专利名称：在培养物中复制流感病毒的方法
在培养物中复制流感病毒的方法本申请是申请日为2007年12月14日，申请号为200780051376. 3的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求2006年12月15日申请的美国申请60/875287和2006年12月28日申请的美国申请60/882412的优先权，二者均纳入本文作为参考。
背景技术：
人们已认识流感流行和大流行达数个世纪，并且它已经导致了相当多的生命丧失。流感病毒是一种分段的含有RNA的病毒，属于正黏病毒科。流行和大流行是由具有在人群中很少有免疫性的新包膜成分的病毒引起的。这些新成分通常为人类和动物流感病毒突变和/或混合的结果。然而，流感病毒的衣壳为略微多晶的，其外表面与所有病毒一致，由脂质包膜组成，从脂质包膜上伸出两种突出的糖蛋白棘血细胞凝集素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)。有三种类型的流感病毒A、B和C型。仅A型流感病毒基于两种主要的表面糖蛋白HA和NA进一步分类为亚型。A型流感亚型根据病毒株进一步分类。B型流感病毒仅感染哺乳动物并在人中致病，但一般不如A型严重。C型流感病毒也仅仅感染哺乳动物，但仅在儿童引起非常轻的呼吸道疾病。它们在遗传学上和形态学上与A和B型不同。A型流感病毒感染很多种动物，包括哺乳动物，如，人、马、狗、猪、白鼬、鸟类，如鸭、鸡和火鸡。有16种已知HA血清型和9种已知NA血清型。鸟类为特别重要的储存库，其生成遗传学上/抗原学上不同的病毒的库，所述病毒通过人和动物之间的近距离接触转移到人群中。猪可感染人类和鸟类流感株。因为这种不寻常的特征，当同一细胞感染两种类型的病毒时，猪被认为是允许鸟类和人类病毒之间基因交换的“混合容器”。流感病毒基因组由分成8段的单链(_)有义RNA组成(C型流感为7段)。因为已经作出了大量遗传学研究(传统和分子)基因组结构是详知的。每段编码一种或两种病毒蛋白。人们相信流行和大流行是因为流感病毒HA和NA蛋白的两种不同的方式的遗传改变而引起抗原漂移和抗原转变。抗原漂移经常发生，而抗原转变仅仅偶尔发生。A型流感病毒进行两种变化，B型流感病毒仅通过更渐进性的过程抗原漂移而变化。抗原漂移是指通过两个基因中的点突变发生的小而渐进的变化，所述两个基因包含产生主要表面蛋白HA和NA的遗传物质。抗原转变是指在人中产生目前不在人群中流行的新的A型流感病毒亚型的突然而大的变化。抗原转变可通过动物(家禽)与人的直接传播发生，或通过A型人流感和A型动物流感病毒基因混合而通过被称为遗传重配的过程产生新的A型人流感病毒亚型。抗原转变产生新的A型人流感亚型。当两种不同的流感病毒感染相同细胞并平分或交换一个或多个RNA片段时发生遗传重配。例如，如果转移的片段是HA，则可导致新的病毒株出现，所述病毒株在抗原上为新型，并且进入人群时具有很少或没有免疫性。这个结果可导致流行和/或大流行。流感病毒进入细胞能通过HA棘与含有N-乙酰神经氨酸(NANA =唾液酸)端基的粘蛋白结合而变容易。结合后，颗粒通过内吞作用经包被的凹陷卷入形成内吞囊泡，最后形成核内体。这些被细胞酸化并且在约pH 5. O下，HA单体在核内体中被类胰蛋白酶裂解以激活它们内化。一旦内化，则发生病毒复制并产生流感症状。人们对最近的流感爆发相当关注。业已在狗中鉴别出因犬流感病毒(CIV)所致的一种严重呼吸道疾病。这种呼吸道疾病已被证实有高度传染性。而且，CIV可引起100%的感染率和80%的发病率，以及在严重感染中高达5-8%的死亡率。自从2004年在灵提赛犬中首次检出(Crawford等人,Science 310(5747) :482-485 (2005)), CIV已经很快蔓延至全美国，其中至少25个州报道CIV爆发，并且二十七个州报道CIV血清阳性。引起最近爆发的CIV血清型是H3N8。这种CIV血清型最初在马中发现，认为它是越过种属障碍进入犬类。可能抗犬流感病毒有效疫苗的缺乏在这种 病毒在狗中快速而广泛的传播中起重要作用。A型流感(H5N1，禽流感)病毒也称为“H5N1病毒”是一种A型流感病毒亚型，主要在鸟类中发生，在鸟类中有高度传染性，对鸟类可致死。H5N1病毒不经常感染人类，但这些病毒感染在人类中发生过。迄今为止，已在10个国家(主要在亚洲)报道了超过200例的人类确诊病例，这些病例导致了 150余人死亡。幸运的是，这种病毒还不容易从鸟类传播至人类或在人类之间互相传播。然而，这有可能发生，导致流行或大流行。防止与流行或大流行相关的发病率和致死率的最佳策略是疫苗接种。目前给予人类的流感疫苗在预防住院治疗和死亡方面有很高的性价比，然而，季节性疫苗的世界年产量有限，并且不能实际地覆盖全球高风险人群。现有疫苗是用自世界卫生组织(WHO)或疾病控制中心(⑶C)获得的病毒在蛋中制成，WHO和⑶C每年为疫苗生产提供病毒种子。流行病毒的HA变化(抗原漂移)需要在流感两次爆发期间周期性置换疫苗株。WHO发表了包括南半球和北半球所包括的半年推荐株。为允许有足够的时间生产，WHO在二月测定哪个疫苗株应包括在下个冬天的疫苗内。一般来说，成人一个剂量含有45 u g HA(15ii g每种，3种病毒)的等同物。这个剂量大约为从为一个感染的含胚鸡蛋的尿囊液中得到的纯化的病毒的量。如果制备I亿剂量的灭活的流感病毒疫苗，制造商必须获得I亿个含胚鸡蛋。这使得疫苗生产依赖于高质量含胚鸡蛋的时闸可行性和WH0/CDC提供的种子株。大部分原型种子株甚至在含胚鸡蛋中也不容易生长至高效价。要克服这个困难问题，政府机关首先要通过与高产率的实验室株A/PR/8/34经典重配(以6 2重配从A/PR/8/34株中得到6个片段)创造出高产率的实验室株。遗憾的是，这个方法可能很难做至IJ，并且可能影响所得到的疫苗的抗原性。因此，需要提供生产疫苗的替代方法以预防由流感、特别是高度致病株如H5N1引起的临床疾病。还有，仍然需要提供在快得足以有效预防可能的流行和/或大流行的时间内生产大量救生流感疫苗的方法。本发明解决这些和其他需求。本文所引用的任何参考不应被理解为允许这种参考作为本申请的“现有技术”。发明简述本发明涉及预防A型和B型流感感染的疫苗。相对于现有技术的疫苗和方法，本发明的疫苗和相关方法提供大量优点。例如，本发明的疫苗用组织培养细胞代替含胚鸡蛋生产。所述创造性生产方法通过省略传统疫苗生产步骤而节约了关键时间。另外，本发明的疫苗可用于那些对蛋物质过敏者。本发明还提供可在疫苗中应用的新型免疫原性组合物。这些新型免疫原性组合物可用于免疫动物，包括鸟类，以抵抗流感。在本法明的具体实施方式
中，疫苗接受者为哺乳动物。在一个方面，本发明提供保护犬类抵抗犬流感病毒(CIV)所致的犬呼吸道疾病的疫苗。在另一方面，本发明提供保护人类抵抗通过遗传重配自然产生的流感病毒株的疫苗。本发明提供流感病毒分离物，其特别适于在组织培养细胞中生长。在一个具体实施方式
中，改造的流感病毒分离物根据其在所选择的组织培养细胞系中生长的能力，用有限稀释克隆(limit dilution cloning)选择。在一个具体实施方式
中，通过将包含大量流感亚群的一些流感病毒通过系列稀释为大量等分试样，来选择适于在培养细胞系中生长的流感病毒亚群。然后大量等分试样与培养的细胞系接触，和/或在培养的细胞系中生长。大量流感病毒亚群中的一个流感病毒亚群经检测被鉴别为以低感染复数(MOI)在培养细胞中生长的流感病毒亚群，并被选为适于在培养细胞系中生长的流感病毒亚群。在相关实施方式中，本发明提供如下方法，其包括使所述适于组织培养的分离物 与组织培养细胞接触，使所述细胞生长一段足以产生致细胞病变效应(CPE)的时间。此方法也可包括收获流感病毒。在一些这样的实施方式中，所述有限稀释克隆方法包括系列稀释流感病毒分离物，并使每种稀释物与培养细胞接触，使所述细胞生长一段足以产生致细胞病变效应(CPE)的时间，从致CPE的最高倍稀释物中收获病毒，并用收获的病毒重复所述方法。在一些实施方式中，所述方法也包括使所述流感病毒分离物与有效量的胰蛋白酶混合，然后与所述培养细胞接触。在一些实施方式中，孵育所述混合物一段足以允许胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使细胞从基底脱离的时间。用于裂解病毒蛋白的胰蛋白酶为IX型胰蛋白酶。在某些情况下，使适于组织培养的分离物与组织培养细胞接触的步骤在感染复数(MOI)小于约0.01，包括小于约0. 001和/或小于约0. 0001的情况下进行。在其他情况下，所述流感病毒分离物首先在组织培养细胞中检测，以测定最适M0I。所述组织培养细胞可为哺乳动物胚胎肾细胞，如，人胚胎肾细胞。所述流感病毒可为A、B和C型流感病毒。在一个具体实施方式
