专利名称：一种异种骨移植材料的制备方法
技术领域：
本发明属于医学生物材料技术领域，具体涉及一种异种骨移植材料的制
备方法。
背景技术：
异种骨是采用动物源性如猪或牛等的骨组织，经过处理降低其免疫原性，用作骨移植材料，在临床上植入患者骨缺损处，起到填充、支撑的作用，并最终改建成宿主的自身骨组织，从而达到治疗的目的。公告号为CN1456363，名称为异种骨胶原基质制备的新方法的专利，公开了一种异 种骨胶原基质制备的新方法，但该专利对异种骨胶原的制备方法未做详述，所提到的部分脱钙会引起骨材料的力学强度明显下降；公告号为CN1188015，名称为新型块形脱脂去抗原异种骨移植材料及其制备方法的专利，采用脱脂、去抗原及部分脱钙的方法处理异种骨，骨矿成分与胶原蛋白的含量比例约为I : I，导致所制备材料力学强度明显下降；公告号为CN1296804，名称为强力抗感染型重组合异种骨的制备方法的专利，采用抗菌剂与重组合异种骨复合，使材料既有骨诱导活性又有抗感染性，但重组合异种骨要复合骨形态发生蛋白，剂量难于控制，加之受体个体差异的不确定性，如果剂量过大容易诱发骨肿瘤。由此可见现有的异种骨制备方法制备过程大多比较繁琐，或引入的化学试剂过多容易引起残留，或清洗效果难以保证，关键性的，未有针对性地对异种骨材料进行病毒灭活处理，以确保移植的安全性，都难以提供一种既保留生物活性与力学强度、又安全有效的异种骨移植材料。
发明内容
本发明主要针对目前异种骨移植材料存在的制备过程繁琐、清洗效果难以保证、化学物质引入过多易发生残留、没有进行病毒灭活等不足，而提供一种方法比较简单、清洗效果好、既降低了异种骨材料的免疫原性，又能保留骨诱导活性与力学强度的异种骨移植材料的制备方法。本发明为实现上述目的而采取的技术方案为
一种异种骨移植材料的制备方法，包括以下步骤
1)取材健康合格的动物，生长6个月以上，取其髂骨与四肢长骨，即异种骨；
2)深低温冷冻将所取异种骨储存于深低温冰箱中保存；
3)成型将深低温冷冻后的异种骨表面软组织剔除干净，锯裁成型；
4)清洗将成型的异种骨浸于水中，超声条件下清洗2 5次，以骨组织不显血色为
准；
5)除病毒将步骤(4)所得异种骨，采用次氯酸钠溶液浸泡，以灭活可能潜在的病毒，每小时换液一次，然后用水在超声条件下清洗2 5次；
6)脱脂将步骤(5)所得异种骨，用碳酸钠溶液进行脱脂清洗，每小时换液一次；
7)酶处理将脱脂后的异种骨，采用胰酶溶液处理；8)清洗经胰酶溶液处理的异种骨，在超声条件下用水清洗干净；
9)冷冻干燥清洗干净的异种骨，冷冻干燥至含水的质量分数为2-10%；
10)灭菌冻干的异种骨，用不少于两层袋包装后，进行钴-60Y射线辐照灭菌。其中所述的深低温保存条件为-70度以下保存不少于I个月。所述的次氯酸钠溶液的质量分数为O. 05% 5%，处理时间为O. 5 16小时。所述的碳酸钠溶液的质量分数为O. 05% 5%，水温35 70度，处理时间为O. 5 20小时。所述的胰酶溶液的浓度为O. I 10g/L，水温30 60度，处理时间为O. 5 20小时。
所述的冷冻干燥至含水量为5%。所述的钴-60 Y射线辐照灭菌剂量为15 30kGy。本发明与现有技术相比具有以下有益效果
(1)本发明采用深低温冷冻的方法保存异种骨，降低了其免疫原性；
(2)本发明采用超声条件下清洗的办法，提高了清洗的效率与效果；
(3)本发明采用次氯酸钠溶液对异种骨组织进行病毒灭活，杜绝病毒传播的可能性；
(4)本发明采用碳酸钠溶液进行脱脂，脱脂效果好，并且不引入其它可能对人健康有影响的化学试剂；
(5)本发明进一步采用酶处理异种骨，对其胶原结构进行切割，进一步降低其免疫原性。
图I是实施例I制备的猪源性异种骨数码照片；
图2是实施例I制备的猪源性异种骨放大25倍的扫描电镜 图3是实施例I制备的猪源性异种骨放大2000倍的扫描电镜 图4是新鲜猪源性异种骨放大了 200倍的光学显微镜 图5是实施例I制备的猪源性异种骨放大200倍的光学显微镜图，
图6是实施例I制备的猪源性异种骨体外细胞毒性试验的细胞生长曲线图。
具体实施例方式实施例I
一种异种骨移植材料的制备方法，包括以下步骤
1)取材健康合格的猪，生长7个月，取其髂骨与四肢长骨，即猪源性异种骨；
2)深低温冷冻将所取猪源性异种骨储存于深低温冰箱中在-70度保存I个月；
3)成型将深低温冷冻后的猪源性异种骨表面软组织剔除干净，锯裁成5mm X 5mm X 20mm 的骨条；
4)清洗将成型的猪源性异种骨浸于纯化水中，超声条件下清洗2次使骨组织不显血
色；
5)除病毒将步骤(4)所得猪源性异种骨，采用质量分数为O.05%的次氯酸钠溶液浸泡16小时，以灭活可能潜在的病毒，每小时换液一次，然后用纯化水在超声条件下清洗3次；6)脱脂将步骤(5)所得猪源性异种骨，用温度为35度，质量分数为O.05%的碳酸钠溶液进行脱脂清洗20小时,每小时换液一次；
7)酶处理将脱脂后的猪源性异种骨，采用温度为30度，浓度为O.lg/L的胰酶溶液处理20小时；
8)清洗经胰酶溶液处理的猪源性异种骨，在超声条件下用纯化水清洗干净；
9)冷冻干燥清洗干净的猪源性异种骨，用冷冻干燥机冷冻干燥至含水的质量分数为
