鸡蛋领取新鲜来亨鸡蛋(10天以内)，置孵蛋箱内孵化，每日观察温度(应为37. 5-38. 50C )，相对湿度(应为40-70%)，第9-10日用检卵灯检胚。2、取鸡胚9-10日龄来亨鸡胚蛋，用1:1000新洁尔灭溶液擦洗2次，气室朝上放蛋架上送入无菌室，用5%碘酒涂擦气室部蛋壳，稍候干，用75%酒精消毒，待干后无菌操作剥去气室部蛋壳，除去卵膜，以镊子取鸡胚入大平皿中，去头和内脏，在另一平皿内用洗液洗一次。3、剪胚将上述鸡胚放入广口瓶内，盖上剪胚布，用剪剪碎至l_2mm大小，加入适量O. 1%LE液(在大罐内用2. 6克/万mL (w/v)碳酸氢钠校好pH为7. 0-7. 2)，轻轻摇洗，倒入三角瓶中，静止2-3分钟，倾去上清，再洗第二次，倾去上清。4、消化向三角瓶中加入已预温至37°C胰酶溶液(以1:4比例，将胰酶溶液与欧氏液混合，用2%碳酸氢钠溶液3. 5-4. 0%(V/V)，较pH7. 4-7. 6，每个鸡胚加4_6mL，计算加量)，37-38°C水浴箱中消化25-30分钟，中间至少振摇一次。弃上清胰酶，再用pH7. 2的 O. 1%LE液洗三次，倾去洗液。5、分散吹打加入pH7. 2的O. 1%LE适量，用吹打管吹打三次。每次约30_40下，分散后的细胞，加入LE液400mL，摇匀，静置让大块组织下沉。将三次吹打所得的细胞悬液收集于2000mL毒素瓶中，用抽滤法将细胞悬液抽入瓶内已扎有8层纱布囊的大立瓶中。6、校正大罐中O. 1%LE的pH :将大罐中已灭菌有O. 1%LE液加入终浓度为2. 6g/万 HiLNaHCO3(事先按比例称好，溶于2000mL蒸馏水中，单独O. 105 MPa30分钟灭菌，用时无菌手续加入大罐)使pH为7. 2 ± O. I，并打样作无菌试验。7、细胞培养在装有步骤5得到的细胞悬液的玻璃瓶内按一次培养的总量 (3000ml XX瓶)加入细胞生长液，分成容量为500ml的Y瓶。混匀后(取5_10mL灭菌中管检查支原菌)分装于I万mL大瓶中呈细胞悬液500mL，塞上橡皮塞，扎上牛皮纸，振摇后放置37°C定温室(或培养箱)，静止培养2天。所述的细胞生长液配方如下(以IOOmI^f): Eagle (]\^]\0 6011^、0.5%水解乳蛋白溶液3011^、小牛血清5-1011^、2%似!10)3 2mL (pH 值至 7. 2)、卡那霉素100U/mL ;或用199培养基90mL代替上述Eagle (MEM)和O. 5%水解乳蛋白液。8.洗换细胞培养两天后形成单层。即可用无菌手续倾去生长液，加入2000ml已预温的欧氏液，(PH7. 2 · 4)将细胞瓶滚动2 3圈，使洗液尽可能洗涤残余牛血清，再重复洗一次，并用洗液浸泡过夜，或者将培养瓶倒立，用洗液加适当压力冲洗(但不能使细胞脱落)，冲洗残余牛血清。加入细胞维持液，得到细胞悬液。所述的细胞维持液配方如下(以 IOOmL 计):Eagle(MEM)90mL(或 O. 5% 水解乳蛋白液 90mL)、小牛血清 3_5mL、2%NaHC03 3_5mL (pH值7· 4-7. 6)、卡那霉素100U/mL ;或用199培养基90mL代替Eagle或0. 5%水解乳蛋白液。9、接种步骤(一)得到的NDV尿囊液以l/5(Tl/25 (V/V)的比例接种于步骤8得到的细胞悬液中，每大瓶换入量不超过3000ml，塞好橡皮塞，扎好牛皮纸，继续放36°C静止培养。2 3天后，观察病变，+++以上者，收入2 10°C冷库即得生产用NDV。注①FL细胞长成单层后，吸出生长液，反复用洗液冲洗，清除残余牛血清。