中，所述流感A病毒为H5N1株。所述流感病毒分离物可从任何来源得到，包括如鼻拭子、肺组织，和/或可由第三方提供，如WHO。在一些实施方式中，所述流感病毒分离物起初在含胚鸡蛋中生长，以得到大量适于组织培养的接种物。一些方法包括纯化所收获的病毒。在一个这样的方法中，所述纯化步骤用尺寸排阻层析进行。本发明的方法也可包括在纯化之前、之中或之后将流感病毒第二分离物与第一分离物混合，这种第二分离物是与第一分离物不同的株。在一些方法中，剂量效价研究在混合两种病毒分离物之前进行以测定病毒蛋白具有相等免疫原性的混合物。在一些实施方式中，流感被灭活。在这种类型的一些实施方式中，流感病毒用能有效灭活病毒的量的二乙烯亚胺(binary ethyleneimine)处理。在一些方法中，当血细胞凝集素蛋白含量最高时进行收获。其他实施方式包括通过收获由以下方法制备的病毒分离物来制备的疫苗选择在组织培养细胞中生长的流感病毒，其通过用有限稀释克隆滴定流感病毒分离物以便选择适应于组织培养细胞的流感病毒分离物。在一些实施方式中，所述病毒通过绒膜尿囊(也称为尿囊腔)或羊膜接种途径，由特异性无病原含胚鸡蛋接种制备，然后进行有限稀释克隆。在一个实施方式中，所述流感病毒首先通过含胚鸡蛋的羊膜接种复制以得到适于组织培养细胞的接种物。另外，本发明提供选择在人胚胎肾细胞生长的流感病毒的方法。在一个这样的方法中，流感病毒分离物用有限稀释克隆滴定以便选择适于ffiK细胞的流感病毒分离物。这种方法可包括适于HEK的分离物与HEK细胞接触，以及使所述细胞生长一段足以产生致细胞病变效应(CPE)的时间。在这种类型的具体实施方式
中，收获所得到的流感病毒。本发明也提供疫苗，所述疫苗包括通过这些方法得到的流感病毒分离物。所述方法也包括使所述流感病毒分离物与有效量的IX型胰蛋白酶混合，然后与所述培养细胞接触一段足以使胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使细胞脱离基底的时间。在一个实施方式中，使适于HEK的分离物与HEK细胞接触的步骤在MOI小于约0. 001的条件下进行。在一些实施方式中，本发明进一步提供疫苗，所述 疫苗包括以每剂量小于4iig人流感HA配制的人流感病毒。在一个相关的实施方式中，本发明提供疫苗，所述疫苗包括以每剂量小于3 yg人流感HA配制的人流感病毒。在另一个实施方式中，本发明提供疫苗，所述疫苗包括以每剂量小于2 u g人流感HA配制的人流感病毒。在又一个实施方式中，本发明提供疫苗，所述疫苗包括以每剂量I. 5-3. 5 u g人流感HA配制的人流感病毒。在具体的疫苗实施方式中，佐剂为ISC0M。在其他疫苗实施方式中，至少70%的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的实施方式中，至少80%的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的实施方式中，至少90%的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的实施方式中，多于95 %的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。本发明还提供组合疫苗，以产生保护性免疫来抵抗流感病毒，如犬流感病毒(CIV)和其他疾病，如其他犬类传染病。本发明还提供免疫哺乳动物例如，狗、猫或马抵抗流感的方法。也提供制备和使用传染病(如犬类传染病)的疫苗的方法。在一个具体实施方式
中，本发明的免疫原性组合物包括含有灭活CIVH3N8和佐剂的免疫原性组合物。所述佐剂通常包含水包油乳液。在一个这样的实施方式中，所述佐剂还包含氢氧化铝。在这种类型的一个具体实施方式
中，所述佐剂是Emunade .在另一个实施方式中，所述免疫原性组合物是疫苗。疫苗组合物可包括每剂量约100血细胞凝集单位(HAU)至1500HAU。这可根据接受治疗的个体大小和其他健康因素而变化。所述组合物通常在每剂量250和750HAU之间。在一个实施方式中，所述疫苗组合物包括每剂量约500HAU。本发明的疫苗可任选包括药学上可接受的免疫刺激剂，如细胞固子；生长因子；趋化因子；来自淋巴细胞、单核细胞或来自淋巴器官的细胞的细胞培养物的上清液；植物、细菌或寄生虫的细胞制剂和/或提取液；或促细胞分裂剂。本发明的疫苗可通过如下途径给药胃肠外给药、肌肉注射、皮下注射、腹膜注射、皮内注射、口服、鼻内给药、划痕及上述的组合。在本发明的优选实施方式中，疫苗通过肌肉注射给药。本发明还提供含有与CIV H3N8结合的抗体的来自接种动物的血清，以及纯化抗体本身。在本发明的一个具体实施方式
中，与CIV H3N8结合的纯化抗体是嵌合抗体。本发明还提供组合疫苗，所述组合疫苗包括一种或多种灭活CIV株(如CIV H3N8)与一种或多种包括下列的其他犬病原体和/或免疫原相组合，如对以下产生免疫的免疫原犬瘟病毒；犬腺病毒；犬腺病毒2型；犬细小病毒；犬副流感病毒；犬冠状病毒；犬流感病毒；和/或钩端螺旋体(Leptospira)血清型,如感冒伤寒型kirschneri血清型钩端螺旋体(Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa)、犬型问号血清型钩端螺旋体(Leptospira interrogans serovar canicola)、出血性黄痕问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans icterohaemorrhagiae)和/或波蒙纳问号血清型钩端螺旋体(Leptospirainterrogans serovar pomona)。可加入本发明的联合疫苗的其他犬病原体包括支气管博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica);利什曼(Leishmania)生物，如成人利什曼虫(Leishmania major)和婴儿利什曼虫(Leishmania infantum);包柔氏螺旋体(Borrelia)属螺旋体，包括狭义上的(Ss)博氏疏螺旋体(B. burgdorferi)、博氏疏螺旋体ss、博氏疏螺旋体加利尼(B.garinii)和博氏疏螺旋体阿滋利(B. afzelii);支原体属(如犬支原体)；狂犬病病毒和犬艾希体(Ehrlichia canis)。
本发明提供在培养细胞中生长CIV H3N8的方法。在一些实施方式中，所述培养细胞是非犬的哺乳动物肾细胞。在一个实施方式中，所述细胞为马-达氏(Madin-Darby)牛肾(MDBK)细胞。在另一个实施方式中，所述细胞为Veix)细胞。在一些实施方式中，本发明还提供包含以小于每剂量500HAU配制的CIV H3N8的疫苗。在这些实施方式中，佐剂通常为氢氧化铝，并且至少70 %，通常至少90 %的HA具有相同氨基酸序列。在其他疫苗实施方式中，至少80%的病毒包含具有相同氨基酸序列的HA。在另外的疫苗实施方式中，多于95%的病毒包含具有相同氨基酸序列的HA。本发明的这些和其他方面将通过参考以下附图和实施方式得到更好的理解。
