一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法

一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法
【专利摘要】本发明涉及组织工程材料领域。具体地说，本发明涉及一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法，其中采用绿色表面活性剂吡喃葡萄糖苷进行脱细胞处理，不仅能完全去除细胞而且保持了ECM支架的超微结构和组成成分。
【专利说明】一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法
【技术领域】[0001]本发明涉及组织工程材料领域。具体而言，本发明涉及一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法。
【背景技术】
[0002]组织是由细胞和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)组成的,其中的细胞成分作为抗原被宿主识别后会引发炎症或免疫排斥反应。而ECM是结构蛋白和功能蛋白的复合物，该组分在不同物种间通常是受保护的而且耐受性良好。由ECM组成的生物支架材料被广泛应用在外科手术重建和组织与器官的再生医学领域，如心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、肌腱和小肠粘膜下层等。ECM是组织和器官中的细胞的分泌产物，与这些细胞之间有着动态的相互作用，能够及时反映微环境的改变，同时在细胞迁移、分化和增殖方面有着重要的作用。其三维结构与体内细胞生长的天然环境接近，不仅可以起着支架材料的作用，而且包含的多种生长因子在组织修复和重建中有重要促进作用，即使经过脱细胞处理仍有活性，是细胞生长的理想环境。
[0003]利用已知的常规方法将异源或异种结缔组织(例如心包膜、瓣膜、皮肤、血管和小肠粘膜下层)的细胞脱除，形成一种称为脱细胞的细胞外基质，在脱细胞过程中，去除导致组织排斥的细胞，同时保留原始组织的复杂结构和关键生化组分。不同的脱细胞方法直接影响所得脱细胞基质的成分和超微结构，最终影响移植后宿主对脱细胞基质的反应。
[0004]目前脱细胞基质的制备方法有很多，主要包括物理法、化学法和生物处理法。物理法主要是通过物理的作用如冻融、液体高压、超声波和电击等脱除细胞，它们的基本原理是破坏组织中细胞的细胞膜结构，细胞膜结构的变化导致细胞产生不良生物化学反应，持续的处理将使细胞死亡，随后通过溶液的清洗、核酸及脂质的去除而脱去组织的细胞。化学法就是使用化学试剂破碎细胞达到去除细胞的目的。一些特定的化学试剂如酸、碱和去污剂等可以渗透组织的各层，溶解细胞膜的双分子层磷脂甚至破坏细胞膜蛋白导致细胞死亡和破碎，之后通过振荡清洗等步骤洗去细胞残渣和抗原物质。生物处理法主要是用酶试剂来裂解细胞。例如脱细胞方法中通常会用到胰蛋白酶，它是一类丝氨酸蛋白酶，能选择性地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，胰蛋白酶的作用使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
[0005]中国专利申请号N0.201110134511.9涉及一种同种脱细胞真皮基质制备方法，使用十二烷基硫酸钠进行脱细胞处理，虽然用时短，但十二烷基硫酸钠对基质结构有较大损伤，且十二烷基硫酸钠有明显的毒性，不利于体内植入。中国专利申请号N0.200510002464.7涉及异种心血管移植物的脱细胞方法，而中国专利申请号N0.200910076674.9涉及一种脱除血管组织内细胞的血管基质及其制备方法。这两个专利申请都使用了胰蛋白酶，虽然处理时间和浓度各异，但胰蛋白酶必然会对支架不同程度的降解，破坏支架材料的结构和组成成分，且经胰蛋白酶处理后的组织会有大约30%的肿胀。
[0006]传统去污剂在脱细胞处理过程中，虽能去除细胞，但其残留会引起细胞毒性及潜在的免疫性[非专利文献2和3]。避免这一毒性反应的发生必须去除去污剂或替换新型无毒的试剂，去除去污剂的方法很多且过程繁琐、不彻底，因此需要寻找一种新型无毒可降解且能完全脱除组织器官的细胞的替代试剂。使用环保型生物降解完全无毒的去污剂在脱细胞基质的制备上有着重要的意义。
