聚酰胺胺型树枝状大分子在制备抗耐药菌的药物中的应用的制作方法

专利名称：聚酰胺胺型树枝状大分子在制备抗耐药菌的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及高分子化合物的新用途，特别涉及聚酰胺胺型树枝状大分子在制备抗耐药菌的药物中的应用。
背景技术：
由于抗生素滥用导致的各种细菌耐药在全世界范围的蔓延愈演愈烈，许多原本可以治愈的感染性疾病，正在成为难以治愈的疾病。耐药细菌的感染导致患者死亡率增加，感染并发症增多，耐药致病菌感染所致疾病已成为全人类共同的灾难。当前细菌耐药已呈现出向多药耐药发展的趋势，一些细菌已经演变为难以控制的“超级细菌”。·
目前，主要有三大类耐药菌株威胁着人类。第一类是最常见的包括MRSA和耐万古霉素的VRSA。第二类是多药耐药(MDR)革兰氏阴性菌，这类细菌几乎可抵抗目前可用的所有抗生素种类，包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、多粘菌素类、四环素类、喹诺酮类、β -内酰胺类等。而且，针对革兰氏阴性菌的新抗生素研发更加困难，因为其外在的细胞壁可以阻挡大多数的药物，而其强大的外排能力又可将多余药物排出细胞。第三类则是多药耐药和广泛耐药的结核分枝杆菌(MDR-TB和XDR-TB)。这类耐药结核杆菌越来越成为发展中国家的严重威胁。MDR-TB的治疗需要长达2年的治疗疗程，且伴随有非常严重的副作用；XDR-TB的治疗则更为困难，且致死率很高。更为严峻的是能够抵抗所有抗生素的全耐药细菌(pan resistant bacteria)已经出现,一旦人类感染这类细菌,可能会面临无药可治的境地。面对多重耐药细菌日趋增多和迅速蔓延，以及感染后致死率继续攀高的严峻形势，如何有效控制多重耐药细菌感染造成的危害已经成为各国政府高度关注的焦点，寻找和研制有效控制多重耐药细菌感染的新策略和新药物，已成为当今世界各国科学家当务之急的研究目标。抗生素是治疗细菌感染最经典的药物，然而几乎所有抗生素在治疗细菌感染时都会不可避免地诱导细菌耐药。近半个世纪以来，抗生素研发策略仍局限于传统抗生素结构改造和修饰，新抗生素用于临床后细菌又会很快产生耐药，故新型抗生素的研制并不能从根本上解决细菌耐药问题。而且抗生素耐药菌株的出现速度已经远远超过了新抗生素研发的速度，临床有效的抗菌药物日趋减少。为了有效对抗日益严重的耐药细菌，必须突破传统思路，寻找具有新型结构且不诱导耐药的抗菌药物。聚酰胺-胺(polyamidoamine, PAMAM)是一种人工合成的纳米级大分子化合物，由于具有单分散性、内部空腔及表面丰富的可修饰基团等独特结构优势，PAMAM在生物医药领域，如基因药物载体、助溶剂、高效催化剂及纳米材料等方面，有非常广泛的应用和研究。PAMAM-NH2合成方法成熟，目前市售有Gl. 0-G10. O等数十种，随着代数的增加，PAMAM纳米尺寸、末端氨基数目、形状和结构特征也会随之变化。由于PAMAM-NH2的种类繁多，耐药菌的种类更是变化多样，究竟哪一种PAMAM-NH2具有显著的抗耐药菌活性？是否诱导细菌耐药？以及特定的PAMAM-NH2对哪些种类的耐药菌有活性？这些技术问题在现有技术中没有报道过。因此，针对PAMAM-NH2的抗菌活性研究对于新药开发而言显得尤为重要。

发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于通过大量试验对聚酰胺胺型树枝状大分子(PAMAM-NH2)进行体外活性研究，提供一种聚酰胺胺型树枝状大分子在制备抗耐药菌的药物中的新用途。本发明创造性地通过试验对Gl. 0-G4. O PAMAM-NH2进行体外活性研究，MIC结果表明Gl. 0-G4. O PAMAM-NH2体外抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、阴性菌的敏感和耐药菌株均有不同程度的抑制和杀灭作用，其中G2. O作用最强(MIC值为O. 78-12. 