图I显示CIV感染狗之后的平均临床评分。用CIV感染非接种对照和接种的狗，并从感染后-2天至10天每日监测临床征象，如眼和鼻排出物、喷嚏、咳嗽、抑郁和呼吸困难。所述临床征象根据实施例I所述的指南评分，并将每个处理组的临床评分对天数作图。图2证明感染后狗的鼻CIV释出。用CIV感染非接种对照和接种狗。在感染前一天(-1天)收集鼻拭子以证实狗没有感染CIV。通过每天收集鼻拭子10天(感染后I天至10天)在感染狗中监测鼻病毒释出，并在单层MDCK上进行滴定。每个处理组的平均病毒效价以Log1 JCID5tlAiL表示，计算并对感染后天数作图。发明详述生产流感疫苗的传统方法包括在含胚母鸡蛋中分离株的生长，这至少部分是因为鸡蛋廉价且有效，并且因为没有大量生长流感的明显替代选择。在人流感的情况下这尤其确切，因为很多可用于繁殖流感病毒的细胞系还没有经FDA认证用于人类疫苗生产，并且在组织培养中仅得到了很低的效价。当疫苗在鸡蛋中生产时，一般如下制备。最初，从咽拭子或相似的来源回收病毒，在鸡蛋中分离。最初在鸡蛋中的分离很困难，但病毒适应鸡蛋宿主并且其后在鸡蛋中的繁殖相对较容易。在鸡蛋中生长后，纯化病毒，并用福尔马林或￠-丙内酯灭活。生长迹象表明鸡蛋不是最适于病毒繁殖的。例如，用于基于鸡蛋的生产的常规产蛋鸡群具有使病毒制剂受到在这些装置中常见的内生病毒污染的较高风险。而且，成千上万的鸡蛋的分离接种和收集以及复杂的下游加工步骤导致大量时机能将环境污染物引入病毒制剂，这很有可能是2004年某次疫苗召回的原因。如前所述，很难完全移除鸡蛋物质，而这可能导致对疫苗的敏感性。此外，所述加工完全缺乏在需要突然增加时的灵活性，这是因为没有大量适合的鸡蛋可用而造成的物流问题。也有证据表明在鸡蛋中生长可降低病毒的抗原性。一致的，在鸡蛋中生长A或B型流感病毒会生成具有HA突变谱的异源病毒产物。相反，在哺乳动物宿主细胞中相应生长的病毒则生成结构与最初分离的那些相同的流感病毒(Rocha，等人，J. Gen. Virol 1993 ；74 =2513-2518)。而且，在哺乳动物细胞中生长的流感病毒更容易得到在人血清中中和并且HA抑制的抗体，且抗体效价高于鸡蛋中生长的对照(Oxford，等人，Bull WHO 1987 ；65 :181-187)。遗憾的是，所有流感病毒株看来均在鸡蛋中生长，而迄今很多流感病毒株在组织培养细胞中生长不佳，且其中在组织培养细胞中生长的那些经常不能以产生有效疫苗所需的量生长。本发明人现在公开了当用有限稀释克隆(limiting dilution cloning)使病毒在组织培养细胞中生长时，可产生适于组织培养的分离物。令人惊奇的是，本发明人发现在组织培养细胞(如，Vero细胞)中繁殖时，由通过含胚鸡 蛋的羊膜接种得到的病毒的复制能产生可以复制并产生高水平HA的病毒群。所得到的病毒分离物产生的HA效价几乎与用含胚鸡蛋得到的效价相等，而HA效价为疫苗效力的一个重要量度。因此，本发明的一个重要方面涉及生产适于组织培养和适用于流感疫苗(尤其是哺乳动物疫苗)生产的流感病毒分离物的方法。所述方法涉及使用有限稀释克隆来分离和鉴定适于组织培养的病毒。所得到的分离物可经处理以生产疫苗。因此，本发明也涉及生产改进的流感病毒疫苗的方法。为此，本发明提供选择适于组织培养的流感病毒的方法，该方法通过用有限稀释克隆滴定病毒并重复该过程2次或更多次来达成。在一些方法中，所用组织培养细胞是HEK细胞。可用胰蛋白酶或等同蛋白酶增加病毒进入细胞的效率。其他方法包括滴定胰蛋白酶以确定所使用的胰蛋白酶批次和所用细胞的最佳浓度。对所用的每一种流感病毒以及对具体细胞最佳感染复数(MOI)的测定也有助于组织培养繁殖成功。分离的适于组织培养的病毒可用来根据标准方法生产疫苗。在一些实施方式中，所述疫苗包括佐剂ISCOM的使用。在一些实施方式中，所述疫苗包括佐剂氢氧化铝的使用。当疫苗中包括超过一种的病毒株或分离物时，所述方法可包括以免疫学等量混合两种物质。本发明提供适于组织培养的病毒分离物和由此制成的疫苗的方法和组合物。I.选择适于组织培养的病毒的方法用于本发明方法的病毒来源对本发明不重要。例如，病毒可从感染的动物或患者分离得到；作为WHO的种子病毒原液，可从适当的组织(如，ATCC)购买得到；或从科研实验室得到。具体来说，已知CIV引起包括肺炎的严重呼吸道疾病。因此，显示这些症状的狗是可用的来源。分离病毒的适合标本包括鼻洗涤物/抽出物、鼻咽拭子、咽喉拭子、支气管肺清洗物、气管抽出物、胸膜穿刺液、唾液、泄殖腔涂片和尸体解剖标本。来自活体动物的标本优选早期收集，且在某些情况下，在发病后4天内收集。标本可用适合的运输介质收集，并贮存在该介质中直至使用，或者立即使用。如果贮存，则病毒可在较低温下保存，如在4°C下，以保证其存活力。要从标本中分离流感病毒，可以移除大量污染物(如，通过离心)并将上清液接种到各种稀释倍数的各种细胞。或者，来自动物的病毒最初可在母鸡鸡蛋中生长。可用方法证实在过程中的任何时间点的病毒分离物确实是流感。可用各种筛选方法证实所需流感病毒存在于制备适于组织培养的分离物的过程中的任何时间。可通过使用任何已知和/或适合的测定流感病毒的测定来筛选病毒。这种测定包括(单独或组合)用如逆遗传学、重配、互补和/或感染的方法进行的病毒复制、定量和/或定性灭活测量(如，通过抗血清)、转录、复制、翻译、病毒体合并、病毒力、HA或NA活性、病毒产率和/或形态发生。A.组织培养细胞允许流感病毒生长的任何哺乳动物宿主细胞可用于本发明的方法。通常，所述宿主细胞适合排除外源因子，具有可根据WHO对疫苗生产的要求确认的传代数。很多细胞系可用于分离和繁殖流感病毒。已使用的一些细胞系包括=Vero细胞(猴肾细胞)、MDCK细胞(马-达氏犬肾细胞))、BHK-21细胞(幼仓鼠肾)和BSC(猴肾细胞)和HEK细胞(人胚胎肾细胞)。因此，可用允许流感病毒生长的任何组织培养 细胞。适合的细胞包括但不限于Vero、MDBK、BK21、CV-l和任何哺乳动物胚胎肾细胞(如，HEK)。在一些实施方式中，使用Vero细胞或哺乳动物胚胎肾细胞。在一些实施方式中，使用人胚胎肾细胞(HEK细胞)。本领域的技术人员熟知用于上述细胞系繁殖的适合组织培养基。这些培养基可含有浓度高达20% v/v的适合血清(如，胎牛血清)。本领域的技术人员应理解,可以使用含有少于20% v/v血清(2-5% v/v)的培养基来繁殖上述细胞系。B.优化用于细胞的胰蛋白酶为了在细胞培养物中生长出高效价的病毒原液，可用适量的蛋白酶活化血细胞凝集素，使之内化至细胞内。含有蛋白酶的溶液可直接加入到分离物中，或分离物可稀释至用于疫苗生产的分离物生长的蛋白酶中。所述蛋白酶可用来将病毒稀释至适合生长的M0I。蛋白酶可为能激活HA内化而不破坏病毒蛋白使其不能生长和/或感染细胞的任何蛋白酶。这些蛋白酶包括但不限于原核生物蛋白酶、链霉蛋白酶、胰蛋白酶和枯草菌蛋白酶(A)，例如，IX型胰蛋白酶。所用的蛋白酶的量应足以激活病毒，并且对细胞的毒效非常小。毒效可通过鉴定对细胞的损伤特征来分析，如脱离平板或基底、存在细胞碎片、出现死细胞和缺乏活力的细胞。因此，“有效量的胰蛋白酶”是指，当其使用足够时间时，允许胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使细胞从基底分离或引起其他毒效者。也可使用蛋白酶滴定来增加组织培养中活性病毒的产量。滴定包括确定引起细胞最小损伤程度的胰蛋白酶的最大量。这个量可随所用的组织培养细胞以及蛋白酶批次而变化。因此，可在使用之前滴定新的蛋白酶批次以建立最适水平，且每个蛋白酶可对每种组织培养细胞滴定。滴定涉及用所述蛋白酶分步稀释接种组织培养细胞并将其孵育一段合适的时间。例如，可用蛋白酶半步稀释(10_°_5)。孵育时间随细胞系变化，但通常在约2天和7天之间。蛋白酶水平可用所用细胞的通常孵育时间测定。例如，如果4天孵育对流感病毒最好，则蛋白酶可通过在蛋白酶单独存在下孵育约4天测试。然后可用对细胞没有毒性或毒性非常低的蛋白酶最低倍稀释物。可用于哺乳动物组织培养细胞(如Veix)细胞)的胰蛋白酶浓度范围为约0. 5 u g/mL至约10 u g/mL,但更常用约2. 5 ii g/mL培养基。一旦蛋白酶的最适水平确定,病毒可在含有适量蛋白酶(如,胰蛋白酶)的感染培养基中稀释，以便当病毒加入到细胞培养基时达到最适水平。最适量的胰蛋白酶可用于有限稀释克隆以产生适于组织培养的分离物以及用于所述分离物的生长和收获。C。有限稀释克隆典型的病毒培养物是异源的。因此，例如在微滴定板的孔中的单个病毒颗粒在传染性、复制等方面可以变化。系列稀释用于选择培养中的病毒亚群，例如，最适于细胞的亚群。