[0007]η-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(n-Octyl beta-D-Glucopyranoside,简称 0GP)是一种性能优良的新型绿色表面活性剂，兼具非离子与阴离子表面活性剂的特性。它不仅表面张力低、活性高、去污力强、泡沫丰富细腻而稳定，而且具有对皮肤无刺激、生物降解好、无毒、对环境无污染等优点。研究表明[非专利文献I]，OGP表面活性高，能够破坏细菌的细胞膜结构，具有广谱抗菌性，如对革兰氏阴、阳性菌等均有抗菌作用，且抗菌性强，是理想的温和非离子表面活性剂 。

【发明内容】

[0008]本发明所解决的技术问题是提供一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法。该方法可彻底脱除存在于组织表面和内部的细胞及细胞碎片，制备出具有较好的力学性能和生物学特性的细胞外基质材料，从而得到组织工程所用的支架材料。
[0009]本发明涉及一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法，包括以下步骤:
[0010]a.对待用组织器官进行预处理；
[0011]b.将经过预处理的待用组织器官加入到含有吡喃葡萄糖苷的溶液中，通过低渗溶液振荡处理，以破坏细胞膜结构和抽提细胞膜的脂质和膜蛋白；
[0012]c.将步骤b处理后的组织器官加入到含有核酸酶的溶液中，以降解细胞中各类DNA和/或RNA成分；以及
[0013]d.洗涤制备的细胞外基质支架材料。
[0014]根据本发明，所述的待用组织器官为异种或同种异体或自体组织器官，包括牛心包、猪心包、心脏瓣膜、皮肤、血管、小肠粘膜下层、神经等中任意一种。一般来说，含有较多胶原纤维或弹力纤维的组织器官适宜用此方法去除细胞成分。
[0015]根据本发明，所述的预处理是使用含有抗生素的生理盐水，或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液，或pH值为6.8-8.6的D-Hanks溶液(Hanks溶液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一，也是组织培养基本用液。D-Hanks溶液则是无钙镁离子的Hanks液，GIBCO公司)，在0-37°C条件下对待用的组织器官进行常规清洗、消毒、分离。
[0016]根据本发明，所述的吡喃葡萄糖苷选自η-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OGP)、辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、壬基吡喃葡萄糖苷、癸基吡喃葡萄糖苷、十二烷基吡喃葡萄糖苷的任一种或其组合(该组合也可统称为烷基葡萄糖苷)，优选0GP。
[0017]根据本发明，所述的吡喃葡萄糖苷的浓度小于70%(w/v)，即重量:体积为70克:100毫升，优选0.1-10% (w/v)，即重量:体积为0.1-10克:100毫升，更优选0.5-5% (w/V)。含有吡喃葡萄糖苷的溶液的温度范围为1°C _40°C，更优选3°C -8°C 0含有吡喃葡萄糖苷的溶液的PH值范围为5-12，更优选6.8-8.6，处理时间为30分钟-96小时，更优选6_48小时。
[0018]所述的低渗溶液振荡处理是采用0.01M无菌的Tris-HCl缓冲液(pH6.8-8.6)，在rc -400C (更优选3°C -8°C )中振荡处理30分钟-96小时(更优选6_48小时)，振荡速率为 50-360rpm,更优选 100_250rpm。
[0019]所述的核酸酶溶液的配制过程是在含有0.15M氯化钠和l_5mM氯化镁的无菌的 0.02-0.05M Tris-HCl 缓冲液(pH6.8-8.6)中加入 100-10000u/ml (优选 1000_8000u/ml)的脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase),在37°C环境中60_360rpm(优选100-250rpm)转速下振荡处理12-72小时。
[0020]所述的洗涤是使用含有抗生素的生理盐水，或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液，或PH值为6.8-8.6的D-Hanks溶液，在1°C _25°C条件下对所得的脱细胞基质进行常规清洗，清洗时间为6-48小时。