以后加入细胞维持液和NDV毒种(100ml维持液加1:320，4mL ; 1:640，2mL)。②每IOOml生长液中加鸡胚f I. 5个③细胞长成单层2-7天，NDV复制培养2-3天。(三)检定NDV悬液血凝效价和滴度及无菌试验检定合格指标。血凝效价(HA)1:640 1:1280滴度6LogPFU/ml 7LogPFU/ml无菌试验阴性二、双联生物抗癌制剂成品制备(一)NDV悬液和NA混悬液制备在3000ml步骤一得到的NDV悬液(滴度6LogPFU/ml 7LogPFU/ml，血凝效价(HA) 1:640 1:1280)中加入市售的神经氨酸酶(嫩)30 60单位(U)，得到NDV和NA的混悬液，然后用O. 22 μ m滤膜过滤除菌和细胞碎片。(二)冻干保护剂的制备冻干保护剂占NDV和NA混悬液的总重量的百分比浓度分别为。明胶1%味精1% 人白蛋白1%蔗糖10%尿素O. 5% L-精氨酸O. 2%(三)半成品的制备过滤后的NDV和NA混悬液与冻干保护剂按比例配制成半成品。
(四)成品的制备半成品送到冻干室，立即分装小瓶(Iml )，加胶塞；装入冻干机，按照冻干曲线操作；冻干完成后，轧紧胶塞和外加铝盖。贴标签、装盒，-30°C以下贮存。NDV滴度在 IO6PFU IO7PFU, NA 的活性为 O. OI O. 02u。成品检定I检定用物品、液体的制备干烤灭菌10mL、5mL、lmL吸管，吹打管(尖端弯曲)。制备细胞生长液(以IOOmL计)Eagle (MEM) 6OmLO. 5%水解乳蛋白溶液30mL小牛血清5-10mL2%NaHC03 2mL, pH 值至 7· 2卡那霉素100U/mL(或用199培养基90mL，代替Eagle(MEM)和水解乳蛋白液)。制备细胞维持液(以 10OmT,计)Eagle (MEM) 90mL (或 O. 5% 水解乳蛋白液 90mL)。小牛血清3_5mL2%NaHC03 3_5mL，pH 值 7· 4-7. 6卡那霉素100U/mL(或用199培养基90mL代替Eagle或O.5%水解乳蛋白液)。DiFFCO酶粉110单位，加IOOOmLPBS,完全溶解后除菌过滤，分装安瓶IOmL/ 支，-20°C保存，无菌试验合格，活力单位测定后备用，超过3个月，复测活力。2.检定方法和标准冻干后抽样18-30瓶分别置于4°C和37°C存放一周进行成品检定。2. I物理检定方法和标准方法肉眼观察标准冻干型呈乳酪色固体；用ImL生理盐水溶解速溶，溶解后呈橙黄色的澄清液体，无异物和沉淀，不混浊。2. 2pH值测定方法和标准方法电位测定，其原理是用两个电极同时浸在溶液中，形成一定的电动势，此电动势与溶液的PH值有关，利用仪器测出该电池的电动势即知pH值。标准pH值应为 7. O ±0. 5
2. 3热原质试验(发热试验)方法按照《生物制品热原质试验规程》进行。家兔注射剂量=(人用剂量+50) X20X家兔体重(kg)。结果家兔注射实施例I得到的抗癌制剂的剂量=(lmL + 50) X20X家兔体重 (2-3kg)，每只家兔平均体温升高< 1°C 3只总和升高< 2. 50C2. 4支原菌检查方法将O. 2-0. 4%琼脂猪胃消化液半固体培养基水浴煮沸10-15分钟，冷却至 560C ;加入血清和酵母浸液，摇匀，冷却至37°C。种入实施例I的抗癌制剂O. 5-1. O毫升， 37°C培养14天判定结果。标准无菌生长。2. 5无菌试验方法 (I)增菌大管酪素2管，每管接种双联生物抗癌制剂O. 5mL，37°C培养三天。