修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体的制作方法

专利名称：修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体的制作方法
修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体本申请是申请日为2008年6月25日、发明名称为“修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体”、申请号为200880021889. 4的申请的分案申请。本申请要求于2007年6月25日提交的美国临时申请序列号60/937，112的优先权，所述美国临时申请的名称为 “Sequence Based Engineering and Optimization ofSingle Chain Antibodies”。本申请还要求于2008年3月12日提交的美国临时申请序列号61/069，056的优先权,所述美国临时申请的名称为“Methods of Modifying Antibodies,and Modified Antibodies with Improved Functional Properties，，。发明背景
已证明抗体在癌症、自身免疫疾病和其他病症的治疗中是非常有效和成功的治疗齐U。尽管一般已在临床上使用全长抗体，但存在使用抗体片段可以提供的许多优点，例如增加组织穿透力、与增加其他效应子功能的能力结合的Fe效应子功能的不存在、和由较短的全身体内半衰期导致的较少全身性副作用的可能性。抗体片段的药代动力学性质表明，它们可能特别良好地适合于局部治疗方法。此外，抗体片段在特定表达系统中可以比全长抗体更容易产生。一个类型的抗体片段是单链抗体(scFv)，其由经由接头序列缀合的轻链可变结构域(')与重链可变结构域(Vh)组成。因此，scFv缺乏所有抗体恒定区结构域，并且先前的可变/恒定结构域界面的氨基酸残基(界面残基)变成溶剂暴露的。scFv可以通过已建立的重组改造技术由全长抗体(例如IgG分子)制备。然而，全长抗体转变成scFv通常导致蛋白质的弱稳定性和溶解性、低产量和高聚集趋势，这增加免疫原性危险。因此，已尝试改善scFv的性质例如溶解性和稳定性。例如,Nieba,L.等人(Prot.Eng. (1997) 10 =435-444)选择已知为界面残基的3个氨基酸残基且使其突变。他们观察到突变的scFv在细菌中周质表达增加，以及热诱导聚集速率减小，尽管热力学稳定性和溶解性未显著改变。其中对scFv内的特定氨基酸残基执行定点诱变的其他研究也已得到报告(参见例如，Tan，P. H.等人(1988) Biophys. J. 75 1473-1482 ；WftriIjA.和 Pluckthun,A. (1998) Biochem. 37 13120-13127 ； Worn, A.和 Pliickthun，A. (1999) Biochem. 38 8739-8750)。在这些各种研究中，选择用于诱变的氨基酸残基基于其在scFv结构内的已知位置(例如，来自分子建模研究)进行选择。在另一种方法中，将来自表达极弱的scFv的互补决定区(⑶R)移植到已证实具有有利性质的 scFv 的构架区内(Jung, S.和 Pliickthun, A. (1997) Prot. Eng. 10 :959_966)。所得到的scFv显示改善的可溶性表达和热力学稳定性。改造scFv以改善功能性质中的进展在例如'Viini , Α.和Pliickthun，A. (2001)J. Mol. Biol. 305 :989-1010中综述。然而，仍需要允许合理设计具有优良功能性质的scFv的新方法，特别是帮助技术人员选择潜在有问题的氨基酸残基用于改造的方法。此外，仍需要改造scFv和其他类型抗体从而赋予改善的功能性质，例如增加的稳定性和/或溶解性性质的方法。发明概述
