专利名称：猪圆环病毒2型Cap蛋白和胸腺素α1融合蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白和胸腺素α I融合蛋白及应用。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2, PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multsystemic wasting syndrome, PMWS)的病原，引起断奶仔猪发生进行性消瘦、咳嗽、呼吸困难、腹泻、皮肤苍白或者黄染、淋巴结肿大、肾脏灰白水肿等症状。同时该病还会造成一定程度上的的免疫抑制，容易造成其它疾病的继发或并发感染。自1991年加拿大首次发现临床猪圆环病毒以来，该病已给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒2型0RF2基因编码的Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白，可自我装配成病毒性 粒子，并含有可中和病毒的抗原表位，可诱导机体产生较强的抗体反应并获得免疫保护，是设计PCV2新型疫苗的首选目标基因。大肠杆菌表达系统具有生产工艺简单、生产周期短和生产成本低等特点，是基因工程中蛋白类药物开发的首选。但是猪圆环病毒2型0RF2基因5’端存在成串排列的稀有密码子并编码许多碱性氨基酸，不利于其大肠杆菌表达。根据文献报道，猪圆环病毒2型Cap蛋白的竣基端131个氣基酸具有和完整Cap蛋白相同的抗原性，更利于大肠杆菌表达(韩凌霞，陈艳，崔尚金等，猪II型圆环病毒全基因组序列分析及其ORFl和0RF2基因的克隆与表达，中国预防兽医学报，2004，26 (1):10_14)。但随着猪圆环病毒2型毒株不断变异，现有疫苗的免疫保护力不断下降。因此，筛选当前流行毒株的Cap蛋白进行疫苗研发无疑具有重要的现实意义和市场开发价值。1965年Goldestein等报道，动物胸腺可分离到有生物活性的多胸腺肽类分子，命名为胸腺素(Thymosin) )。1972年Goldestein等报告进一步纯化所得到的主要分子量在1-15KD的组分，称之为胸腺肽组分5 (ThymoSinF5)，用之于动物研究和临床观察，有补偿胸腺功能低下作用。此后，对胸腺内激素样物质的生物化学研究，在一些实验室陆续开展起来。胸腺素α I其中的一个组分，由28个氨基酸残基组成，其相对分子量为3. 108KD，等电点为4. 2，无二硫键和糖基化，N端乙酞化，是高度保守的活性胸腺肽。研究表明，胸腺素α I能促进淋巴细胞分化为成熟的有免疫功能的T淋巴细胞，调节和增强机体的细胞免疫功能，提高机体抗感染能力。在人用临床上，已有超万例胸腺肽产品作为免疫调节剂和增强剂用于治疗原发性或继发性免疫功能缺陷性疾病和肝炎等，其疗效得到国内外相关领域专家的认可。虽然胸腺素α I有着广泛的应用前景，但由于其基因过短，很难利用基因工程方法实现直接表达，所以目前多是化学合成产品，价格比较昂贵，另外，由于分子量非常小，所以体内半衰期很短，应用推广受到限制。
发明内容
本发明涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白和胸腺素α I融合蛋白及应用，即将筛选的猪圆环病毒2型Cap蛋白与具有免疫增强作用的胸腺素α I蛋白通过Lingker序列连接获得的融合蛋白，并将该融合蛋白作为疫苗用于免疫应答。本发明一个方面涉及一种融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID Ν0:1。本发明的融合蛋白用于制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。上述制备的亚单位疫苗，其制备方法如下将96份融合蛋白与灭菌的4份吐温80搅拌混合作为水相；将94份注射用白油，6份加司本80、2份硬脂酸铝，混合均匀，高压灭菌后作为油相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化即可制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗。本发明的亚单位疫苗用于对仔猪的免疫应答。
本发明将筛选的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因与具有免疫增强作用的胸腺素α I基因通过Lingker序列连接获得融合蛋白。一次免疫操作就可以使仔猪可以获得双重免疫保护。本发明的基因工程亚单位疫苗免疫原性良好，可以高效的引起仔猪的免疫应答。说明书附I :本发明的重组表达载体的构建示意图。
具体实施例方式本发明涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白与胸腺素α I组成的融合蛋白。其中猪圆环病毒2型Cap蛋白3'端的131个氨基酸片段和胸腺素α I的28个氨基酸序列通过Lingker序列GSGGG连接起来，其具有序列为SEQ ID NO: I的氨基酸序列和序列为SEQ IDΝ0:2的核苷酸序列。所述的融合蛋白可通过本领域技术人员所熟知的基因重组的方法进行制备。
将重组制备的猪圆环病毒2型Cap蛋白与胸腺素α I组成的融合蛋白经白油佐剂乳化制成猪圆环病毒2型基因工程亚疫苗。按兽用生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验均合格。再将制备的疫苗免疫PCV2阴性断奶仔猪，结果显示制备的疫苗免疫原性良好，可有效的引起仔猪的免疫应答。下面结合具体实施方式