大管马丁 2管，每管接种双联生物抗癌制剂O. 5mL，37°C培养三天。(2)移种中管酪素2管，每管接种大管酪素培养液0.4mL，37°C培养七天。中管猪肝斜2管，每管接种大管酪素培养液O. 4mL，37°C培养七天。中管马丁 2管，每管接种大管马丁培养液O. 4mL，22°C培养七天。标准各管均无菌生长2.6安全试验2.6.1豚鼠试验用体重300_400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射双联生物抗癌制剂O. 5mL，注射后半小时内动物不应有明显的异常反应，继续观察7天，动物均健存，每只体重增加者判为合格。2. 7异常毒性试验腹腔注射5只体重17_22g小鼠和体重250_350g的豚鼠，每只小鼠注射实施例I 得到的抗癌制剂ImL (I个人用剂量的6倍)，每只豚鼠注射双联生物抗癌制剂5mL (I人个用剂量5倍)；动物至少存活7天以上，应无任何异常中毒反应。2. 8血凝效价测定(HA)2. 8. I试验准备双联生物抗癌制剂红细胞采自健康公鸡血液(每次可采5-10mL)。以生理盐水洗涤3-5次，每次以3000r/min离心5_10分钟，将血浆和白细胞等充分洗去，将沉淀的红细胞用生理盐水稀释成1%悬浮液。灭菌的生理盐水或pH6. 5-7. 2磷酸盐缓冲液。2. 8. 2试验操作2. 8. 2. I红细胞凝集试验取圆底小试管9支,第一管加生理盐水O. 9晕升，以后各管均加O. 5晕升。在第一管中加入双联生物抗癌制剂O. I毫升，用吸管稀释混匀后，再吸出O. 5毫升加入第二管中， 在第二管内用吸管稀释混匀后，再吸出O. 5毫升加入第三管中，依此稀释到第八管。由第八管吸出O. 5毫升弃去。第九管不加双联生物抗癌制剂，只加生理盐水。这样，则双联生物抗癌制剂的稀释倍数分别为1:10、1:20、1:40……1:1280。然后向各个不同倍数的双联生物抗癌制剂管中加入1%红细胞悬液O. 5毫升，充分振荡后，置于20°C _30°C条件下，15分钟后检查结果，并记录。2. 8. 2. 2.判定标准和注意事项I)判定时，应首先检查对照各管是否正确，如正确则证明操作无误。2)红细胞凝集，红细胞分散在管底四周呈颗粒状凝集者，为阳性“ + ”。3)双联生物抗癌制剂红细胞凝集要求1-7管出现阳性。4)无凝集,红细胞集中管底呈圆盘状,为阴性。5)双联生物抗癌制剂的凝集效价为I :640 1 :1280。。2. 9水分测定 2.9.1费休氏试剂配制于干燥的IOOOmL玻璃容器内，加入碘42. 33g，无水吡啶133. 3mL (吡啶200mL，力口苯40mL，加热蒸馏，收集114-116°C馏出的吡啶，含水量应在O. 1%以下)，加塞，摇振到碘全部溶解。加无水甲醇333. 3mL (甲醇IOOOmL,加金属镁15g，二氯化汞O. 4或碘O. 5g，回流
2-4小时，然后蒸馏，收集46-64°C馏出的甲醇，含水量应在O. 05%以下)。称定重量，将瓶置于水浴，用封闭装置导入经浓硫酸脱水的二氧化硫，到重量增加32克为止，注意避光保存。2. 9. 2标准水的制备于经干燥处理50mL容量瓶中，精密称取O. 4g双蒸馏水，用无水甲醇稀释到刻度， 密封保存，取标准水ImL与无水甲醇5mL分置于经干燥处理的带塞玻璃中，用费休氏试剂滴定到呈棕黄色为止。称取水重为Amg的ImL标准水所需费氏试剂为BmL, 5mL无水甲醇所需费氏试剂为CmL。
Λ /每mL费休氏试剂相当于水的mg为.N = ;~； ImL标准水之含水量(mg) =NXB