本发明提供了基于稳定、可溶SCFv构架的序列分析改造免疫结合剂例如SCFv抗体的方法，所述序列分析允许鉴定在scFv序列内对于稳定性和/或溶解性潜在有问题的氨基酸和鉴定在此种氨基酸位置处优选的氨基酸残基置换。因此，依照本发明的方法鉴定的氨基酸残基可以选择用于突变，并且可以制备已突变的改造的免疫结合剂例如scFv，且就改善的功能性质例如稳定性和/或溶解性进行筛选。本发明提供“功能共有区"(functionalconsensus)方法且证实其优点,其基于功能性选择的(functionally_selected)scFv序列数据库的使用，鉴定scFv构架内的优选氨基酸置换。因此，本发明提供了改造免疫结合剂(例如scFv)的 方法，其通过使特定构架氨基酸位置突变成使用本文描述的“功能共有区”方法鉴定的特定氨基酸残基。再进一步地，本发明提供了基于本文描述的“功能共有区”方法设计的scFv构架支架，其可以用作目的CDR序列可以插入其内以制备针对靶目的抗原的免疫结合剂例如scFv的构架序列。优选地，在本发明的改造方法中使用或由本发明的改造方法产生的免疫结合剂是scFv，但其他免疫结合剂例如全长免疫球蛋白、Fab片段、单结构域抗体(例如Dab)和纳米抗体也可以根据本发明的方法进行改造。本发明还包含了根据改造方法制备的免疫结合齐U，以及包含所述免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。在一个方面，本发明提供了改造免疫结合剂的方法，所述免疫结合剂包含(i )重链可变区或其片段，所述重链可变区包含Vh构架残基，和/或(ii )轻链可变区或其片段，所述轻链可变区包含\构架残基，所述方法包括A)选择在Vh构架残基、' 构架残基或Vh和\构架残基内的一个或多个氨基酸位置用于突变；和B)使选择用于突变的一个或多个氨基酸位置突变，其中选择用于突变的一个或多个氨基酸位置和在所选择的一个或多个位置处插入的一个或多个氨基酸残基在下文进一步详细描述。下文描述的氨基酸位置编号使用AHo编号系统；使用Kabat编号系统的对应位置在本文中进一步描述，并且关于AHo和Kabat编号系统的换算表在实施例I中阐述。使用标准单字母缩写编码阐述氨基酸残基。在一个实施方案中，其中如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在重链可变区，那么突变包括选自下述的一个或多个置换(a)在氨基酸位置I处的Q或E ;(b)在氨基酸位置6处的Q或E ;(c)在氨基酸位置7处的T、S或A，更优选T或A，更加优选T ；(d)在氨基酸位置10处的A、T、P、V或D，更优选T、P、V或D ;(e)在氨基酸位置12处的L或V，更优选L ;(f)在氨基酸位置13处的V、R、Q、M或K，更优选V、R、Q或M ;(g)在氨基酸位置14处的R、M、E、Q或K，更优选R、M、E或Q，更加优选R或E ;(h)在氨基酸位置19处的L或V，更优选L ；(i )在氨基酸位置20处的R、T、K或N，更优选R、T或N，更加优选N ；(j)在氨基酸位置21处的I、F、L或V，更优选I、F或L，更加优选I或L ;(k)在氨基酸位置45处的R或K，更优选K;
(I)在氨基酸位置47处的T、P、V、A或R，更优选T、P、V或R，更加优选R ；(m)在氨基酸位置50处的K、Q、H或E，更优选K、H或E，更加优选K ；(η)在氨基酸位置55处的M或I，更优选I ;(ο)在氨基酸位置77处的K或R，更优选K ；(P)在氨基酸位置78处的Α、V、L或I，更优选A、L或I，更加优选A ；(q)在氨基酸位置82处的E、R、T或Α，更优选Ε、Τ或Α，更加优选E ;Cr)在氨基酸位置86处的Τ、S、I或L，更优选T、S或L，更加优选T ； (S)在氨基酸位置87处的D、S、N或G，更优选D、N或G，更加优选N;(t)在氨基酸位置89处的Α、V、L或F，更优选Α、V或F，更加优选V;(u)在氨基酸位置90处的F、S、H、D或Y，更优选F、S、H或D ;(V)在氨基酸位置92处的D、Q或E，更优选D或Q，更加优选D ；(w)在氨基酸位置95处的G、N、T或S，更优选G、N或T，更加优选G ；(X)在氨基酸位置98处的Τ、A、P、F或S，更优选Τ、A、P或F，更加优选F ；(y)在氨基酸位置103处的R、Q、V、I、M、F或L，更优选R、Q、I、M、F或L，更加优选Y或L ;和(Z)在氨基酸位置107处的N、S或Α，更优选N或S，更加优选N。