专利名称：纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽作为制备癌症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤过继免疫治疗(生物治疗)领域,主要涉及一种复合刺激剂纳曲酮(LDN)联合蛋氨酸脑腓肽在体外刺激从患者血液中分离的淋巴细胞，待培养增殖到相当数量后，回输体内作为治疗癌症药物的应用。
背景技术：
肿瘤的生物治疗是采用细胞生物学和分子生物学技术对肿瘤进行主动攻击性治疗。通过激活病人的自体免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞，达到根治肿瘤的目的。而且没有任何副作用。此项技术逐渐在各种有益的探索中脱颖而出，成为继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗肿瘤的模式。肿瘤的生物治疗是在明确提出了生物应答调节剂概念的基础上产 生的，在各种实际运用中，又出现五大支柱性生物治疗技术BRM细胞因子技术、免疫活性细胞过继性输注技术、单克隆抗体及其偶联物技术、肿瘤疫苗技术、基因治疗技术，它们的出现标志着肿瘤生物治疗体系的形成。有些专家对这种技术称作肿瘤免疫治疗技术。既是通过调整或增强机体本来就有的内在防御机制来抑制或杀伤肿瘤细胞，或通过抑制肿瘤细胞转化来降低肿瘤的恶性度。具体也可分为1，外源给予免疫刺激剂或调节剂，纠正免疫功能低下状态。2，直接给予具有免疫效应的细胞或具有抗癌活性的细胞因子，或采用过继性细胞免疫治疗。3，增强肿瘤细胞对机体抗肿瘤效应的敏感性。4，增强机体由于肿瘤对机体所致损伤的耐受。5，抑制肿瘤细胞转化或通过基因治疗使肿瘤细胞凋亡。体细胞治疗是最常用的一种疗法,是通过分离获取的患者自身免疫细胞,在细胞因子的诱导下，大量扩增出具有高度抗肿瘤活性的免疫细胞，再回输到患者体内，此类细胞包括LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞、DC细胞、⑶3AK细胞、AKM细胞等，此疗法对恶性黑色素瘤、肾癌、非何杰金氏淋巴瘤等多种肿瘤及癌性胸腹水具有很好的疗效，且毒副反应轻微。细胞因子是一类由活化的免疫细胞(单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)或间质细胞(血管内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)所合成、分泌，具有调节细胞生长、分化成熟、调节免疫应答、参与炎症反应、促进创伤愈合和参与肿瘤消长等功能的小分子多肽类活性分子。临床应用较多的主要包括干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-Y )、白介素(IL_2、IL_4、IL-7、IL-12 等)、造血刺激因子(EPO、TPO、G-CSF, GM-CSF, IL-IU IL-3 等)、肿瘤坏死因子(TNF-a )、修复因子(GM1、EGF、BFGF等)。用于白血病、淋巴瘤、实体瘤、病毒感染、造血抑制、放射损伤等的治疗。实际上体细胞疗法与细胞因子疗法常常具有互补性，更多的采取联合应用的方式。如CIK/IL-2联用、TIL/IL-2联用、LAK/IL-2联用、DC/IL-2/IFN-Y联用、AKM/IFN- Y联用、IL-2/IFN-a/TNF-a联用，特别是可以用于造血干细胞定向分化扩增，目前这些治疗方法已经能够应用于临床工作中，但是，近30年的临床应用证明肿瘤生物治疗方法有效，但是疗效没有突破。1975年Hughes等从猪脑抽提液中分离的、具有内源性吗啡样活性的蛋氨酸脑啡肽。后来研究发现是由肾上腺产生的前激素和前脑啡肽衍生来，释放入血，由五个氨基酸构成的五肽。正常体内含量极低，每毫升血衆50-150pg。
蛋氨酸脑啡肽是一种神经肽，是连接神经和免疫两个系统重要的转导信号分子之一。能够和阿片受体结合而使人或动物(类似内啡肽)产生镇定和止痛作用，并且有直接抑制肿瘤生长的功能。后继研究发现正常的T淋巴细胞，树突状细胞，巨噬细胞，自然杀伤细胞(NK)含有阿片受体。大量研究证明蛋氨酸脑啡肽对免疫系统具有如下作用增加T淋巴细胞活性，增加⑶2，⑶4，⑶8等受体分子的表达，特别是增加⑶4分子的表达，增加T细胞玫瑰花节形成率，增加NK细胞活性，增加有丝分裂素诱导的细胞增殖，增加单核细胞(巨噬细胞)和中性粒细胞的趋化作用，对树突状细胞的成熟和活性有明显的促进作用。还可以增加Y-干扰素，白介素-2和肿瘤坏死因子等多种细胞因子的产生。在与白细胞介素-2比较时显示出，用量小，副作用小，活性高，安全性高。
发明内容
I、发明目的