[0021]本发明脱细胞基质的评价标准及其方法:
[0022]1.残留细胞:脱细胞基质用10%中性福尔马林固定,石腊包埋,切成0.4微米厚的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，苏木素一伊红染色，观察细胞残留情况。
[0023]2.基质纤维结构:脱细胞基质用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切成0.4微米厚的薄片，经二甲苯脱腊、系列酒精脱水，Movat Pentachrome染色,观察基质中胶原纤维、弹力纤维和糖蛋白的分布情况和结构变化情况。
[0024]3.脱细胞基质DNA含量的测定:将组织磨碎，裂解，将裂解后的样品按PureLinkGenomic DNA Mini Kit 提纯 DNA,用 PicoGreenOi) dsDNA Assay Kit 测定，在 545nm 波长处测吸光度，计算DNA含量。
[0025]4.脱细胞基质含水量的测定:将湿态样品夹在两层干滤纸中间，滤纸上压一重50g的物体30s，测得样品湿重；将样品真空冷冻干燥24h测得干重。按含水量=(湿重-干重)/干重X 100%计算样品的含水量。
[0026]5.基质表面细胞残留:脱细胞基质用2.5%戊二醛溶液固定，乙醇逐级脱水，干燥，真空喷金，扫描电镜组织表面细胞残留和纤维排列情况。
[0027]6.胶原蛋白含量测定:脱细胞基质在6M HCl中106°C溶解24h。水解产物用氯胺T溶解20°C处理20min，之后加入含高氯的醛酸中，60°C水浴15min，550nm处测吸收值，测定羟脯氨酸含量，并按胶原蛋白中羟脯氨酸约占12.7%的比例，推算出胶原蛋白含量。
[0028]7.弹性蛋白含量测定:脱细胞基质以0-2mmol/L草酸100°C煮沸60分钟，离心，取上清液，如此反复抽提3次，合并上清液，弹性蛋白含量(/干重组织)的测定用Fastin弹性蛋白试剂盒测定(Biocolor公司)。
[0029]8.脱细胞基质拉伸强度的测定:将脱细胞基质裁成板材状，在万能材料试验机上将将其拉断，所测的最大拉力除以试材的截面积，为基质材料的拉伸强度，表示基质的抗拉能力。
[0030]9.脱细胞基质断裂伸长率的测定:将脱细胞基质裁成板材状，在万能材料试验机上将其拉断，记录试样从被拉断的长度，除以试样的长度所得的百分比，即为基质材料的断裂伸长率，表示材料的变形能力。
[0031]10.脱细胞基质弹性模量的测定:将脱细胞基质裁成板材状，在万能材料试验机上将将其拉断，得出基质材料的拉伸应力和应变，作应力-应变曲线图，线性拟合，计算直线的斜率，得出弹性模量，反映材料抵抗弹性变形能力。
[0032]11.脱细胞基质体外细胞毒性实验:根据GB16886.5-2003和GB/T14233.2_2005_8的方法，采用浸提液和MTT的方法，对材料的细胞毒性进行测试。[0033]本发明采用的吡喃葡萄糖苷由可再生资源天然脂肪醇(脂肪醇为具有8至22个碳原子链的脂肪醇，可分为天然脂肪醇和合成脂肪醇。天然脂肪醇以天然的动植物油脂为原料，如来源比较丰富的椰子油、棕榈油和牛油，水解所得脂肪酸再还原为醇，统称为天然脂肪醇)和葡萄糖合成，是一种性能较全面的新型非离子表面活性剂，兼具普通非离子和阴离子表面活性剂的特性，具有高表面活性、良好的生态安全性和相溶性，是国际公认的首选“绿色”功能性表面活性剂。具有良好的溶解性、温和性和脱脂能力，对皮肤刺激小，无毒、而且易漂洗。此外，还具有杀菌消毒、降低刺激等特点。吡喃葡萄糖苷在强碱、强酸和高浓度电解质中性能稳定，腐蚀性小，且易于生物降解不会造成对环境的污染。性能温和，对细胞外基质的超微结构和功能蛋白几乎没有损伤。具有无毒易降解的特点，对人体无害。为进一步增强吡喃葡萄糖苷脱细胞效果，可以联合物理方法共同处理待用的组织器官。本发明中主要采用物理法中的低渗溶液浸泡，振荡和调节温度的方式，增加吡喃葡萄糖苷的脱细胞效果。 [0034]本发明中的吡喃葡萄糖苷、低渗溶液及核酸酶的联合应用可以高效地去除组织器官中的细胞成分，克服了传统表面活性剂有毒性、去细胞不充分或损伤细胞外基质成分等缺点，制备的脱细胞基质的免疫原性大幅降低且细胞毒性低，生物相容性好，是一种较好的组织工程支架材料。
【专利附图】

【附图说明】
[0035]为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些【具体实施方式】。本发明的技术方案包括但不限于这些附图。