在另一个实施方案中，其中如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在轻链可变区，那么突变包括选自下述的一个或多个置换(aa)在氨基酸位置I处的Q、D、L、E、S或I，更优选L、E、S或I，更加优选L或E ；(bb)在氨基酸位置2处的S、A、Y、I、P或T，更优选A、Y、I、P或T，更加优选P或T ；(cc)在氨基酸位置3处的Q、V、T或I，更优选V、T或I，更加优选V或T ;(dd)在氨基酸位置4处的V、L、I或M，更优选V或L ;(ee)在氨基酸位置7处的S、E或P，更优选S或E，更加优选S ；(ff)在氨基酸位置10处的T或I，更优选I ;(gg)在氨基酸位置11处的A或V，更优选A ;(hh)在氨基酸位置12处的S或Y，更优选Y ；(ii)在氨基酸位置14处的T、S或A，更优选T或S，更加优选T ;(jj)在氨基酸位置18处的S或R，更优选S ；(kk)在氨基酸位置20处的T或A，更优选A ；(11)在氨基酸位置24处的R或Q，更优选Q ;(mm)在氨基酸位置46处的H或Q，更优选H;(nn)在氨基酸位置47处的K、R或I，更优选R或I，更加优选R ；(OO)在氨基酸位置50处的R、Q、K、E、T或M，更优选Q、K、E、T或M ;(PP)在氨基酸位置53处的K、T、S、N、Q或P，更优选T、S、N、Q或P ;(qq)在氨基酸位置56处的I或M，更优选M ;(rr)在氨基酸位置57处的H、S、F或Y，更优选H、S或F ;(ss)在氨基酸位置74处的1、￥或1'，更优选￥或1\1 ，更加优选1';(tt)在氨基酸位置82处的R、Q或K，更优选R或Q，更加优选R ；
(uu)在氨基酸位置91处的L或F，更优选F ；(W)在氨基酸位置92处的G、D、T或A，更优选G、D或T，更加优选T ；(XX)在氨基酸位置94处的S或N，更优选N ；(yy)在氨基酸位置101处的F、Y或S，更优选Y或S，更加优选S ;和(ZZ)在氨基酸位置 103处的0、？、!13、1^、4、1\￥、5、6或1，更优选!13、1^、4、1\V、S、G或I，更加优选A或V。在一个实施方案中，重链可变区或其片段是VH3家族的，并且因此，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在VH3家族重链可变区，那么突变包括选自下述的一个或多个置换
(i)在氨基酸位置I处的E或Q，更优选Q ;(ii)在氨基酸位置6处的E或Q，更优选Q ;(iii)在氨基酸位置7处的T、S或A，更优选T或A，更加优选T ;(iv)在氨基酸位置89处的A、V、L或F，更优选A、V或F，更加优选V ;和(V)在氨基酸位置103处的R、Q、V、I、L、M或F，更优选R、Q、I、L、M或F，更加优选L ；在另一个实施方案中，重链可变区或其片段是VHla家族的，并且因此，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在VHla家族重链可变区，那么突变包括选自下述的一个或多个置换(i)在氨基酸位置I处的E或Q，更优选E ;(ii)在氨基酸位置6处的E或Q，更优选E ;(iii)在氨基酸位置12处的L或V，更优选L ;(iv)在氨基酸位置13处的M或K，更优选M ；(V)在氨基酸位置14处的E、Q或K，更优选E或Q，更加优选E ;(vi)在氨基酸位置19处的L或V，更优选L ；(vii)在氨基酸位置21处的I或V，更优选I ;(viii)在氨基酸位置90处的F、S、H、D或Y，更优选F、S、H或D ;(ix)在氨基酸位置92处的D、Q或E，更优选D或Q，更加优选D ；(X)在氨基酸位置95处的G、N、T或S，更优选G、N或T，更加优选G ;和(xi )在氨基酸位置98处的Τ、A、P、F或S，更优选Τ、A、P或F，更加优选F。在另一个实施方案中，重链可变区或其片段是VHlb家族的，并且因此，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在VHlb家族重链可变区，那么突变包括选自下述的一个或多个置换(i )在氨基酸位置I处的E或Q，更优选E ；(ii)在氨基酸位置10处的A、T、P、V或D，更优选T、P、V或D ;(iii)在氨基酸位置12处的L或V，更优选L ;(iv)在氨基酸位置13处的K、V、R、Q或M，更优选V、R、Q或M ;(V)在氨基酸位置14处的E、K、R或M，更优选E、R或M，更加优选R ；(vi )在氨基酸位置20处的R、T、K或N，更优选R、T或N，更加优选N ；(vii)在氨基酸位置21处的I、F、V或L，更优选I、F或L，更加优选L ;