5 μ g/mL)，G3. O和G4. O次之(MIC 值为 I. 56-25 μ g/mL)，Gl. O 作用最弱(MIC 彡 50 μ g/mL) ;MBC 结果提示，G2. OPAMAM-NHji所测菌株的MBC是MIC值的2_4倍；生长曲线提示，PAMAM-NH2抗菌作用呈浓度依赖效应，且同等浓度下，G2. O抗菌作用最强；杀菌曲线提示，12 μ M G2. 0-G4. O PAMAM-NH2对ESBLs-EC和MRSA具有显著的杀菌活性，G2. O与ESBLs-EC作用2 h后活菌计数即接近零，MRSA作用6 h后活菌计数接近零，而60 μ M Gl. O未显示杀菌作用。另外，耐药性实验结果表明，与ATCC 29213共孵育连续培养15代后，G2. O、红霉素、苯唑西林和头孢他啶的MIC与第I代培养所测MIC的相对比值，分别是1、64、8和8 ;与ESBLs-EC共孵育连续培养15代后，G2. O、左氧氟沙星、氨苄西林和头孢他啶所测MIC与第I代培养所测MIC的相对比值，分别是1、64、32和8，提示ATCC 29213和ESBLs-EC不易对G2. O PAMAM-NH2产生耐药，而容易对抗生素产生耐药性。因此，根据上述研究结果，发明人提供了聚酰胺胺型树枝状大分子在制备抗耐药菌的药物中的应用，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2. 0-4. O代聚酰胺胺型树枝状大分子。优选地，所述耐药菌选自如下的一种或多种耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA、对万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌Mu50、产超广谱内酰胺酶的大肠杆菌ESBLs-EC及多重耐药的大肠杆菌MDR-EC。进一步优选地，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2. O代聚酰胺胺型树枝状大分 子。针对G1.0-G4. O PAMAM-NH2，本发明人通过以上试验做了系统的研究。结果表明，G2. 0-G4. O PAMAM-NH2对所检测17株中的15株菌具有显著的抗菌活性，而且不容易诱导耐药，与传统的抗生素相比，具有独特的抗菌优势，为临床上耐药菌的彻底杀灭增加了候选药物，丰富了现有技术。


图I为PAMAM-NH2对大肠杆菌MG1655生长曲线的影响曲线图；其中(A)在MG1655菌液中加入Gl. O PAMAM -NH2使其浓度分别为30、60或120 μ M ;在MG1655菌液中加入G2. OPAMAM -NH2 (B)，G3. O PAMAM -NH2 (0或64.0 PAMAM -NH2 (D)，使其浓度分别为 3、6 或 12μΜ.对照组加入同等体积的无菌水，每1-2 h检测受试菌液620 nm处吸光度值。图2为PAMAM-NH2对受试菌株生长曲线的影响曲线图；其中在大肠杆菌MG1655(A)或Mu50 (B)菌液中加入PAMAM-NH2使其浓度分别为12或60 μ Μ，对照组加入同等体积的无菌水。图3为PAMAM-NH2的杀菌曲线图；其中在ESBLs-EC (A)或MRSA (B)菌液中加入PAMAM -NH2使其浓度分别为12或60 μ Μ，对照组加入同等体积的无菌水，分别于培养O. 5、
1、2、4和6 h时取样涂布于琼脂平板，计算平板菌落数CFU。图4为G2.0 PAMAM-NH2S导细菌耐药性实验结果图；将受试菌株ESBLs-EC (A)或金黄色葡萄球菌ATCC29213 (B)在待测抗菌药物存在的情况下，连续培养15代，计算药物对第15代细菌的MIC值与第I代MIC值的相对比值。
具体实施例方式本发明创造性地通过试验对聚酰胺胺型树枝状大分子(PAMAM-NH2)进行体外活性研究，为PAMAM-NH2开发成新一代的临床抗菌药物奠定了基础。以下是Gl. 0-G4. O PAMAM-NH2体外抗菌活性的效果实施例。实施例I :G1. 0-G4. O PAMAM-NH2体外抗菌作用考察研究
I，材料和方法
1.1，实验菌株
11株标准菌株和6株耐药菌株(见表I)用于本部分实验。表I :试验所用的11株标准菌株和6株耐药菌株