本发明提供一种纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽作为制备癌症药物中的应用，其目的在于解决现有的放化疗方法副作用大、疗效差，以及目前采用的肿瘤生物疗法，疗效一般，没有突破性等方面存在的问题。2、技术方案本发明是通过以下技术方案来实现的I、纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽作为制备癌症药物中的应用，所述纳曲酮学名为17-环丙甲基-4，5-环氧-3，14-二羟基吗啡烷-6-酮，分子式C20H23N04，分子量341. 4，为人工合成盐酸盐白色粉末；蛋氨酸脑啡肽分子结构为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，为采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量760 780 ;抽取患者静脉血液20 100毫升，力口2毫升125单位/ml肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到培养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，调整纳曲酮浓度为KT1Io,克分子/升，蛋氨酸脑啡肽的使用浓度范围为10_510_16克分子/升，在35 40°C用7%C02培养3 10天，待检测到细胞生长到IO8/毫升时，检测淋巴细胞亚群，确定增殖后作为回输体内的药物。抽取静脉血液，加125单位/ml肝素抗凝，血液与肝素的体积比为10: I。该应用还适用于免疫功能低下者或需要免疫治疗的患者。回输的淋巴细胞中包含有⑶4+T细胞，⑶8+T细胞，NK细胞，NET细胞，Y δ T细胞和树突状细胞。3、优点及效果本发明具有如下优点主要涉及纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽在刺激免疫细胞增殖回输治疗癌症中的应用，利用纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽对树突状细胞和CD4+T细胞的明显的促进作用，在体外刺激淋巴细胞亚群活性，形成具有突破性疗效的肿瘤生物治疗新方法。具有用量小，副作用小，活性高，安全性高等优点。(特别是能促进树突状细胞增殖，抑制调节性T细胞增殖，这些都是现行免疫回输疗法不具备的)
图I为患者纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽刺激前后树突状细胞成熟比较图；图2是患者树突状细胞增殖标志分子变化曲线图；图3是电子显微镜下患者纳曲酮结合蛋氨酸脑啡肽刺激前后树突状细胞成熟比较图。
具体实施例方式经过系统研究了纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽对树突状细胞和CD4+T细胞作用，做了对多例免疫系统遭受放化疗损伤的癌症患者免疫系统作用观察，在此基础上形成了具有突破性疗效的新的肿瘤免疫治疗方法的药物。纳曲酮(LDN)学名为17-环丙甲基-4，5-环氧-3，14-二羟基吗啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4，为人工合成盐酸盐白色粉，调整纳曲酮浓度为 10 1^lO 10克分子/升。蛋氨酸脑啡肽在刺激免疫细胞增殖回输治疗癌症中的应用,所述蛋氨酸脑啡肽分子结构为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met,可作为刺激剂单独使用或者与干扰素或白细胞介素-2联合使用，体外刺激免疫细胞增殖后回输体内用于临床治疗癌症。蛋氨酸脑啡肽为采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量760 780。蛋氨酸脑啡肽的使用浓度范围为1(Γ5 1(Γ16克分子/升,淋巴细胞培养3 10天，待到细胞生长到IO8/毫升时回输。体外刺激免疫细胞增殖后回输体内是指抽取静脉血液，加125单位/ml肝素抗凝，血液与肝素的体积比为10:1，分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到营养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，使纳曲酮的浓度为KT1Io,克分子/升，蛋氨酸脑啡肽的浓度为10_5 10_16克分子/升，在35 40°C用7%C02培养3 10天，待细胞生长到IO8/毫升时，检测淋巴细胞亚群，确定增殖后作为治疗癌症的药物回输体内。所述回输体内的方法可以用于癌症患者、免疫功能低下者或需要免疫治疗的患者。回输细胞中包含有⑶4+T细胞，⑶8+T细胞，NK细胞，NET细胞，Y δ T细胞和树突状细胞。实施技术路线患者外周血-------分离淋巴细胞------不同浓度蛋氨酸脑啡肽刺激------MTS
法测定细胞增殖--------用单克隆抗体结合流式细胞术检测淋巴细胞亚群——确定增
殖------回输体内。具体为抽取病人静脉血液20 100毫升，加2毫升125单位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到培养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，在35 40°C用7%C02培养3 10天，待到细胞生长到IO8/毫升时检测，回输体内。下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明实施例I :纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽在刺激免疫细胞增殖回输治疗癌症中的应用，所述纳曲酮(LDN)学名为17-(环丙甲基)-4，5-环氧-3，14-二羟基吗啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4为人工合成盐酸盐白色粉。