系列稀释涉及系列地稀释病毒培养物直至不含病毒，例如，用来测定最佳MOI。这通常涉及一系列10倍稀释，但可根据病毒效价变化。有限稀释通常用于鉴定对细胞产生病毒效应的最高稀释倍数。所述病毒效应可为致细胞病变效应(CPE)。致细胞病变效应为流感病毒感染引起的对细胞的任何效应。这些效应包括但不限于细胞变圆(cell rounding)、退化、脱落、凋亡、活性氧物质(ROS)诱导、细胞变成颗粒状然后成片段化，以及细胞脱离支持物(如组织培养皿)。收获最高倍稀释物的孔。然后将所收获的病毒稀释至不含病毒，并且重复该过程。系列10倍稀释液通常用适合的培养基配制(含或不含胰蛋白酶)，且将0. 2mL的每种稀释液加入含有组织培养细胞的平板或微滴定板的孔中，并孵育一段足以鉴定细胞的CPE的时间。因为血清灭活胰蛋白酶，所以培养基通常不含血清。收获含有引起CPE的最高倍稀释物的孔 或平板，然后稀释，并且重复该过程。该过程通常重复至少两次，但可重复多达5次。在一些情况下，该过程重复3次。通过本发明的方法生产的病毒培养物特征在于病毒中HA蛋白序列的同质性。有很多方法可用于测量序列同质性程度。例如，对HA蛋白本身测序或通过对编码这种蛋白的RNA测序。本发明的方法生产的病毒制剂通常含有其中至少70%的HA蛋白具有相同氨基酸序列的病毒。在一些实施方式中为80%，或至少90%的HA蛋白具有相同氨基酸序列。D.检测流感病毒的方法可进行检测以证实在本法明方法的过程中任何时间流感病毒的活性和存在。例如，可如下鉴定血细胞凝集。如果病毒具有表面HA蛋白，其可附着在RBC上并使其凝集。如果样品中病毒浓度很高，则当样品与RBC混合时，将形成病毒和RBC晶格。这种现象称为血细胞凝集。这是一种检测使血细胞凝集的病毒(如流感病毒)的存在和效价的简单方法。如果样品中没有足够病毒使RBC血细胞凝集，则它们在孔的底部形成小球。以显示完全血细胞凝集的最高稀释倍数作为终点。病毒效价表达为HA单位(HAU)，为每毫升稀释倍数的倒数。例如，在50 y L中1/32倍稀释时孔中有完全血细胞凝集，但在下一个最高稀释倍数的孔中没有，则所述病毒效价为每50 u L32HAU或每mL 640 HAU。可用于鉴别和定量流感病毒的其他测定包括CPE测定(如本文所讨论)，Western印迹(Western blot)、ELISA、PCR和用对病毒某些部分(具体来说，为HA抗原)有特异性的抗体和/或探针鉴别流感病毒的其他方法。II.生长和收获方法在生产病毒分离物之后，收获所述分离物。可用标准方法。所收获的分离物可储存供以后使用，或可用于用标准方法生产疫苗。当产生最大量病毒时；当产生最大量血细胞凝集素时，如用HA测定方法测量；和/或当细胞裂解时，可收获病毒。在得到适于组织培养的分离物后，所述分离物可生长并收获。生长和收获适于组织培养的病毒的方法对本发明不重要，并且可用标准方法。然而，在一些实施方式中，病毒在其最适的组织培养细胞中生长。所收获的病毒分离物可储存供以后使用，或可用于用标准方法生产疫苗。可通过在适量的蛋白酶(如胰蛋白酶)中以适合的MOI将病毒加入细胞中，使病毒在适合的组织培养细胞中生长一段足以产生高效价的病毒和/或直至细胞裂解的时间。当产生最大量病毒时；当产生最大量血细胞凝集素时；和/或当细胞裂解时，可收获病毒。本文业已发现，病毒在鸡蛋中(在尿囊腔或通过羊膜接种)的最适预生长可增强病毒在组织培养细胞中的适应性。
A.在鸡蛋中的预生长鸡蛋培养物的传代显示能促进病毒在组织培养细胞中的适应性。因此，使病毒分离物在含胚母鸡鸡蛋中根据标准技术预生长是可取的。例如，所述病毒注射入尿囊腔或通过9-12天龄的含胚鸡蛋的羊膜，并且使其扩增约三天。然后收集尿囊液或羊膜液，收集的材料可以适合的MOI在组织培养中生长，用于疫苗生产。或者，收集的材料可直接用于有限稀释克隆。已发现，通过羊膜的鸡蛋接种能浓集可复制的病毒，并且在Veix)细胞中生长时可以产生高水平的HA蛋白。B.M0I本文鉴定出低MOI产生较好和/或较高效价病毒分离物。不受具体理论的限制，人们相信低的MOI减少缺陷病毒颗粒的量，并且产生更有效的感 染过程。在一些实施方式中，所用的MOI小于0.01(每100个细胞I个病毒)。在其他实施方式中，MOI小于0.003。在一些实施方式中，MOI小于0. 001。MOI可选择在约3至4天中产生高效价病毒和/或裂解细胞的最低MOI。III.疫苗生产一旦从适于组织培养的病毒得到所需的分离物，则病毒可用于生产疫苗。已知很多类型的病毒疫苗，包括但不限于减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和片段疫苗。A.减毒病毒生产方法减毒疫苗是已经减毒或改变而不再引起疾病的活的病毒疫苗。这些可通过多种方法生产，例如，在组织培养中生长，重复传代，并且遗传操作突变或去除涉及致病的基因。适于组织培养的分离物可用于用标准方法生产减毒病毒。例如，一个病毒基因和/或蛋白经鉴定涉及致病或涉及疾病表现，则其可被突变或改变以便所述病毒仍能在细胞内感染和复制，但不引起疾病。一个这样的实例是诱变HA1/HA2切割位点。所述适于组织培养的病毒可用任何标准方法减毒，例如，冷适应病毒。减毒病毒生产之后，可用标准方法制备疫苗(如，本文的方法)。可用标准方法纯化病毒，例如，用尺寸排阻层析。可用标准佐剂和疫苗制剂制备疫苗，如ISC0M、纳米珠、矿物油、植物油、氢氧化铝、皂甙、非离子去污剂、角鲨烯和嵌段共聚物，可单独使用或作为辅助剂组合使用。目前美国和欧洲市售的疫苗不含任何佐剂(活疫苗和死疫苗)，这是疫苗中需要如此高浓度的HA (每病毒株15 ii g的HA，三价配方含45 ii g的HA)的部分原因。B.灭活、亚单位和片段病毒疫苗生产方法一旦得到所需病毒，可将其用于生产免疫原性组合物，例如，疫苗。“死”疫苗的实例是灭活、片段和亚单位疫苗。这些可用标准方法制备以治疗流感。例如，亚单位疫苗一般涉及仅分离激活免疫系统的病毒部分。在有流感的情况下，用纯化HA和NA制备亚单位疫苗，但病毒蛋白的任何混合物可用于生产亚单位疫苗。一般来说，病毒蛋白(如HA)从重组病毒形式中提取，并且亚单位疫苗经配制含有来自WHO推荐的病毒株的这些病毒蛋白的混合物。例如，1995-1996年的疫苗含有来自两种A株和一种B株(A/Singapore/6/86 (HlNl) ；A/Johannesburg/33/94(H3N2);和 B/Beijing/84/93)的 HA和NA。对于H3N8CIV来说，可用H3和/或N8抗原。一般来说，病毒蛋白从病毒中提取，并且亚单位疫苗经配制含有这些病毒蛋白的混合物。蛋白可用标准方法从适于组织培养的分离物中分离用于亚单位疫苗。或者，蛋白可用重组技术生产。本领域已知生产具体蛋白的技术。片段疫苗一般涉及用去污剂处理包膜病毒，以使其中的蛋白溶解。在流感病毒的情况下，HA和NA溶解。例如，可用非离子去污剂如Triton X-100生产片段疫苗。灭活病毒疫苗通过灭活收获的病毒并用已知方法配制来制备，以用作诱发哺乳动物免疫反应的疫苗。灭活步骤、亚单位纯化和/或片段可在尺寸排阻纯化病毒之前或之后进行。例如，灭活疫苗的生产可涉及去除细胞材料、灭活病毒、纯化和溶解病毒包膜。其他实施方式可涉及病毒纯化，然后灭活，例如，用甲醛。一旦制备，任何疫苗(如，减毒、片段或灭活)可被检测以确定所述病毒和/或疫苗保持相似的抗原性，在哺乳动物中产生血清学反应，和/或提供对抗 哺乳动物疾病的保护。C.收获病毒的进一步加工I.收获病毒的净化收获后和/或灭活收获的病毒后，可以通过例如，沉淀去除微载体并通过渗滤浓缩上清液去除细胞材料和其他干扰材料。在组织培养细胞中生长的流感将含有宿主细胞蛋白。可能需要上清液的一些进一步净化。细胞DNA可通过酶处理(如，Benzonase)去除。在最初去除干扰材料之后，病毒可用标准方法灭活。或者，可在通过，如尺寸排阻层析进一步纯化后进行灭活。2.病毒灭活流感病毒可以任何方法和用任何试剂灭活。灭活方法对本发明不重要。灭活可发生在污染或干扰材料去除之后。灭活可包括使用任何已知灭活剂。这些灭活剂包括但不限于UV照射、甲醛、戊二醛、二乙烯亚胺(BEI)和￠-丙内酯。在一些实施方式中，用BEI是因为已知其破坏病毒核酸而不破坏病毒蛋白。