(viii)在氨基酸位置45处的R或K，更优选K ；(ix)在氨基酸位置47处的T、P、V、A、R，更优选T、P、V或R，更加优选R ；(X)在氨基酸位置50处的K、Q、H或E，更优选K、H或E，更加优选K ；(xi)在氨基酸位置55处的M或I，更优选I ;(xii)在氨基酸位置77处的K或R，更优选K ；
(xiii)在氨基酸位置78处的A、V、L或I，更优选A、L或I，更加优选A ;(xiv)在氨基酸位置82处的E、R、T或A，更优选E、T或A，更加优选E ；(XV)在氨基酸位置86处的T、S、I或L，更优选T、S或L，更加优选T ；(xvi)在氨基酸位置87处的D、S、N或G，更优选D、N或G，更加优选N ;和(xvii)在氨基酸位置107处的N、S或A，更优选N或S，更加优选N。在另一个实施方案中，轻链可变区或其片段是V K I家族的，并且因此，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在V K I家族轻链可变区，那么突变包括选自下述的一个或多个置换(i)在氨基酸位置I处的D、E或I，更优选E或I，更加优选E ;(ii)在氨基酸位置3处的Q、V或I，更优选V或I，更加优选V ；(iii)在氨基酸位置4处的V、L、I或M，更优选V、L或I，更加优选L ；(iv)在氨基酸位置24处的R或Q，更优选Q ;(V)在氨基酸位置47处的K、R或I，更优选R或I，更加优选R ；(vi)在氨基酸位置50处的K、R、E、T、M或Q，更优选K、E、T、M或Q ;(vii)在氨基酸位置57处的H、S、F或Y，更优选H、S或F，更加优选S ；(viii)在氨基酸位置91处的L或F，更优选F ;和(ix)在氨基酸位置103处的T、V、S、G或I，更优选V、S、G或I，更加优选V。在另一个实施方案中，轻链可变区或其片段是Vk 3家族的，并且因此，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在V K 3家族轻链可变区，那么突变包括选自下述的一个或多个置换(i)在氨基酸位置2处的I或T，更优选T ;(ii)在氨基酸位置3处的V或T，更优选T ;(iii)在氨基酸位置10处的T或I，更优选I ;(iv)在氨基酸位置12处的S或Y，更优选Y;(V)在氨基酸位置18处的S或R，更优选S ;(vi)在氨基酸位置20处的T或A，更优选A ；(vii)在氨基酸位置56处的I或M，更优选M ;(viii)在氨基酸位置74处的I、V或T，更优选V或T，更加优选T ;(ix)在氨基酸位置94处的S或N，更优选N;(X)在氨基酸位置101处的F、Y或S，更优选Y或S，更加优选S ;和(xi)在氨基酸位置103处的V、L或A，更优选L或A，更加优选A。在另一个实施方案中，轻链可变区或其片段是V λ I家族的，并且因此，如果选择用于突变的一个或多个氨基酸位置在V λ I家族轻链可变区，那么突变包括选自下述的一个或多个置换
(i)在氨基酸位置I处的L、Q、S或E，更优选L、S或E，更加优选L;(ii)在氨基酸位置2处的S、A、P、I或Y，更优选A、P、I或Y，更加优选P ;(iii)在氨基酸位置4处的V、M或L，更优选V或M，更加优选V ；(iv)在氨基酸位置7处的S、E或P，更优选S或E，更加优选S ；(V)在氨基酸位置11处的A或V，更优选A ;(vi)在氨基酸位置14处的T、S或A，更优选T或S，更加优选T ;(vii)在氨基酸位置46处的H或Q，更优选H ；