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M-H肉汤培养基2. 5 g M-H肉汤干粉，加入125 μ L MgCl2溶液(含Mg2+IO mg/mL)和200 μ L CaCl2溶液(含Ca2+IO mg/mL),然后用去离子水定容至100 mL,高压灭菌121°C, 20
mirioM-H琼脂培养基3. 8 g M-H琼脂培养基干粉，加入100 mL蒸馏水混匀，静置静置10 min，待干粉完全溶解后，高压灭菌121°C，20 min。然后48 °C时铺M-H琼脂培养基平板。营养肉汤培养基1.9 g营养肉汤干粉，加入100 mL冷蒸懼水混勻,静置10 min,微火煮沸(隔石棉铁丝网或磁力加热搅拌器)，待干粉完全溶解后，高压灭菌121°C，20 min。
O. 5 麦氏比浊液:在 O. 18 mol/L H2SO4 (1%, v/v) 99. 5 mL 中加入 O. 048 mol/LBaCl2 (I. 175%, w/v) O. 5 mL，充分混匀后，其浊度即为O. 5麦氏比浊标准，相当于5X(IO7-IO8) CFU/mL。暗处避光保存，半年内使用，临用前应充分混匀。PBS缓冲液:准确称量KCl O. 2 g, KH2PO4 O. 24 g，NaCl 8. O g，Na2HP042H20 I. 56
g,加入100 mL去离子水充分溶解后，调pH到7. 4，定容100 mL后分装，高压灭菌121°C，20 min,即为O. IM PBS母液。将其用无菌水稀释10倍，即为O. OlM PBS溶液，现用现配。2，方法
2.1，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定
2.I. I，MIC测定方法
A.菌悬液制备取冻存于-20°C的待测菌株，划线接种于M-H琼脂平板，37°C孵箱中孵育过夜，次日用接种环挑取单克隆菌落，接种于3 mL营养肉汤中，37°C，220 r/min,增值至对数生长期后，用M-H肉汤将菌液稀释至O. 5麦氏比浊标准，约IX IO8 CFU/mL。然后用M-H肉汤将上述菌悬液I : 100稀释后备用。稀释后的菌液应在15 min内接种。抗菌药物的稀释及菌液接种将G3.0 PAMAM-LED209用无菌水稀释成400 Ug/mL，过滤除菌，分装备用。氨苄西林用O. 1M，pH 6. O的磷酸盐缓冲液稀释)，苯唑西林、环丙沙星用无菌去离子水，头孢他啶用无菌碳酸钠水溶液(无水碳酸钠是所用头孢他啶的10%)，左氧氟沙星用无菌去离子水(O. I M NaOH助溶)，分别稀释至1024 μ g/mL, - 20°C冰箱保存备用。加样取无菌96孔板非边缘的10行X6列=60孔，每行分别标记为“G3. OPAMAM-LED209、抗生素对照、不含药物的生长对照”。每孔分别加入100 μ L M-H肉汤，每行第I列孔中按照标记顺序依次加入100 μ L G3. O PAMAM-LED209、抗生素、M-H肉汤。用排枪充分混匀后，从每孔吸出100 UL加入到对应的第2孔中，依次类推，2倍倍比稀释至第10列，弃去最后吸出的100 μ L液体。然后每孔加入100 μ L上述制备的待测菌悬液使每孔最终菌液浓度为5 X IO5 CFU/mL。在96孔板的外周，加入200 μ L待测菌悬液(不含药物)作为无菌对照。注意应该同时取待测菌悬液在琼脂平板上传代培养，以检查菌液纯度。孵育和结果判断将接种好的96孔板微量振荡器上震荡I min，充分混匀后置于湿盒中，37°C孵箱中孵育16 20 h，对耐甲氧西林和耐万古霉素的葡萄球菌应持续孵育24
h。以肉眼观察清亮孔的最低药物浓度为此药物的MIC，同时应检查生长对照孔的细菌生长情况是否良好，无菌对照孔是否清亮，检查菌悬液的平板培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。此测定重复3次。2. I. 2，MBC 测定方法
MBC是指药物能使活菌生长减少99. 9%或以上的最小药物浓度，其测定方法是在MIC测定(如方法2. I. I所述)的基础上，从肉眼观察无菌生长的孔中取10 μ L接种于琼脂平板，作次代培养，37°C孵育24-48 h，活菌计数法计算平板菌落数，平均数小于5个的药物浓度·即为最低杀菌浓度。2.2，生长曲线的测定