此外，BEI不受蛋白含量和温度的影响。灭活剂以高至足以灭活溶液中每个病毒颗粒的浓度使用。例如，BEI可以约0. 5和IOmM之间的终浓度使用，包括但不限于1. 5、3、4、5和6mM，并且包括约I至6和I至3mM的范围。在一实施方式中，BEI以约6mM的浓度使用。BEI通常以约I. 5mM的浓度使用并且在37°C下孵育48小时。在CIV的疫苗制备中，BEI可以约0. 5和IOmM之间，通常为4至8mM，经常为5和7mM之间的终浓度使用。在一个实施方式中，BEI以约6mM的浓度使用。在一些实施方式中，灭活在对灭活剂适合的PH和温度下发生。可选择pH和温度以保证得到的灭活病毒仍然有免疫原性。灭活可在适当的搅拌下进行以保证所述试剂与溶液中所有的病毒颗粒相接触。灭活后，可用以下方法去除灭活剂，该方法包括但不限于，灭活剂的灭活、灭活剂的沉淀、灭活剂的过滤，以及层析，或这些方法的混合。例如，BEI可通过加入硫代硫酸钠灭活。残留的BEI也可通过尺寸排阻方法从病毒/病毒蛋白分离。一旦确定无害(缺乏活病毒)，病毒溶液可进一步加工以生产疫苗。3.进一步加工可进一步加工病毒溶液，例如，以去除污染物，进一步浓缩病毒，以提供较强的免疫反应。进一步加工的一些实例包括用标准方法最初去除细胞材料、去除细胞DNA、浓缩和在佐剂中配制。在组织培养细胞中生长的流感含有宿主细胞蛋白。例如，在人胚胎肾细胞(HEK)中繁殖的流感将含有HEK蛋白，或如果在MDBK或VERO细胞中生长，则分别含有牛或猴蛋白。这些蛋白可用本领域的技术人员已知的方法检测。已知很多去除DNA的方法，包括加入各种已知降解细胞DNA的DNA酶,例如，Benzonase。可进行起始浓缩步骤以提供最适于进一步层析纯化的浓度的病毒溶液。这可用任何标准方法进行，包括但不限于用分子量截留为约IOOK的膜(如MWCO为IOOK的聚砜膜)进行超滤。病毒溶液可浓缩至约100倍，包括但不限于90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍和5倍。在一些实施方式中，病毒溶液浓缩至约50倍，但更通常包括20倍和30倍。4.纯化可用标准方法如密度离心纯化病毒。在一些实施方式中，病毒通过尺寸排阻凝胶层析纯化。使用尺寸排阻的一个优点是产率优于用密度离心纯化。可用得到病毒纯化的任何尺寸排阻凝胶。可用任何标准凝胶，如琼脂糖凝胶(如Seph arose CL-2B)。在一些实施方式中，柱子长度为约70至120cm以得到所需纯化，包括但不限于约80、90、100和110。在其他实施方式中，柱子长度为约80至100cm，例如柱子长度为约90cm。在一些实施方式中，用多个柱子串联可得到所述长度，如两个45cm的柱子或3个30cm的柱子(如，长度为30-32cm，直径为30cm的柱子)。浓缩的病毒可用标准方法上柱，如，所述病毒可以5-10%的柱体积(CV)，通常5-7% CV上柱。然后可以从柱子上收集病毒峰，用标准方法(例如，超滤)进一步浓缩。在一些实施方式中，用总长度为90cm的2至3个柱子串联，聚集最终峰，用超滤浓缩。5.包膜蛋白溶解浓缩的病毒峰材料可用标准方法溶解，如用非离子去污剂。可以进行溶解以制备ISCOM配方的材料(见下文)。非离子去污剂的实例包括但不限于壬酰-N-甲基葡萄糖酰胺(Nonanoyl-N-Methylfucamide) (Mega 9)、Triton X-100、辛基葡萄糖苷、毛地黄阜苷、C12E8、Lubrol、Nonidet P-40 和 Tween (如 Tween 20、80 或 120)。溶解后，病毒可用于生产疫苗，和/或可加入佐剂。例如，对于ISCOM佐剂生产，可加入脂质混合物，以有助于ISCOM形成。所述脂质混合物可包括磷脂酰胆碱和合成胆固醇。在一些实施方式中，所述病毒在室温下边搅拌边用Mega 9破坏，然后可加入脂质混合物(磷脂酰胆碱和胆固醇)，并继续搅拌。6.佐剂形成疫苗和/或药物组合物中可加入适合的佐剂。佐剂的实例包括含有油和水的乳液的那些，以及还包含氢氧化铝的那些。在后一种情况下，可使用市售的氢氧化铝，例如，Alhydrogel, (Superfos Biosector, Frederikssund, Denmark)和 Rehydrogel(ReheisInc.)。油和水的乳液通常包含矿物油或可代谢的油(如，植物油、鱼油)。非离子去污剂或表面活性剂可用作乳化剂。乳化剂的实例包括Tween 80/Span 80、Arlecel 80/Tween 80和Montanides (Seppic, Paris, France)。在佐剂乳液的情况下，一般5-25%的体积是油，75-95%的体积是水。在一些实施方式中，佐剂乳液为20%体积的油和80%体积的水。氢氧化铝的量一般为水相的约5%和15%之间。在一些实施方式中，Emunade 是佐剂。对于一些实施方式，ISCOM用作辅助剂。ISCOM是免疫刺激复合物的首字母缩合词，Morein等人(Nature 308 :457-460 (1984))描述了该技术。ISCOM是新型疫苗递送系统并且与传统佐剂技术不同。ISCOM可方便地以两种方式中的一种形成。在一些实施方式中，抗原在其配制期间物理上并入结构中。在其他实施方式中，ISCOM-基质(例如，通过Isconova提供)不含抗原，但通过终端使用者在免疫之前与选择的抗原混合。在混合后，抗原在溶液中与ISCOM-基质一起存在，但在物理上不并入结构中。一般来说，在ISCOM中，纯化抗原基于在关键浓度下Quil A自发形成胶束，并通过疏水/亲水键捕获纯化的免疫原的能力以多聚体形式存在。这些胶束结构大小为35nm并很容易被免疫系统识别。与传统的储存辅助剂不同，ISCOM很快从注射部位清除和引出局部、体液和细胞介导的免疫反应。在具体的实施方式中，ISCOM如下形成。所述病毒用标准方法溶解，如用非离子去污剂(如Mega-9、Triton X-100、辛基葡萄糖苷、毛地黄皂苷、NonidetP-40、C12E8, Lubrol, Tween-80)。加入脂质混合物以有助于ISCOM形成。所述脂质混合物可包括磷脂酰胆碱和合成胆固醇。在一些实施方式中，所述混合物首先在室温下边搅拌边用非离子去污剂处理，然后可加入脂质混合物(例如，等份数的磷脂酰胆碱和胆固醇)，并继续搅拌。将Quil A(皂苷的纯化糖苷)加至病毒脂质混合物中并 继续搅拌。可加入所述Quil A得到最终浓度为约0. 01至0. 1%的Quil A，包括但不限于0. 02,0. 03,0. 04,0. 05、
0.06、0. 07、0. 08和0. 09的Quil A。在一些实施方式中，所述最终浓度为约0. 05%。去除所述非离子去污剂(例如，通过与醋酸铵渗滤)。ISCOM的基质通过Quil A形成。通过电子显微镜观察，ISCOM粒子的形态学显示典型的笼状结构，大小为约35nm。ISCOM形成时期可用切向流渗滤精简。ISCOM显示了基于Quil A在关键浓度下自发形成胶束和通过捕获纯化抗原的疏水/亲水键的能力呈多聚体形式的纯化抗原。ISCOM的形成可通过电子显微镜证实其已形成的典型笼状结构而证实。ISCOM呈递的免疫反应显示至少比作为凝集膜蛋白胶束单独呈递的相似抗原负荷量的免疫反应好十倍。还发现ISCOM能诱发细胞介导的反应，这在用传统的整个病毒疫苗时未发现。在一些实施方式中，最终浓度为约0.05%。也可在疫苗和/或药物组合物中加入免疫刺激剂。免疫刺激剂包括单独使用或组合使用的细胞因子；生长因子；趋化因子；来自淋巴细胞、单核细胞或来自淋巴器官的细胞的细胞培养上清液；植物的细胞制剂和/或提取物；细菌、寄生虫的细胞制剂和/或提取物；或促细胞分裂剂，以及从其他病毒和/或其他来源(如双链RNA、CpG)得到的新型核酸；嵌段共聚物；纳米珠或本领域已知的其他化合物。佐剂和其他免疫刺激剂的具体实例包括但不限于溶血卵磷脂；葡萄糖苷(如皂苷和皂苷衍生物，如Quil A或GPI-0100);阳离子表面活性剂(如DDA);季铵烃基卤化物(quaternary hydr°C arbon ammonium halogenides);复合多兀醇；聚阴离子和多原子离子；聚丙烯酸，非离子嵌段聚合物(如Pluronic F-127);和MDP (如，N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1' -2，-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺)。