B-(/52. 9. 3水分测定称取干燥制品O. lg-0. 5g于干燥带塞玻璃瓶中，加无水甲醇5mL，不断振摇，用费休氏试剂滴定到棕色，经振摇I分钟不褪色为终点。并取无水甲醇5mL为对照(空白对照) 取标准水ImL于干燥带塞玻璃瓶中，用费休氏试剂滴定到终点。
曲·/士标准水含水:量(观)^難氏翻滴定数水分测定计算公式
冻干双联生物抗癌制剂水分含量％& Ig) =
(冻千双联生物抗癌制剂滴定数-空滴定数)X iV X I y
冻干双联生物抗癌制剂重量(g)xIO- /0注(1)新配制的费休氏试剂极不稳定，应放一周后使用。另外此试剂异常灵敏， 受空气湿度影响甚大，故滴定操作应在相对湿度低于30%的条件下进行。(2)所用仪器均应干燥无水，全部操作尤其是标准水的吸取和滴定等应迅速准确， 以免延时，吸水，影响结果。
2· 10滴度测定(PFU-空斑法)2. 10. I材料与用具准备细胞鸡胚原代细胞；小牛血清；IOOmL小方瓶，大克氏瓶，聚苯乙烯6孔板；ImLUOmL吸管、镊子、O号橡皮塞等。2. 10. 2各种溶液的配制2. 10. 2. I O. 25%的胰蛋白酶消化液Hanks 液75mL1%的胰蛋白酶 25mL7. 5% 的 NaHCO3 2mL2.10.2.2O. 5% 水解乳蛋白溶液(LH)
Hanks 液 IOOOmL
水解乳蛋白 5g 葡萄糖Ig
无水氯化钙 0.14g将上述液体混合后，以O. 05-0. 06MPa 20分钟消毒灭菌，4°C保存。2. 10. 2.3 IOXE-MEM 母液E-MEM 粉剂 9. 4g双馏水IOOmL将上述液体混匀后，定量分装，O. 05-0. 06MPa 20分钟消毒灭菌4°C保存。2. 10. 2. 4 3% 的谷氨酰胺L-谷氨酰胺3g双馏水IOOmL将上述液体混匀后，除菌过滤，定量分装后加盖胶塞4°C保存2.10.2.5 7. 5%NaHC03NaHCO3 (AR) 7. 5g双馏水IOOmL将上述液体混匀后，除菌过滤，定量分装后加盖胶塞4°C保存2. 10. 2. 6 I. 5% 的甲基纤维素(Sigwa Mw4000)甲基纤维素1.5g、
双馏水IOOmLO. 05-0. 06MPa 20分钟消毒灭菌后放4°C保存2. 10. 2. 7双联生物抗癌制剂稀释液O. 5%LH96mL小牛血清(NCS)2mL7. 5%NaHC03 2mL
2. 10. 2. 8覆盖物配制
1.5%甲基纤维素50 mL
IOxMEMIOmL
小牛血清(NCS)IOmL 3%谷氨酰胺I mL
双抗I mL
双蒸25 mL
7.5%NaHC03' mL2. 10. 2. 9结晶紫染色液(I)结晶紫母液5%结晶紫结晶紫 25g无水酒精475mL将上液体混匀过滤去掉残渣
(2)使用液总量 SOOmL 5%结晶紫母液 IOOmL 0.85%NaCimL
40% 甲醛25 mL2. 10. 3 FL细胞的制备与培养2. 10. 3. I细胞扩增FL细胞发育良好的细胞I瓶，弃掉细胞营养液，加O. 25%的胰蛋白酶Hanks液每小瓶4mL，置室温(22° -37°C左右)1-3分钟，吸弃消化液(一定要吸净)，取IOmL吸管(吸IOmL营养液)吹打细胞，使其细胞分散后加入营养液，以1:3的比例 (每小瓶加入20-30mL营养液)混均分装3小瓶37°C培养2_7天。2. 10. 3. 2接种6孔板将其发育良好细胞瓶1:3的比例制备成细胞悬液(方法同上)接种在6孔聚苯乙烯板上每孔4mL，在37°C的2. 5%C02孵箱培养48小时，细胞长满形成单层后接种双联生物抗癌制剂冻干前原液和冻干后溶液。