来进一步描述本发明，但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案实质的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明保护范围内。一、猪圆环病毒2型Cap蛋白的筛选包括有如下的步骤I、申请人首先从临床分离的疑似PMWS的病料处理后接种无PCVl污染的ΡΚ-15细胞、盲传三代后PCR扩增猪圆环病毒2型基因全长，引物序列如下Pl: 5' --GCTGGCTGAACTTTTGAAAG—3'Ρ2 5 ' —AAATTTCTGACAAACGTTAC—3'扩增的条件如下94°C5min 变性，94°C 30S,65°C 30S,72°C I. 5min，30 个循环，72°C延伸 lOmin。扩增产物进行测序，猪圆环病毒2型基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:3，氨基酸序列为SEQ ID N0:4。将Cap蛋白基因序列部分在NCBI上Blast比对，同源性最高为97%，表明扩增的样品为发生变异的病毒株。将获得的Cap蛋白基因的5'端和3'端分别加上BamH I和Hind III酶切位点，送基因公司进行全基因合成。将合成得到的Cap蛋白基因双酶切后连入pET30a载体相应的酶切位点，构建pET30a/mCap表达载体。用CaCl2法将pET30a/mCap表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50μ g/ml卡那霉素的琼脂平板，37°C过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamH I和Hind III双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵培养至O. 6 O. 8时加入O. 3mM IPTG诱导4 5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同时设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在30KD处多出一条蛋白条带，与重组蛋白理论分子量一致，表达量约为35%以上。经PCV2抗体免疫印迹检定，显示阳性反 应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌。
发酵、纯化与猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的制备I、发酵工艺I) LB培养基作为种子培养基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 · 7H20的LB培养基作为发酵培养基，补料为葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO4 · 7H20 5 g/L ο2)发酵过程挑取鉴定过的工程菌接种于含卡那霉素的浓度为50μ g/ml的LB培养基，37°C振荡培养8小时，作为种子液。将种子液按2%接种量接种于发酵罐中，调节好各参数，37°C，200转，溶氧控制在20%以上。发酵4小时后开始流加补料，发酵6小时后加入O. 3mmol/LIPTG进行诱导表达，表达后6小时发酵结束。3)镍柱纯化、脱盐4)亲和层析采用镍离子金属螯合层析柱，重组蛋白可以用含300mmol/L咪唑的洗脱液洗下来，纯度达到90%以上5)脱盐收集的重组蛋白洗脱液放入透析袋，PBS液作为透析外液，透析脱盐即得重组蛋白液。2、猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的制备将制备的重组蛋白96份与灭菌的4份吐温-80充分搅拌混合作为水相。同时注射用白油94份，加6份的司本80、硬脂酸铝2份，混合均匀，高压灭菌后作为油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗。按兽用生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验均合格。重组蛋白制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的动物试验将制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗经肌肉接种21日龄PCV2阴性断奶仔猪5头，另取5头作为对照。接种28日后取血测PCV2抗体，免疫组PCV2抗体全部为阳性，有效率达到100%，对照组未检测到抗体。结果显示制备的重组蛋白免疫原性良好，其进一步制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗可以引起仔猪的免疫应答。并且，由于本发明的猪圆环病毒2型基因为新的等位基因，可以更有效的对仔猪进行免疫保护。
二、融合蛋白的制备I、将获得的Cap蛋白V端的131个氨基酸片段和胸腺素α I的28个氨基酸序列通过Lingker序列GSGGG连接起来,既得融合蛋白序列(SEQ ID NO: I)。在保证融合蛋白的氨基酸序列不变的情况下将融合蛋白的DNA序列进行毕赤酵母稀有密码子改造获得融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO: 2)。 2、将本发明的融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO: 2 )，的5'端和3'端分别引入XhoI和Xba I酶切位点后全基因合成，双酶切后连入pPICZ B载体相应的酶切位点，构建pPICZB/T a -PCV2表达载体(