D.疫苗效力本领域熟知测定亚单位、减毒、片段和/或灭活病毒疫苗是否与临床分离物或从其中得到的适于组织培养的分离物的病毒维持相似抗原性的方法。这些已知方法包括抗血清或抗体、HA和NA活性和抑制以及DNA筛选(如探针杂交或PCR)的应用，以证实编码抗原决定簇的供者基因在灭活病毒中存在。本领域也熟知鉴别疫苗是否诱导血清学反应的方法，其包括用疫苗免疫待测动物，然后接种致病病毒，并鉴别疾病症状存在还是不存在。因此，流感疫苗效力可在动物中检测，通常用白鼬、小鼠和豚鼠。可用血细胞凝集抑制(HI)或神经氨酸酶抑制(NI)方法检测抗体效价，或检测组织培养物中的病毒中和抗体(微中和检测)，这些方法一般均已知。挑战性研究可提供评估疫苗的重要信息。适合治疗的药物组合物和/或疫苗包括病毒或病毒亚单位与无菌水性或非水性溶液混合物。生产药物组合物和/或疫苗的方法可包括分离适于组织培养的分离物，生长和纯化病毒分离物，灭活和/或减毒病毒并以适合的效价与生理上可接受的稀释剂和免疫刺激剂混合。或者，病毒蛋白可经纯化以用于亚单位疫苗，并以适量与生理上可接受的稀释剂和免疫刺激剂混合。可纯化足够的病毒，以使得没有可干扰灭活步骤和/或病毒的免疫原性的污染材料或物质。适合效价的病毒或适合浓度的病毒蛋白可与稀释剂和免疫刺激剂混合。TCID5tl测量是一种测量病毒效价的方法(感染50%组织培养物剂量)。例如， 可用约IO5至IO12的TCID5tl(基于预灭活效价)的效价，包括但不限于106、107、108、IO9UOltl和IO110任选所述效价可用HA效价分析，并在疫苗中每个病毒可包含约I至30 y g的HA，包括但不限于用于佐剂制剂的I至IOii g和用于非佐剂疫苗的I至30ii g。在一些实施方式中，效价为约15ii g。因此，例如，当未加佐剂疫苗中包括3种病毒时，I个成人剂量含有45ii gHA(3种病毒株，每一种15ug)的等同物。在其他实施方式中，每株的量可不同(例如，取决于抗原性)，但最终浓度为约 I 至约 60ii g HA，包括 2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 和 55 y g。在另一个实施方式中，预期佐剂疫苗含有的HA量为约I至30 ii g，包括2、5、10和20 u g。疫苗的体积通常为约50ii I和5000 u I之间，包括100、500、1000、2000和5000 U I。可用生理上可接受的标准稀释剂，例如，EMEM、Hanks平衡盐溶液和磷酸盐缓冲液(PBS)和生理盐水。疫苗和/或药物组合物中可加入适合的免疫刺激佐剂。免疫刺激佐剂的实例包括但不限于单独使用或组合使用的矿物油、植物油、氢氧化铝、皂苷、非离子去污剂、角鲨烯、嵌段共聚物、纳米珠、ISCOM, ISCOM基质或本领域已知的其他化合物。除了佐剂外，药物组合物中也可包括可用于抗流感的任何适合的抗病毒剂。这些抗病毒剂包括例如，金刚乙胺(rimantadine)、金刚烧胺(amantadine)、神经氨酸酶抑制剂(如zanamivir和oseltamivir)、y干扰素、胍、轻基苯并咪唑、干扰素a、干扰素0、缩氨基硫服(thiosemicarbarzones)、美替沙腙(methisazone)、利福平(rifampin)、利巴韦林(ribavirin)、卩密唳或嘌呤类似物和磷甲酸钠(foscarnet)。含有多于一种病毒或病毒蛋白株的疫苗可用本发明的方法生产。混合物可免疫原性滴定以提供适当的等同免疫性。免疫原性滴定意指生产的最终产物平分免疫性的不同。例如,如果制备A株和B株混合物，且A株有5倍的免疫原性，则混合株的比例为A株B株为I : 5。IV.疫苗给药疫苗组合物和/或药物组合物的给药可用于预防性目的。当预防性提供时，组合物在任何流感病毒感染症状明显出现之前提供。组合物的预防性给药用于预防或减弱任何后续感染。药物组合物和/或疫苗可以本领域已知的任何方式给药，包括通过吸入、鼻内(例如用减毒疫苗)、口服或胃肠外给药。胃肠外途径给药的实例包括皮内、肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下。在一些实施方式中，疫苗经上臂肌肉内或深层皮下注射给药。对于之前没有接种或没有接触流感(未致敏)的一些儿童来说，第二剂量可间隔2至4周给药。一或多个加强剂疫苗可在最初免疫之后的适合的时间给药。给药有效量的疫苗和/或药物组合物。有效量是足以取得诸如诱导足够体液或细胞免疫等所需生物学效应的量。这可能取决于疫苗类型、接受者的年龄、性别、健康状况和体重。所需生物效应的实例包括但不限于无症状产生、症状减轻、组织或鼻内分泌物的病毒效价减少、完全防止流感病毒感染和部分防止流感病毒感染。在一些实施方式中，免疫学上有效量的CIV疫苗为每剂量约100HAU至约1500HAU。组合物通常为每剂量250至750HAU之间。在一个实施方式中，疫苗组合物包括每剂量约500HAU。
当以溶液给药时，所述疫苗可以水溶液、糖浆、酏剂或酊剂的形式制备。这些制剂在本领域已知，并且通过将抗原和其他适合的添加剂溶于适合的溶剂系统中来制备。这些溶剂包括例如，水、盐水、乙醇、乙二醇、甘油和Al液。适合的添加剂包括经鉴定的染料、香料、甜味剂和抗微生物的防腐剂，如硫萊撒(thimerosal)(乙基萊硫代水杨酸纳)。这些溶液可用标准方法稳定，例如，通过加入部分水解的明胶、山梨醇或细胞培养基，并可用标准方法缓冲，用诸如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾的试剂。液体制剂也可包括悬浮液和乳液。悬浮液的制备(例如)用胶体磨，乳液的制备(例如)用匀浆器。V.病毒株和WHO为了有时间生产足够疫苗原液，必须在流感季节来临之前决定好对于今年的疫苗(冬季用)来说用流感A株和B株的哪一种。有一个世界性的精巧而复杂的流行病学监控系统来帮助这些决定。此外，WHO通常制备用于生产疫苗的种子病毒。有16种已知HA亚型和9种已知NA亚型。HA和NA蛋白的多种不同组合是可能的。目前仅有一些流感A亚型(即H1N1、H1N2和H3N2)在人群中普遍流行。其他亚型在其他动物种中最常见。例如，在马中致病的H7N7和H3N8病毒，最近显示H3N8也在狗中致病。已知感染鸟类和人类的禽流感A病毒三种显著亚型为流感A H5-H5感染，如，HPAIH5N1病毒、流感A H7和流感A H9。然而，感染人类并引起流行或大流行的下一批病毒株可来自任何亚型。可用标准方法得到病毒,例如，从患者样本、美国菌种保藏中心(the AmericanType Culture Collection)(或其他保藏中心)，或从研究病毒的其他特定实验室得到。在一些实施方式中，病毒从WHO或⑶C得到，包括季节性病毒和可能的大流行株。VI.血清学反应的检测本领域也熟知鉴别疫苗是否诱导血清学反应的方法。例如，可将免疫原性化合物/疫苗注射入测试动物，并在血清中鉴定抗病毒抗体。本领域熟知鉴别疫苗是否有保护性的方法，该方法包括用疫苗免疫测试动物，然后用致病病毒接种，并鉴别疾病症状存在还是不存在。可进行血细胞凝集抑制试验以鉴别对血细胞凝集素的血清学反应的存在。可在所有测试血清样品上用火鸡红细胞(RBC)进行血细胞凝集抑制(HAI)测定，例如，通过用已知流感亚型如CIV(H3N8)。简言之，在V形底的96孔微滴定板中的PBS中进行测试血清的两倍系列稀释。将含有4-8HAU/50 ill CIV的等体积病毒悬浮液加入到含有测试血清的各孔中，并该板在室温下孵育30分钟。然后加入等体积的0.5%的火鸡RBC悬浮液。然后将该板在室温下孵育30分钟并读取HAI结果。显示HA抑制的血清最高稀释倍数的倒数被认为是测试样品的HAI效价。测定抗流感病毒抗体存在的其他方法包括神经氨酸酶抑制测试、Western印迹、ELISA、PCR和鉴别流感病毒抗体的其他方法。这些测定是本领域已知的。