2. 10. 4接种双联生物抗癌制剂冻干前原液和冻干后溶液2. 10. 4. I每批双联生物抗癌制剂原液取样I份(不得少于50mL) 10倍稀释，即 Kr1-IO'取 ο—4、 ο—5、 ο-6三个稀释度的双联生物抗癌制剂原液接种于6孔板，每个稀释度接种两孔，O. 2mL/孔。2. 10. 4. 2每批冻干双联生物抗癌制剂至少取三瓶样品复原后(每瓶加入稀释液 ImL)混匀为原倍，10倍稀释，即KT1-IO-6,取10_4、10_5、10_6三个稀释度的双联生物抗癌制剂原液接种于6孔板，每个稀释度接种两孔，O. 2mL/孔。2. 10. 4. 3将4. I和4. 2项已接种孔板的双联生物抗癌制剂，同时放入37°C吸附 90分钟，每隔30分钟轻轻摇动一次。
2. 10. 5覆盖和染色吸附90分钟后，用甲基纤维素覆盖，4mL/孔，置37°C的2. 5%C02孵箱中培养，5天后吸出覆盖物，结晶紫染色(每孔加入染色使用液5mL,放置室温10-20分钟)后,流水冲洗染色液，再进行空斑计数。2. 10. 6空斑计数及判定例空斑形成试验计算表2. 10. 6. I以出斑数为10倍数稀释度进行计算。
权利要求
1.一种抗癌药物组合物，其特征在于它的活性成分由NDV粒子和NA组成，且NDV活性为 106 107PFU/ml，NA 活性为 0. OTO. 02u/ml。
2.权利要求I所述的抗癌药物组合物，其特征在于所述的抗癌药物组合物呈冻干制剂。
3.权利要求2所述的抗癌药物组合物，其特征在于所述的冻干制剂进一步含有保护剂；所述的保护剂按占组合物总重量的百分比计包括明胶1%、味精1%、人白蛋白1%、蔗糖10%、尿素0. 5%和L-精氨酸0. 2%。
4.权利要求I所述的抗癌药物组合物，其特征在于它是瓶装冻干制剂，由活性成分和保护剂组成，所述的活性成分由NDV和NA组成；每瓶中，NDV活性为IO6 107PFU/ml，NA活性为0. oro. 02u/ml ;所述的保护剂按占组合物总重量的百分比计包括明胶1%、味精1%、人白蛋白1%、蔗糖10%、尿素0. 5%和L-精氨酸0. 2%。
5.权利要求I所述的抗癌药物组合物，其特征在于所述的NDV是按照以下方法制备得到的NDV a)原代NDV病毒的分尚 选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡，从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城疫病毒； b)NDV毒种的传代 将步骤a)分离得到的NDV病毒以常规方法在9-11日龄鸡胚尿囊腔中接种传代，直至收获能够产生足量病毒的鸡胚尿囊液，得到NDV悬液；c ) NDV病毒扩增 用步骤b)得到的NDVlO代以内的生产用毒种通过鸡胚单层原代细胞培养法进行病毒扩增，具体包括以下步骤 Cl)按照常规方法进行孵鸡蛋、取鸡胚、剪胚、消化、分散吹打，得到细胞悬液I ;c2)在步骤Cl)得到的细胞悬液I内加入细胞生长液，按照常规方法静止培养2天，待细胞形成单层后，洗去单层细胞的残余牛血清，加入细胞维持液，得到细胞悬液2 ； c3)将步骤b)得到的NDV悬液以l/5(Tl/25的体积比加入步骤c2)得到的细胞悬液2中，36°C静置培养2-3天后，即完成NDV病毒的扩增，最终得到的NDV悬液血凝效价为1:640 1:1280，滴度为 6LogPFU/ml 7LogPFU/ml。