所述蛋氨酸脑啡肽分子结构为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量为760，二者作为联合刺激剂，体外刺激免疫细胞增殖后回输体内用于临床治疗癌症，即抽取静脉血液20毫升，加2毫升125单位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到营养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，使纳曲酮的浓度为10_6克分子/升和10_5克分子/升的蛋氨酸脑啡肽，在35°C用7%C02培养淋巴细胞10天，待细胞生长到IO8/毫升时，检测淋巴细胞亚群，回输细胞中包含有⑶4+T细胞，⑶8+T细胞，NK细胞，NET细胞，γ δ T细胞和树突状细胞，确定增殖后回输体内。癌症患者接受治疗后免疫系统指标稳定。实施例2 纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽在刺激免疫细胞增殖回输治疗癌症中的应用，所述纳曲酮学名为17_(环丙甲基)_4，5-环氧-3，14-二羟基吗啡烷-6-酮，白色粉末，分子 式C20H23N04，分子量341. 4为人工合成盐酸盐白色粉。所述蛋氨酸脑啡肽分子结构为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量为760，二者作为联合刺激剂，体外刺激免疫细胞增殖后回输体内用于临床治疗癌症，即抽取静脉血液50毫升，加2毫升125单位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到营养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，使纳曲酮的浓度为10_1(1克分子/升和10_16克分子/升的蛋氨酸脑啡肽，在40°C用7%C02培养淋巴细胞3天，待细胞生长到IO8/毫升时，检测淋巴细胞亚群，回输细胞中包含有⑶4+T细胞，⑶8+T细胞，NK细胞，NET细胞，γ δ T细胞和树突状细胞，确定增殖后回输体内。癌症患者接受治疗后免疫系统指标稳定。实施例3 纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽在刺激免疫细胞增殖回输治疗癌症中的应用，所述纳曲酮学名为17_(环丙甲基)_4，5-环氧-3，14-二羟基吗啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4为人工合成盐酸盐白色粉。所述蛋氨酸脑啡肽分子结构为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量为760，二者作为联合刺激剂，体外刺激免疫细胞增殖后回输体内用于临床治疗癌症，即抽取静脉血液100毫升，加2毫升125单位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到营养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，使纳曲酮的浓度为10_6克分子/升和10,克分子/升的蛋氨酸脑啡肽，在37°C用7%C02培养淋巴细胞6天，待细胞生长到IO8/毫升时，检测淋巴细胞亚群，回输细胞中包含有⑶4+T细胞，⑶8+T细胞，NK细胞，NET细胞，γ δ T细胞和树突状细胞，确定增殖后回输体内。癌症患者接受治疗后免疫系统指标稳定。实施例4:纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽在刺激免疫细胞增殖回输治疗癌症中的应用，所述纳曲酮学名为17_(环丙甲基)_4，5-环氧-3，14-二羟基吗啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4为人工合成盐酸盐白色粉。所述蛋氨酸脑啡肽分子结构为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量为760，二者作为联合刺激剂，体外刺激免疫细胞增殖后回输体内用于临床治疗，即抽取静脉血液80毫升，加2毫升125单位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到营养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，使纳曲酮的浓度为10_3克分子/升和10_12克分子/升的蛋氨酸脑啡肽，在38°C用7%C02培养淋巴细胞7天，待细胞生长到IO8/毫升时，检测淋巴细胞亚群，回输细胞中包含有⑶4+T细胞，⑶8+T细胞，NK细胞，NET细胞，γ δ T细胞和树突状细胞，确定增殖后回输体内。免疫功能低下者接受治疗后，免疫系统指标恢复近正常值。实施例5 纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽在刺激 免疫细胞增殖回输治疗癌症中的应用，所述纳曲酮学名为17_(环丙甲基)_4，5-环氧-3，14-二羟基吗啡烷-6-酮，白色粉末，分子式C20H23N04，分子量341. 4为人工合成盐酸盐白色粉。