Vl I.实施例如下实施例提供制备用于生产主要种子的均匀病毒群的流感病毒分离、适应和纯化步骤。这些实施例使用Veix)细胞(关国菌种保藏中心，CCL81)，但可用流感病毒适用的任何细胞类型。 实施例I :化学试剂和牛物试剂所用感染培养基含有IL DMEM(Cambrex,目录号04-096)或等同物，贮存在2-7V;20mL L-谷氨酰胺(Cellgro，目录号25-005-CV)或等同物，贮存在_10°C或更低温度，一旦融解，其可贮存在2-7°C多达4周；以及IX型胰蛋白酶(Sigma产品号T0303，CASNo. 9002-07-7)或等同物，分装并冷冻贮存在_5至_30°C。在感染细胞之前新配制感染培养基。细胞培养基制备如下1L DMEM、20mL L-谷氨酰胺、50mL胎牛血清(Gibco目录号04-4000DK)或等同物(注意来自无BSE的国家)。完全培养基制备后在2_7°C下贮存不多于30天。用于传代细胞的EDTA-胰蛋白酶(Cellgro目录号98-102-CV或等同物)贮存在_5至-30 0C，由制造商指示有效日期。实施例2 :细胞培养物制备因为用于病毒感染步骤的蛋白酶稀释可根据批次变化，在使用之前滴定新的胰蛋白酶批次以建立最适水平。滴定的实施例是在含有L-谷氨酰胺的DMEM中系列稀释IX型胰蛋白酶，用半对数稀释用含有新鲜汇合单层Veix)细胞的96孔板，用280 y L的PBS将板的每个孔洗涤2次。洗涤后立即按行加入200 u L每个稀释倍数的IX型胰蛋白酶至板中。然后将所述板在37°C加或减2°C下在5% CO2中孵育，并在4天后观察细胞。选择那些显示对细胞健康状况没有或很少影响的胰蛋白酶的最低稀释倍数作为胰蛋白酶的适合浓度，以用于流感感染的分离和优化。令人满意和常见的是每个浓度内接种的孔之间很少或没有变化。对于在Veix)细胞中的病毒有限稀释克隆来说，用单层细胞汇合，通常为3-4天龄的细胞；在96孔Falcon微测定板中生长。所述细胞源自ATCCCCL 81并用第132和156代之间的细胞。Vero细胞从液氮(LN2)中如下制备从LN2中取出I安瓿Vero细胞并在36°C加或减2°C下水浴融解。将小瓶中的全部内容移至25cm2含有补充10%胎牛血清的IOmL细胞培养基的组织培养瓶中。该瓶在36°C加或减2°C下，在4-6%0)2中孵育。I小时后轻轻取出上清液和未附着的细胞，并加入IOmL新鲜组织培养基。细胞在36°C加或减2°C下，在4-6% CO2中孵育直至达到90-100%的汇合。Vero细胞传代如下用10_20mL PBS将单层细胞洗涤约3分钟。轻轻倒出PBS并换成3mL EDTA-胰蛋白酶(Cellgro，目录号98-102-CV)，将单层细胞孵育约3分钟或直至细胞从瓶中脱离。加入17mL制备的生长培养基(含有FBS)稀释悬浮液，以稀释并中和胰蛋白酶。然后用血细胞计数器进行细胞计数，测定每mL悬浮液中的细胞数。瓶的数量可通过如下计算的悬浮液准备每mL细胞数(悬浮液)X所需悬浮液的mL数=每个容器的板的mL数。每mL细胞数(所需)计算悬浮液mL数的总和，悬浮液总mL数必须少于可用的体积。如果不是如此，则铺板细胞密度调节至适应这个情况，然而，应当注意，铺板时细胞密度较低时细胞汇合的时间长度将比较长。容器通常以细胞密度为每mL IX IO4至IX IO5个细胞的细胞悬浮液铺板。细胞孵育3-4天或直至汇合。这些维持和繁殖Veix)细胞的技术可相似地 应用于所用的其他细胞系，如马-达氏犬肾(MDCK)和 HEK 293。克隆尤其适于繁殖病毒分离物的HEK 293细胞。这种HEK 293亚克隆称为GT-D22(或 D22)，从最初的 HEK 293 细胞(ATCC 号 CRL-1573 ;ATCC 批号 F-11285，第 33 代)制剂中分离。亚克隆HEK 293细胞，并根据携带有表达p53基因的5型重组腺病毒的改进产率选择。对有正常形态和足够的生长率的克隆进行胰蛋白酶消化，并以每孔1-2X106个细胞接种以用于进一步分析。最能产生克隆的克隆经受进一步亚克隆和选择。最后选择D22亚克隆。D22亚克隆繁殖流感的能力已用猪流感病毒(SIV)证实。当研究活的流感病毒时，采取生物安全预防措施。流感是2级病原微生物，并应该遵守 CDC-NIH, HS 出版号(CDC) 88-8395 (Biosafety in Microbiological and BiomedicalLaboratories)中对在实验室中操作病毒的建议。实施例3 :有限稀释克隆有限稀释克隆的稀释管准备和样品稀释如下。在试管架上设置测试管(12X75mm)并贴上标签。每板检测一个样品，每个样品的稀释系列为KT1至10,。稀释培养基用血清移液器以I. SmL的量分装至每个测试管。第一个试管标为病毒鉴别。其他几个试管准备用作稀释对照，并在稀释期间有误差发生的情况下替换。将样品震荡混合约5秒，然后将200 y L样品移至KT1稀释管制备起始稀释物。继续系列稀释至10_1(1。对于每个稀释，样品震荡混合并在稀释物之间更换移液器吸头。稀释物如下转入细胞平板中。在使用之前即时从细胞平板中按无菌操作倒出培养基。用12道移液器用280 y L无菌PBS将每个孔清洗2-3次。将平板无菌倒空，但不能干涸。将平板标上病毒鉴别、日期和稀释方案。每个稀释物在加至平板之前都短暂震荡。用监控的Finnpipette或其它合适的移液器和1000 u L吸头，将每孔200 U L样品接种至平板的一行。根据病毒浓度加样。首先，将2行稀释对照加入平板，然后是最高稀释的病毒(10_1(1)，接着是余下的样品。从10_1(1至KT1连续加样。实施例4 :病毒制剂收获病毒并如下评估CPE。孵育4天后，用显微镜检查读取致细胞病变效应(CPE)。用细胞碎片的存在、死细胞和缺乏活性的细胞的出现来鉴定CPE，因为它们是流感病毒的典型现象。偶尔会在起始病毒稀释物中观察到非特异性干扰，因此检查数个稀释物的CPE很重要。当评估CPE时，检查显示CPE的最高倍稀释物的孔中CPE程度很重要。通过选择呈现CPE的最高倍样品稀释物的孔来达成取得最高水平的成功，但在这些孔中，优选呈现最小程度的CPE的那些孔。一旦被选择，通过用单道IOOOil L移液器吸出液体来收集所述孔中的内容物。通常重复吸出液体，以去除在孔底松散附着的细胞，并帮助打散悬浮液中的细胞或病毒块。然后用收集的液体进行下一轮或几轮的有限稀释克隆，或有时用于接种新鲜单层细胞以生产克隆后种子。一般来说立即连续地进行2至3轮有限稀释克隆以产生均一的病毒群。过程中每一步都分析HA效价，结果显示在表I中。A/Indonesia/05/2005 (IND0H5N1)、A/Vietnam/1203/04 (VNH5N1)、A/NewCaledonia/20/99 (A/NC/20/99 (R))和 A/Wisconsin/67/05 (A/Wis/67/05R)是由 CDC 提供的重配流感病毒。对于重配病毒，编码表面糖蛋白HA和NA的基因来自流感株(IND0H5N1、VNH5N1、A/New Caledonia/20/99 和 A/Wis/67/05)，而其余的内部基固来自 A/PR/8/34。有限稀释克隆也适用于野生型(未进行PR8重配)流感株A/New Caledonia/20/99 (A/NC/20/99)、A/Wisconsin/67/05 (A/Wis/67/05)和 B/Malaysis/2506/04。病毒通过反向遗传技术产生并在含鸡胚的鸡蛋中传代。鸡蛋材料直接用于在Ve ro细胞中的有限稀释克隆(用于HA效价的步骤显示在实施例5中)。表I
有限稀释克隆(LDC)之前，之后的HA效价 ____
流感株起始材LDC之第二次笫三次滚动生物反_料“ 前… LDC后 LDC后瓶_应器
IndoHSNl_ 20,4801601,2802,560 5,120 7,680
VNHSNl_ 2560<406401,280 5,120 7,680
A/NC/20/995，6006401,280———_____
A/NC/20/99(R) 10,2401,2801,280------ 2,560 10,240
AAVis/67/05(H3) 2,5606401,280.........-.......