2% ；
10)灭菌冻干的猪源性异种骨，用不少于两层袋包装后，进行钴-60Y射线辐照灭菌，辐照灭菌剂量为15kGy。进了进一步表明本实施例制备的猪源性异种骨的各种性能，本实施例还做了如下 实验
I、观察其形态结构以及清洗的效果。附图I是利用数码相机对本实施例制备的猪源性异种骨拍照进行大体观察，同时采用离子溅射仪对猪源性异种骨表面喷金后，用JSM6360LV低真空扫描电子显微镜观察，扫描拍片，Smile View软件分析测量其腔隙直径，附图2是异种骨放大25倍的扫描电镜图，附图3是放大了 2000倍的扫描电镜图。图I、图2和图3的观察结果显示，与人松质骨结构相似，本实施例制备的猪源性异种骨呈蜂窝状三维多孔网状立体结构，孔隙分布均匀，材料的腔隙直径大小在150 μ m-600 μ m之间，在其松质骨小梁上有大量直径在IOym -100 μ m的小孔，这样的三维孔隙结构，植入体内时，有利于宿主组织与细胞的长入、营养成分的进入，便于宿主成骨相关细胞的迁徙、贴附与长入，进而发生爬行取代。制备的猪松质骨清洗彻底，无软组织与细胞组分的残留。2、组织学观察
将新鲜的异种骨和本实施例制备的猪源性异种骨，用福尔马林溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察其显微结构，从而观察处理与清洗的效果，以及处理方法对异种骨组织的显微结构的影响。附图4是新鲜异种骨光学显微镜图，附图5是本实施例制备的猪源性异种骨光学显微镜图，从两个附图可以看出，制备出来的异种骨材料清洗效果好，显微结构保持良好。3、异种骨力学强度检测，目的是比较制备过程对异种骨材料的力学强度是否影响。表I是将本实施例制备的猪源性异种骨加工成IOmmX IOmmX 20mm的骨块，于处理的不同阶段取材，分新鲜猪骨组、次氯酸钠处理组、胰酶处理后组、冻干辐照组，用RGT-20A微机控制电子万能材料试验机检测样品的抗压性能，试验条件为室温，湿度为30%，加载速度为 5mm/min0表I异种骨力学强度检测数据
权利要求
1.一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是包括以下步骤 1)取材健康合格的动物，生长6个月以上，取其髂骨与四肢长骨，即异种骨； 2)深低温冷冻将所取异种骨储存于深低温冰箱中保存； 3)成型将深低温冷冻后的异种骨表面软组织剔除干净，锯裁成型； 4)清洗将成型的异种骨浸于水中，超声条件下清洗2 5次，以骨组织不显血色为准； 5)除病毒将步骤(4)所得异种骨，采用次氯酸钠溶液浸泡，以灭活可能潜在的病毒，每小时换液一次，然后用水在超声条件下清洗2 5次； 6)脱脂将步骤(5)所得异种骨，用碳酸钠溶液进行脱脂清洗，每小时换液一次； 7)酶处理将脱脂后的异种骨，采用胰酶溶液处理； 8)清洗经胰酶溶液处理的异种骨，在超声条件下用水清洗干净； 9)冷冻干燥清洗干净的异种骨，冷冻干燥至含水的质量分数为2-10%；10)灭菌冻干的异种骨，用不少于两层袋包装后，进行钴-60Y射线辐照灭菌。
2.根据权利要求I所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的深低温保存条件为-70度以下保存不少于I个月。
3.根据权利要求I所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的次氯酸钠溶液的质量分数为O. 05% 5%，处理时间为O. 5 16小时。
4.根据权利要求I所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的碳酸钠溶液的质量分数为O. 05% 5%，水温35 70度，处理时间为O. 5 20小时。
5.根据权利要求I所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的胰酶溶液的浓度为O. I 10g/L，水温30 60度，处理时间为O. 5 20小时。
6.根据权利要求I所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的冷冻干燥至含水量为5%。
7.根据权利要求I所述的一种异种骨移植材料的制备方法，其特征是所述的钴-60Y射线辐照灭菌剂量为15 30kGy。
全文摘要
本发明属于医学生物材料技术领域，具体涉及一种异种骨移植材料的制备方法。本发明主要解决目前异种骨移植材料存在的制备过程繁琐、清洗效果难以保证、化学物质引入过多易发生残留、没有进行病毒灭活等不足。本发明一种异种骨移植材料的制备方法包括取材、深低温冷冻、成型、清洗、除病毒、脱脂、酶处理、清洗、冷冻干燥和灭菌十个步骤，本发明的制备方法具有方法简单、清洗效果好、既降低了异种骨材料的免疫原性，又能保留骨诱导活性与力学强度的优点。
文档编号A61L27/36GK102755665SQ20121026732
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者张育敏, 李宝兴, 李宝明, 李靖, 杨婷, 陈学英 申请人:中国辐射防护研究院