用接种环挑取待测菌株生长于M-H琼脂平板上的单克隆菌落，接种于3 mL营养肉汤中，37°C，220 r/min,增值至对数生长期后，用M-H肉汤将菌液稀释至O. 5麦氏比浊标准，约I X IO8 CFU/mL,分装于5个无菌小锥形瓶中，分别标记为“药物高浓度组，中浓度组、低浓度组，氨苄西林组和无药物生长对照组”，每瓶2 mL菌液。然后每瓶对应加入待测药物和氨苄西林各2 mL，生长对照组加入2 mL无菌水，各管菌液的终浓度为5 X IO7 CFU/mL。37°C，220 r/min培养，每隔1-2 h从每瓶取100 μ L菌液测OD620值，18 h后终止实验，根据OD62tl平均值和对应时间点绘制浓度效应关系曲线。此测定重复3次。2.3，杀菌曲线的测定
准备待测菌悬液，用营养肉汤稀释至O. 5麦氏比浊标准备用。取无菌锥形瓶6个，分别标记为“G1. O、G2. O、G3. O、G4. O、氨苄西林和生长对照”，每瓶加入5 mL肉汤，再分别加入定量的待测药物，使其浓度为6MIC，生长对照组加入同等体积的无菌水。然后加入50 μ L待测菌悬液，每瓶菌液终浓度约为IO6 CFU/mL。37°C分别培养0、0. 5、1、2、4、6 h后，分别从每组取100 μ L均匀菌悬液，10倍比连续稀释10° IO7后，用三角形涂布棒接种于M-H琼脂平板(每组接种3份)，37°C孵育过夜做菌落计数，取菌落数在30-300之间的平板做菌落计数，计算每组平均值。原菌液中每毫升的活菌数CFU=菌落平均数X稀释倍数，根据平均CFU和对应时间绘制菌数时效关系曲线。2. 4，诱导耐药实验
按照2. I. I MIC测定方法测定药物对受试菌株的MIC值，用M-H肉汤稀释1/2MIC孔内的菌液，制备5 X IO5 CFU/mL菌悬液，然后按照同样的方法再次测定药物对受试菌株的MIC值，连续15天每天测定I次，计算待测药物对第15代培养细菌的MIC值与第I代培养细菌的MIC值的相对值。3，结果
结果经SPSS单因素方差分析和Student’ S t检验，P〈0. 05认为具有统计学差异。3. 1，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定
3.I. 1，质控菌株分别选用S. aureus ATCC 29213和疋coli ATCC 25922作为质控菌株，美国临床实验室标准协会(Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI)规定，苯唑西林、头孢他啶对ATCC 29213的MIC标准范围是O. 12-0. 5 μ g/mL,O. 5-2 μ g/mL,规定头孢他啶对ATCC25922的MIC标准范围是O. 06-0. 5 μ g/mL。本实验测得苯唑西林、头孢他啶对ATCC 292132的MIC值分别是O. 25 μ g/mL、2 μ g/mL，头孢他啶对ATCC25922的MIC值是O. 5 μ g/mL (见表2)，均符合各自标准范围，说明实验方法准确可靠。3. I. 2，PAMAM-NH2 对大肠杆菌的 MIC :共检测了 Gl. O、G2. O、G3. O 和 G4. O 对 3 株B. coli 敏感菌株(ATCC25922、EHEC 和 MG1655)和 2 株耐药菌株(包括 ESBLs-EC ATCC35218和多药耐药的临床分离株MDR-EC XJ74283)的MIC。CLSI规定头孢他啶对万.co7i的MIC^ 32 μ g/mL为耐药菌株，MIC ( 8 μ g/mL为敏感菌株。结果显示，头孢他啶对耐药菌株MIC > 256 μ g/mL,符合耐药菌株要求；G1. O、G2. O、G3. O和G4. O对所测5株菌株均具有显著的抑菌能力，其中Gl. O抗菌活性最低，MIC值在50 μ g/mL以上；而G3. O和G4. O抗菌活性相当，MIC值约为12. 5 μ g/mL ；G2. O抗菌活性最高，MIC值在6. 25-12. 5 μ g/mL (见表2)。3. I. 3，PAMAM-NH2对金黄色葡萄球菌的MIC :我们共检测了 Gl. O、G2. O、G3. O和 G4. O对I株5 aarem敏感菌株(ATCC29213)和3株耐药菌株(包括MRSA标准菌株WH0-2、MRSA临床分离菌株XJ75302和对万古霉素中度耐药的Mu50)的MIC值。