[0036]图1为含有细胞的新鲜猪心包组织的显微镜照片(HEx200)。
[0037]图2为经脱细胞处理后的猪心包组织的显微镜照片(HEx200)。从图片可以看出，经本发明的脱细胞方法处理后，猪心包组织中的细胞结构消失，能完全去除细胞。
[0038]图3为新鲜猪心包组织的显微镜照片(Mavot pentachrome x400)。
[0039]图4为经脱细胞处理后的猪心包组织的显微镜照片(Mavot pentachrome x400)。从图片可以看出，经本发明的脱细胞方法处理后，猪心包组织中的胶原纤维排列整齐，无明显断裂，仍呈波浪状平行排列，结构紧凑，弹性纤维结构清晰，组织无明显水肿。
[0040]图5为新鲜猪心包组织的电子显微镜照片(SOOx)。
[0041]图6为经脱细胞处理后的猪心包组织的显微镜照片(SOOx)。从图片可以看出，经本发明的脱细胞方法处理后，猪心包组织中的胶原纤维排列整齐，无明显断裂，仍呈波浪状平行排列，结构紧凑连续。
【具体实施方式】
[0042]为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的优选方案进行描述。这些描述只是举例说明本发明方法的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。
[0043]实施例1
[0044]I)材料制取:猪心包取自当地屠宰厂，健康成年猪宰杀后取出心脏，割取心包膜，热缺血时间小于2小时。磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗去除血凝块后置于保存液中，带回实验室，无菌条件下剔除外周脂肪，取无损伤、厚度均匀的前壁部分修剪为3cmX4cm的小片，PBS溶液充分漂洗，4°C保存含抗生素的无菌的PBS溶液中。
[0045]2)猪心包的去细胞处理:将6片3cmX 4cm的心包分别放入6瓶1% OGP (阿拉丁试剂(上海)有限公司)的IOmM Tris-HCl缓冲溶液中进行振荡消化24h，4°C，150rpm/min，每瓶溶液含有1%硫酸链霉素(阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号:C1208010)和青霉素钠(阿拉丁试剂(上海)有限公司，批号:16458)的双抗溶液。之后在无菌的PBS(pH7.30)进行清洗，15min/次，清洗5次；清洗完后依次将心包放在核酸酶溶液中37°C振荡消化24h。核酸酶溶液为:2.5KU/ml DNase I (Sigma 公司)、7.5KU/ml RNase (Sigma 公司)、0.15MNaCl、2mM MgCl2(H2O)6 和 1% 双抗的无菌的 50mM Tris-HCl 缓冲液(ρΗ7.60)。
[0046]3)洗涤:在无菌的含双抗的PBS缓冲液(ρΗ7.30)进行振荡清洗24h，转速为150rpm，清洗完后依次将心包在4°C保存含双抗的无菌的PBS溶液中。 [0047]结果评价:
[0048]1.残留细胞:脱细胞猪心包经常规苏木素一伊红染色，证实无细胞结构存在(参见图2)。
[0049]2.基质纤维结构:脱细胞猪心包经Movat Pentachrome染色,可观察到经本发明的脱细胞方法处理后，猪心包组织中的胶原纤维排列整齐，无明显断裂，仍呈波浪状平行排列，结构紧凑，弹性纤维结构清晰(参见图4和6)。
[0050]3.脱细胞基质DNA含量的测定:经DNA检测试剂盒测得未脱细胞的猪心包DNA含量是522.063±46.44ng/mg干重组织，经过本发明的脱细胞处理后的DNA含量为
5.642 ± 1.75ng/mg干重组织,统计学分析有显著差异。
[0051]4.脱细胞基质含水量的测定:新鲜猪心包组织的含水量是79.427 ±0.29%，经脱细胞处理后的猪心包组织的含水量是81.432±0.74%，统计学处理无显著差异。
[0052]5.基质表面细胞残留:扫描电镜观察未脱细胞的猪心包组织表面有大量的细胞存在，经脱细胞处理后的猪心包组织可看到排列有序的纤维，且无纤维断裂。
[0053]6.胶原蛋白含量测定:由测得羟脯氨酸换算得未脱细胞的猪心包组织的胶原蛋白含量是46.218±1.27%，经脱细胞处理的猪心包组织的胶原蛋白含量是46.785±0.42%，统计学处理无显著差异。