6.权利要求5所述的抗癌药物组合物，其特征在于步骤c2)所述的细胞生长液配方如下，以IOOmL计=Eagle (MEM) 60mL、0. 5%水解乳蛋白溶液30mL、小牛血清5-1OmL, pH值7.2的2%NaHC03 2mL和卡那霉素100U/mL ;或199培养基90mL、小牛血清5_10mL、pH值7. 2的 2%NaHC03 2mL 和卡那霉素 100U/mL。
7.权利要求5所述的抗癌药物组合物，其特征在于步骤c2)所述的细胞维持液配方如下，以 IOOmL 计Eagle (MEM)90mL、小牛血清 3_5mL、pH 值 I. 4-7. 6 的 2%NaHC03 3_5mL 和卡那霉素100U/mL ;或0. 5%水解乳蛋白溶液90mL、小牛血清3_5mL、pH值7. 4-7. 6的2%NaHC033-5mL和卡那霉素100U/mL ;或199培养基90mL、小牛血清3_5mL、pH值7. 4-7. 6的2%NaHC033-5mL和卡那霉素100U/mL。
8.权利要求I所述的抗癌药物组合物的制备方法，包括以下步骤 I)制备NDV悬液- 1.1)选择出呼吸道紊乱，伴有罗音、气喘和咳嗽、抑郁、虚脱和严重腹泻、排出绿色稀粪的患鸡瘟的病鸡，从病鸡呼吸道分泌物或肺组织中分离出鸡新城疫病毒；分离得到的NDV病毒以常规方法在9-11日龄鸡胚尿囊腔中接种传代，直至收获能够产生足量病毒的鸡胚尿囊液，得到NDV悬液； I. 2) NDV病毒扩增 用步骤I)得到的NDVlO代以内的生产用毒种通过鸡胚单层原代细胞培养法进行病毒扩增，具体包括以下步骤 I. 2. I)按照常规方法进行孵鸡蛋、取鸡胚、剪胚、消化、分散吹打，得到细胞悬液I ; I. 2. 2)在步骤I. 2. I)得到的细胞悬液I内加入细胞生长液，按照常规方法静止培养2天，待细胞形成单层后，洗去单层细胞的残余牛血清，加入细胞维持液，得到细胞悬液2 ； I.2. 3)将步骤I. I)得到的NDV悬液以1/50 1/25的体积比加入步骤I. 2. 2)得到的细胞悬液2中，36°C静置培养2-3天后，即完成NDV病毒的扩增，最终得到的NDV悬液血凝效价为 1:640 1:1280，滴度为 6LogPFU/ml 7LogPFU/ml，备用； 2)制备抗癌药物组合物 将步骤I)得到的NDV悬液中加入市售的NA，每3000mLNDV悬液中加入30 60U的NA，充分摇匀，然后将NDV和NA的混悬液用0. 22 y m微孔的滤膜过滤，得到滤液，然后将该滤液按照常规方法制备成药物学上可接受的各种剂型。
9.权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤2)所述的药物学上可接受的各种剂型是冻干粉剂，制备方法是在步骤2)得到的滤液中再进一步加入所述比例的保护剂，然后送到冻干室，立即分装小瓶，分为Iml/瓶，加胶塞；装入冻干机，按照冻干曲线操作；冻干完成后，轧紧胶塞和外加铝盖，即得到所述的抗癌药物组合物的冻干粉剂。
全文摘要
本发明涉及一种抗癌药物组合物，它的活性成分由NDV粒子和NA组成,且NDV活性为106~107PFU/ml，NA活性为0.01~0.02u/ml。本发明所述的抗癌药物组合物具有抗肿瘤谱广、治疗作用显著，且无明显毒副作用；又有免疫作用，而且对癌细胞具有直接杀伤作用的优点。本发明还提供所述抗癌药物组合物的制备方法。
文档编号A61K35/76GK102698257SQ201210233688
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者张炳团 申请人:张炳团