CLSI规定苯唑西林对金黄色葡萄球菌的MIC彡4 μ g/mL为耐药菌株，MIC ( 2 μ g/mL为敏感菌株。实验结果显示，苯唑西林对耐药菌株MIC > 4 4 8/1^，符合耐药菌株要求；61.0、62.0、63.0和G4. O对所测4株菌株均具有显著的抑菌能力，其中Gl. O抗菌活性最低，MIC值为50 μ g/mL ;而 G2. O、G3. O 和 G4. O PAMAM-NH2 抗菌活性相当，MIC 值在 3. 125-12. 5 μ g/mL (见表2)。3. I. 4，PAMAM-NH2 对其余菌株的 MIC :我们还检测了 Gl. O、G2. O、G3. O 和 G4. OPAMAM-NH2对I株革兰氏阳性菌(5 epidermidis JTCC14990)和7株革兰氏阴性菌(F.aeruginosa JTCC27853、ESBLs_KP、5 enterica ATCC9150、KP ATCC13883.5 flexneri, S.typhimurium和A baumanni )的MIC值，结果提不，G1. 0-G4. O PAMAM-NH2 对S. typhimurium和ESBLs-KP抗菌活性较差，对其余6株细菌抗菌活性较高，其中Gl. O抗菌活性最低，MIC值在50 μ g/mL以上；而G3. O和G4. O抗菌活性相当，MIC值约为12. 5-25 μ g/mL ；G2. O抗菌活性最高，MIC值在O. 78-25 μ g/mL (见表2)。3. I. 5，PAMAM-NH2对部分菌株的MBC =MIC结果提示G2. O PAMAM体外抑菌作用最强，所以我们仅检测了 G2. O对6株敏感菌株(万.co7i ATCC25922、5 aureus ATCC29213、5epidermidis ^ TCC14990, 5 enter ica ATCC9150、KP ATCC13883 和职 Ba flexneri)和2株耐药菌株(ESBLs-EC和MRSA)的MBC值。结果提示，G2. O PAMAM-NH2对所测9株细菌的MBC值为2-4倍的MIC，表明其具有确切的杀菌活性(见表2)。表2G1. 0-G4. 0ΡΑΜΑΜ-ΝΗ2 的 MIC 和 MBC 值
权利要求
1.聚酰胺胺型树枝状大分子在制备抗耐药菌的药物中的应用，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2. 0-4. O代聚酰胺胺型树枝状大分子。
2.根据权利要求I所述聚酰胺胺型树枝状大分子在制备抗耐药菌的药物中的应用，其特征在于所述耐药菌选自如下的一种或多种耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSAjiR古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌Mu50、产超广谱β -内酰胺酶的大肠杆菌ESBLs-EC及多重耐药的大肠杆菌MDR-EC。
3.根据权利要求I或2所述聚酰胺胺型树枝状大分子在制备抗耐药菌的药物中的应用，其特征在于所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2. O代聚酰胺胺型树枝状大分子。
全文摘要
本发明公开了聚酰胺胺型树枝状大分子在制备抗耐药菌的药物中的应用，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2.0-4.0代聚酰胺胺型树枝状大分子。通过试验研究后结果表明，G2.0-G4.0PAMAM-NH2具有显著的抗菌活性，而且不容易诱导耐药，与传统的抗生素相比，具有独特的抗菌优势，为临床上耐药菌的彻底杀灭增加了候选药物，丰富了现有技术。
文档编号A61P31/04GK102908357SQ20121025534
公开日2013年2月6日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者罗晓星, 薛小燕, 孟静茹, 周颖, 侯征, 陈晓晴 申请人:中国人民解放军第四军医大学