AAVis/67/05(H3R) 7,6806401,280------ 2，S60 5,120
B/Malaysia/2506/04 2,560 <40 640 ------ ------ 15，120* HA效价表示为单位/mL。〃⑶C提供的卵胚材料的HA效价。⑶C提供的用卵胚材料直接感染的Veix)细胞的HA效价。如上表I所不,细胞培养系统能产生与蛋中产生的病毒效价同样高的病毒效价。另外，最初在Vero细胞上显示不可检测的生长的病毒株VNH5N1和B/Malaysia/2506/04可通过有限稀释克隆而适于Vero细胞上生长。有限稀释克隆之前VNH5N1和B/Malaysia/2506/04在鸡蛋羊膜上的繁殖增强了这些病毒在Vero细胞上生长的适应性。用SRID(单向辐射免疫扩散)定量血细胞凝集素，在浓缩的Veix)细胞培养基中的B/Malaysia/2506/04得到多达132 u g/mL的血细胞凝集素蛋白。产率(每mL培养物的HAyg数)较公布的用Veix)细胞的已知方法高10倍。目前，一个人疫苗的剂量相当于约15 u g/病毒株。因此，可从ImL浓缩的Vero细胞培养基中得到约8_9个剂量。实施例5:流感通过羊膜传代增强病毒在组织培养细胞上生长的能力从⑶C收到流感病毒VNH5N1-PR8/⑶C-RG。这是一种重配病毒，由在PR8病毒骨架上的禽H5N1流感病毒越南株H5和NI基因组成。这种病毒在通过尿囊腔接种的11天龄含胚鸡蛋中扩增。接种后2-3天收集尿囊液，病毒产率为256 0血细胞凝集素单位(HAU)/ml。在含有I. 25ii g/mlIX型胰蛋白酶的5mL DMEM中稀释尿囊液( 200 yl)，并使得汇合单层Vero细胞(ATCC CCL号81，第147代)在36±2°C下吸收60分钟。将含有
I.25ii g/mlIX型胰蛋白酶的25mL DMEM加入培养物中，孵育3天，收集培养上清液。在收集的液体中没有可检测的血细胞凝集素活性。将含病毒的尿囊液以I : 10，000稀释，将100 ill接种至11天龄的含胚鸡蛋的尿囊腔和羊膜上。将鸡蛋在约39°C下孵育三天，分别收集尿囊和羊膜液。Vero细胞(第132至152代)在含5%胎牛血清的DMEM中以IX IO4至IX IO5个细胞/1111、200111/孔接种至96孔板，并在36±21、3-5% CO2下孵育3-4天(直至汇合)。在尿囊液或羊膜液中的VNH5N1病毒在含有1.25iig/ml IX型胰蛋白酶的DMEM中以KT1至10,系列稀释。从Vero细胞去除培养基，用280 Ul的磷酸盐缓冲液清洗每个孔，然后将200 ill的每种病毒稀释物接种至8个重复的孔中。平板在36±2°C，3-5% CO2下孵育4天。与尿囊来源病毒的10_7稀释相比，羊膜来源的病毒的致细胞病变效应高达10_9稀释，其可证实羊膜液导致在Veix)细胞上生长的病毒效价更高(见表2)。收获来自显示致细胞病变相应的最高稀释倍数的孔的病毒，通过第二次有限稀释进行克隆。再一次，与尿囊来源病毒所见相比，羊膜液来源的病毒显示了在较高稀释倍数下的致细胞病变效应(病毒约多10倍)。表2有限稀释传代I尿囊液病毒丨稀释致细胞病变效应(+出现)
ICT10 ~I- I- I- I- I- I- I-~
ICT9- - - - - - - -~
ICT8- - - - - - - -~
ICT7+ + - + -- + +
IO"6+ ++ + + ++ +
IO"5+ ++ + + ++ +
IO'4+ ++ + + ++ +
权利要求
1.通过有限稀释克隆选择在组织培养细胞中生长的人流感病毒的方法，所述方法包括 a.将一定量的人流感病毒系列稀释，以获得一系列人流感病毒浓度递减的稀释物， b.使每一份系列稀释的人流感病毒与组织培养细胞接触； c.使在步骤b中进行了接触的所述人流感病毒生长足以产生致细胞病变效应(CPE)的一段时间； d.从接触了来自引起CPE的、系列稀释物中的最高倍稀释物的人流感病毒的组织培养细胞中收获步骤c中生长的人流感病毒；以及 e.用在步骤d中收获的一定量的人流感病毒重复所述a到d的步骤。
2.根据权利要求I的方法，还包括在的步骤b的接触之前将所述一定量的人流感病毒与有效量的胰蛋白酶混合。
3.根据权利要求2的方法，其中所述胰蛋白酶为IX型胰蛋白酶。
4.根据权利要求2的方法，其中所述步骤b的接触是在少于O.Ol的MOI下进行的。
5.根据权利要求I的方法，其中所述组织培养细胞为哺乳动物胚胎肾细胞。
6.根据权利要求5的方法，其中所述哺乳动物胚胎肾细胞为人胚胎肾细胞。
7.根据权利要求I的方法，其中所述的人流感病毒为A、B或C型流感病毒。
8.根据权利要求7的方法，其中所述人A型流感病毒为H5N1株。
9.根据权利要求I的方法，其中所述人流感病毒分离物最初在含胚鸡蛋中生长，以得到大量的人流感病毒。
10.根据权利要求I的方法，其中所述人流感病毒分离物最初在羊膜上生长，以得到大量的人流感病毒。
11.生产人流感病毒疫苗的方法，包括纯化根据权利要求I所述的收获的病毒。
12.根据权利要求11的方法，其中所述纯化步骤用尺寸排阻层析进行。
13.根据权利要求11的方法，还包括用有效灭活病毒的量的二乙烯亚胺(BEI)处理所述病毒。
14.根据权利要求5的方法，其中所述哺乳动物胚胎肾细胞为马-达氏牛肾(MDBK)细胞。
15.通过有限稀释克隆选择在组织培养细胞中生长的人流感病毒的方法，所述方法包括 a.将一定量的人流感病毒系列稀释获得一系列人流感病毒浓度递减的稀释物； b.将所述量的人流感病毒与有效量的IX型胰蛋白酶混合； c.使每一份系列稀释的人流感病毒与哺乳动物胚胎肾细胞接触； d.使在步骤C中进行了接触的所述人流感病毒生长足以产生致细胞病变效应(CPE)的一段时间； e.从哺乳动物胚胎肾细胞收获在步骤d中生长的人流感病毒，所述的哺乳动物胚胎肾细胞接触了来自引起CPE的、系列稀释物中的最高倍稀释物的人流感病毒； f.将在步骤e中收获的一定量的人流感病毒系列稀释获得一系列人流感病毒浓度递减的稀释物； g.将步骤e中收获的所述量的人流感病毒与有效量的IX型胰蛋白酶混合；h.使每ー份系列稀释的人流感病毒与哺乳动物胚胎肾细胞接触； i.使在步骤h中进行了接触的所述人流感病毒生长足以产生致细胞病变效应(CPE)的一段时间； j.从哺乳动物胚胎肾细胞收获在步骤i中生长的人流感病毒，所述的哺乳动物胚胎肾细胞接触了来自引起CPE的、系列稀释物中的最高倍稀释物的人流感病毒。
16.根据权利要求15的方法，其中所述哺乳动物胚胎肾细胞为人胚胎肾细胞。
17.根据权利要求16的方法，其中所述人A型流感病毒为H5N1株。
全文摘要
本发明涉及选择在组织培养细胞中生长的流感病毒以制备适于组织培养的病毒分离物的方法。本发明还涉及由所述分离物制备的疫苗。
文档编号A61K39/145GK102766606SQ20121025107
公开日2012年11月7日 申请日期2007年12月14日 优先权日2006年12月15日
发明者B·A·埃迪, O·Y·阿布德尔梅吉, P·高, T·L·沃斯梅恩 申请人:先灵-普劳有限公司