[0054]7.弹性蛋白含量测定:由Fastin弹性蛋白试剂盒测定的未脱细胞的猪心包组织的弹性蛋白含量是5.185±0.005 μ g/mg干重组织，经脱细胞处理的猪心包组织的弹性蛋白含量是4.316 ± 0.001 μ g/mg干重组织，统计学处理无显著差异。
[0055]8.脱细胞基质拉伸强度的测定:在万能材料试验机上测得基质材料的拉伸强度，新鲜猪心包的最大拉伸强度为14.362±0.82MPa，经脱细胞处理的猪心包的最大拉伸强度为13.461 ±0.55MPa，统计学处理无显著差异。
[0056]9.脱细胞基质断裂伸长率的测定:在万能材料试验机上测得基质材料的断裂伸长率，新鲜猪心包的断裂伸长率为70.621 ±5.09%，经脱细胞处理的猪心包的断裂伸长率为79.235 ±2.81%，统计学处理有显著差异。
[0057]10.脱细胞基质弹性模量的测定:在万能材料试验机上测得基质材料的弹性模量，新鲜猪心包的弹性模量为81.335±4.23MPa，经脱细胞处理的猪心包的弹性模量为66.302±6.13MPa，统计学处理无显著差异，组织经过处理后略微变得柔软。
[0058]11.脱细胞基质体外细胞毒性实验:根据浸提液和MTT的方法测得未脱细胞的猪心包组织的相对增值率是102.325±1.77%，细胞毒性级别为O级；经脱细胞处理的猪心包组织的相对增值率是92.167±1.35%，细胞毒性级别为I级，统计学处理无显著差异。
[0059]实施例2
[0060]按实施例1方法制取猪心包组织后，将6片3cmX 4cm的心包分别放入6瓶2% OGP的IOmM Tris-HCl缓冲溶液中进行振荡消化16h，4°C，150rpm/min，每瓶溶液含有1%硫酸链霉素和青霉素钠的双抗溶液。之后在无菌的PBS(pH7.30)进行清洗，15min/次，清洗5次；清洗完后依次将心包放在核酸酶溶液中37°C振荡消化24h。核酸酶溶液为:2.5KU/mlDNase 1、7.5KU/ml RNase、0.15M NaCl、2mMMgCl2 (H2O)6 和 1%双抗的无菌的 50mM Tris-HCl缓冲液(PH7.60)。在无菌的含双抗的PBS缓冲液(pH7.30)进行振荡清洗24h，转速为150rpm，清洗完后依次将心包在4°C保存含双抗的无菌的PBS溶液中。
[0061]实施例3
[0062]按实施例1方法制取猪心包组织后，将6片3cmX 4cm的心包分别放入6瓶1%十二烷基吡喃葡萄糖苷(阿拉丁试剂(上海)有限公司)的IOmM Tris-HCl缓冲溶液中进行振荡消化24h，4°C，150rpm/min,每瓶溶液含有1%硫酸链霉素和青霉素钠的双抗溶液。之后在无菌的PBS (pH7.30)进行清洗，15min/次，清洗5次；清洗完后依次将心包放在核酸酶溶液中 37°C振荡消化 24h。核酸酶溶液为:2.5KU/ml DNase 1、7.5KU/ml RNase、0.15M NaCl,2mM MgCl2 (H2O) 6和1%双抗的无菌的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.60)。在无菌的含双抗的PBS缓冲液(ρΗ7.30)进行振荡清洗24h，转速为150rpm，清洗完后依次将心包在4°C保存含双抗的无菌的PBS溶液中。
[0063]实施例4
[0064]按实施例1方法制取猪心包组织后，将6片3cmX 4cm的心包分别放入6瓶1%烷基葡萄糖苷(河北石家庄金莫尔化学品有限公司)的IOmM Tris-HCl缓冲溶液中进行振荡消化24h，4°C，150rpm/min，每瓶溶液含有1%硫酸链霉素和青霉素钠的双抗溶液。之后在无菌的PBS (pH7.30)进行清洗，15min/次，清洗5次；清洗完后依次将心包放在核酸酶溶液中 37°C振荡消化 24h。核酸酶溶液为:2.0KU/ml DNase 1、8.0KU/mlRNase、0.15M NaCl、5mM MgCl2(H2O)6和1%双抗的无菌的50mMTris_HCl缓冲液(pH7.60)。在无菌的含双抗的PBS缓冲液(ρΗ7.30)进行振荡清洗24h，转速为150rpm，清洗完后依次将心包在4°C保存含双抗的无菌的PBS溶液中。
[0065]使用可生物降解、无毒无刺激、对环境无污染的辛基-D-吡喃葡萄糖苷进行脱细胞处理，不仅能完全去除细胞而且保持了支架的超微结构和组成成分。
[0066]以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明方法进行若干改进和修饰，但这些改进和修饰也落入本发明权利要求请求保护的范围内。