所述蛋氨酸脑啡肽分子结构为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，是采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量为760，二者作为联合刺激剂，体外刺激免疫细胞增殖后回输体内用于临床治疗，即抽取静脉血液20毫升，加2毫升125单位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到营养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，使纳曲酮的浓度为10_6克分子/升和10_8克分子/升的蛋氨酸脑啡肽，在36°C用7%C02培养淋巴细胞5天，待细胞生长到IO8/毫升时，检测淋巴细胞亚群，回输细胞中包含有⑶4+T细胞，⑶8+T细胞，NK细胞，NET细胞，γ δ T细胞和树突状细胞，确定增殖后回输体内。需要免疫治疗的患者接受治疗后，免疫系统指标恢复近正常值。要求保护单独使用蛋氨酸脑啡肽作为刺激剂。实施例6 抽取病人静脉血液20毫升，加2毫升125单位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到培养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，使纳曲酮的浓度为10_8克分子/升和10_14克分子/升蛋氨酸脑啡肽，在37°C用7%C02培养3 10天，待到细胞生长到IO8/毫升时，电镜结合流式技术检测树突状细胞，结果如下( I)患者蛋氨酸脑啡肽刺激前后树突状细胞成熟比较；如图I中所示为患者蛋氨酸脑啡肽刺激前后树突状细胞成熟比较图，左侧为蛋氨酸脑啡肽刺激前的树突状细胞图，右侧为蛋氨酸脑啡肽刺激后的树突状细胞图。纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽刺激后细胞表面关键分子表达显著增加，结合图I证明纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽刺激后树突状细胞明显成熟。图2为用流式细胞技术检测培养刺激前后的细胞表面分子变化；图3是电子显微镜下患者纳曲酮结合蛋氨酸脑啡肽刺激前后树突状细胞成熟比较图。(2)患者外周血淋巴细胞亚群比较分析；五名癌症患者，其中肺癌I例，肠癌2例，肝癌I例，胰腺癌I例。每人抽取静脉血液20毫升，加2毫升125单位/ml肝素抗凝，用Percoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到培养瓶中，加入一定的纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，在37°C用7%C02培养3 10天，待到细胞生长到IO8/毫升时，用流式技术结合单克隆抗体检测外周血淋巴细胞亚群变化，取得平均值如下
权利要求
1.纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽作为制备癌症药物中的应用，所述纳曲酮学名为17-环丙甲基-4，5-环氧-3，14-二羟基吗啡烷-6-酮，分子式:C20H23N04，分子量:341. 4，为人工合成盐酸盐白色粉末；蛋氨酸脑啡肽分子结构为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met，为采用固相或液相法人工合成的白色粉末，分子量760 780 ;抽取患者静脉血液20 100晕升,加2晕升125单位/ml肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，计数细胞，调整细胞浓度在IO5/毫升，转移到培养瓶中，加入纳曲酮和蛋氨酸脑啡肽，调整纳曲酮浓度为KT1Krw克分子/升，蛋氨酸脑啡肽的使用浓度范围为10_5 10_16克分子/升，在35 40°C用7%C02培养3 10天，待检测到细胞生长到IO8/毫升时，检测淋巴细胞亚群，确定增殖后作为回输体内的药物。
2.根据权利要求I所述的纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽作为制备癌症药物中的应用，其特征在于抽取静脉血液，加125单位/ml肝素抗凝，血液与肝素的体积比为10: I。
3.根据权利要求I所述的纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽作为制备癌症药物中的应用，其特征在于该应用还适用于免疫功能低下者或需要免疫治疗的患者。
4.根据权利要求I所述的纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽作为制备癌症药物中的应用，其特征在于回输的淋巴细胞中包含有⑶4+T细胞，⑶8+T细胞，NK细胞，NET细胞，γ δ T细胞和树突状细胞。
全文摘要
本发明涉及纳曲酮联合蛋氨酸脑啡肽在刺激免疫细胞增殖作为药物回输治疗癌症的应用，将纳曲酮蛋氨酸脑啡肽作为刺激剂，体外刺激免疫细胞增殖后回输体内用于临床治疗，利用蛋氨酸脑啡肽对树突状细胞和CD4+T细胞的明显的促进作用，在体外刺激淋巴细胞亚群活性，形成具有突破性疗效的肿瘤生物治疗新方法。具有用量小，副作用小，活性高，安全性高等优点。
文档编号A61P35/00GK102772784SQ201210290150
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者单风平, 尼古拉菠萝尼科夫, 诺瑞.格瑞芬 申请人:单风平