图1)，并进行进行PCR鉴定、测序；3、阳性质粒加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100 μ g/mLZeocin的YPDS选择平板上，30°C孵育3 -5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 μ g/mL, 500 μ g/mL, 1000 μ g/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。提取可能的高拷贝重组酵 母基因组DNA。以P1、P2为引物进行PCR反应，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，能扩增出大约247bp的条带重组子定为阳性转化子。4、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 μ g/mL Zeocin的YPD培养液中，28°C振摇培养18个小时。取此菌液按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中，28°C摇振培养18-24h左右，0D600值约为5-6。培养物直接转接于25 ml BMMY培养基中，28°C继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100%甲醇使终浓度达1%。60h后，4°C 5000 r/min离心lOmin，收集上清，即为猪圆环病毒2型Cap蛋白-胸腺素α I融合蛋白原液。二、发酵、纯化与猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的制备I、将筛选得到的阳性重组子活化后按1% 10%接种量接种于三角瓶，28 30°C，200r/min摇床培养16 24h后以5% 20%接种量接入发酵罐，在28 30°C，500 1500r/min, pH值5· O 6· O，通气量O. I I. OVVM (IL发酵液Imin通入的氧气量)，溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18 24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48 72h。发酵结束后放料，5000r/min离心lOmin，收集发酵上清即为猪圆环病毒2型Cap蛋白-胸腺素α I融合蛋白原液。上述原液经超滤浓缩、镍柱纯化后即得猪圆环病毒2型Cap蛋白-胸腺素α I融合蛋白液。2、猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗的制备。将制备的融合蛋白96份与灭菌的吐温80 4份充分搅拌混合作为水相。同时注射用白油94份，加司本80 6份、硬脂酸铝2份，混合均匀，高压灭菌后作为油相。按水相和油相1:3比例混合乳化即可制备猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗。按兽用生物制品规程的检验方法进行性状、无菌检验、安全检验均合格。三、基因工程亚单位疫苗的动物试验将制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗经肌肉接种21日龄PCV2阴性断奶仔猪5头，另取5头作为对照。接种7日采血加入肝素抗凝，用于测定淋巴细胞转化率，接种28日后取血测PCV2抗体。结果表明免疫组接种7日时淋巴细胞转化率显著高于对照组，显示胸腺素可明显促进机体免疫状态。接种28日后PCV2抗体全部为阳性，有效率达到100%，对照组未检测到抗体。显示制备的融合蛋白免疫原性良好，其进一步制备的猪圆环病毒2型基因工程亚单位疫苗可以引起仔猪的免疫应答。
权利要求
1.一种猪圆环病毒2型Cap蛋白和胸腺素α I融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDNO: I。
2.权利要求I所述的融合蛋白在制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗中的应用。
3.一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗，其制备方法如下将96份权利要求I所述的融合蛋白与灭菌的4份吐温80搅拌混合作为水相；再将94份注射用白油，6份加司本80、2份硬脂酸铝混合均匀，高压灭菌后作为油相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化后制成亚单位疫苗。
4.权利要求3所述的亚单位疫苗用于对仔猪的免疫应答。
全文摘要
本发明涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白和胸腺素α1融合蛋白及应用，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的融合蛋白用于制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。本发明将筛选的猪圆环病毒2型Cap蛋白基因与具有免疫增强作用的胸腺素α1基因通过Lingker序列连接获得融合蛋白。本发明的基因工程亚单位疫苗免疫原性良好，可以高效的引起仔猪的免疫应答。
文档编号A61K39/12GK102827289SQ20121031712
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者王宏华, 凌红丽, 于春梅, 王雷, 徐丽丽 申请人:青岛康地恩药业股份有限公司, 青岛宝依特生物制药有限公司