[0067] 参考文献
[0068]非专利文献1.Ecological properties of alkyl glucosides, Chemosphere, 1997，35(3):545-556.[0069]非专利文献 2.Detergent deceIlularization of heart valves for tissueengineering:toxicological effects of residual detergents on human endothelialcells.Artif Organs, 2010, 34(3):206-210.[0070]非专利文献 3.Does Sodium Dodecyl Sulfate Wash Out of Detergent-TreatedBovine Pericardium at Cytotoxic Concentrations ? The Journal of Heart ValveDisease, 2009，18:101- 。
【权利要求】
1.一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法，包括以下步骤: a.对待用组织器官进行预处理； b.将经过预处理的待用组织器官加入到含有吡喃葡萄糖苷的溶液中，通过低渗溶液振荡处理； c.将步骤b处理后的组织器官加入到含有核酸酶的溶液中；以及 d.洗涤制备的细胞外基质支架材料。
2.权利要求1的方法，其中所述的待用组织器官为异种或同种异体或自体组织器官，选自牛心包、猪心包、心脏瓣膜、皮肤、血管、小肠粘膜下层、神经中的任意一种。
3.权利要求1或2的方法，其中所述的预处理是使用含有抗生素的生理盐水，或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液，或pH值为6.8-8.6的D-Hanks溶液，在0_37°C条件下对待用的组织器官进行常规清洗、消毒、分离。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述的批喃葡萄糖苷选自η-辛基-β-D-批喃葡萄糖苷(OGP)、辛基-β -D-硫代吡喃葡萄糖苷、壬基吡喃葡萄糖苷、癸基吡喃葡萄糖苷、十二烷基吡喃葡萄糖苷的任一种或其组合，优选0GP。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述的批喃葡萄糖苷浓度小于70%(w/v),优选0.1-10%(w/v)，更优选0.5 -5%(w/v)，含有吡喃葡萄糖苷的溶液的温度范围为1°C _40°C，优选3°C _8°C，含有吡喃葡萄糖苷的溶液的pH值范围为5-12，优选6.8-8.6，处理时间为30分钟-96小时，优选6-48小时。
6.前述权利要求任一项的方法，其中所述的低渗溶液振荡处理是采用无菌的0.01MTris-HCl缓冲液(ρΗ6.8-8.6)，在1°C -40°C (优选3°C -8°C )中振荡处理30分钟-96小时，优选6-48小时，振荡速率为50-360rpm，优选为100_250rpm。
7.前述权利要求任一项的方法，其中所述的核酸酶溶液的配制是在含有0.15M氯化钠和 l_5mM 氯化镁的无菌的 0.02-0.05M Tris-HCl 缓冲液(pH6.8-8.6)中加入 100-10000u/ml (优选1000-8000u/ml)的脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)，在37°C环境中60-360rpm(优选100_250rpm)转速下振荡处理12-72小时。
8.前述权利要求任一项的方法，其中所述的洗涤是使用含有抗生素的生理盐水，或pH值为6.8-8.6的磷酸盐缓冲液，或pH值为6.8-8.6的D-Hanks溶液，在1°C _25°C条件下对所得的脱细胞基质进行常规清洗，清洗时间为6-48小时。
【文档编号】A61L27/36GK103536967SQ201210237911
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月10日 优先权日:2012年7月10日
【发明者】董教明, 李 雨, 陈大凯, 陈叶萌, 王静, 穆元姗, 房圆, 陈国明, 张晓怡, 乐承筠, 罗七一 申请人:上海微创医疗器械（集团）有限公司