(viii)在氨基酸位置53处的K、T、S、N、Q或P，更优选T、S、N、Q或P ;(ix)在氨基酸位置82处的R、Q或K，更优选R或Q，更加优选R ；(X)在氨基酸位置92处的G、T、D或A，更优选G、T或D，更加优选T ;和(xi )在氨基酸位置103处的D、V、T、H或E，更优选V、T、H或E，更加优选V。在另一个实施方案中，突变进一步包含选自下述的一个或多个(优选所有)重链置换(i)使用AHo或Kabat编号的氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；(ii)使用AHo编号的氨基酸位置103 (使用Kabat编号的氨基酸位置85)处的丝氨酸(S);和(iii)使用AHo编号的氨基酸位置144 (使用Kabat编号的氨基酸位置103)处的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。在另一个方面，本发明提供了分离的抗体构架支架(例如scFv支架)。例如，在多种实施方案中，本发明提供了包含如图9 (SEQ ID N0:1)、

图10 (SEQ ID NO :2)或图11(SEQ ID NO :3)中所示的氨基酸序列的分离的重链构架支架。在另一个示例性实施方案中，本发明提供了包含如图 12 (SEQ ID NO :4)、图 13 (SEQ ID NO :5)或图 14 (SEQ ID NO
6)中所示的氨基酸序列的分离的轻链构架支架。此种支架可以用于改造免疫结合剂，例如scFv抗体。因此，在另一个方面，本发明提供了改造免疫结合剂的方法，所述免疫结合剂包含重链和/或轻链⑶R1XDR2和⑶R3序列，所述方法包括将重链和/或轻链⑶R1XDR2和CDR3序列分别插入重链构架支架内。在特定示例性实施方案中，重链构架支架包含如图9(SEQ ID NO :1)、图 10 (SEQ ID NO :2)、图 11 (SEQ ID NO :3)、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :9中所示的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，重链构架支架包含如图9(SEQ ID NO :1)中所示的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，重链构架支架包含如图10 (SEQ ID NO :2)中所示的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，重链构架支架包含如图11 (SEQ ID NO :3)中所示的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，重链构架支架包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，重链构架支架包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列。在另外一个优选实施方案中，重链构架支架包含SEQ ID NO :9的氨基酸序列。在其他示例性实施方案中，轻链构架支架包含如图12 (SEQ ID N0:4)、图13 (SEQ IDN0:5)、图 14 (SEQ ID N0:6)、SEQ ID NO 10,SEQ ID N0:11 或 SEQ ID NO :12 中所示的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，轻链构架支架包含如图11 (SEQID NO :4)中所示的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，轻链构架支架包含如图12 (SEQ ID NO :5)中所示的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，轻链构架支架包含如图13 (SEQ ID N0:6)中所示的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，轻链构架支架包含如SEQ ID N0:10中所示的氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，轻链构架支架包含如SEQ ID NO : 11中所示的氨基酸序列。在另外一个优选实施方案中，轻链构架支架包含如SEQ ID NO :12中所示的氨基酸序列。优选地，免疫结合剂是scFv抗体，尽管如本文所描述的其他免疫结合剂(例如，全长抗体、Fab、Dab或纳米抗体)也可以根据本发明的方法进行改造。本发明还提供了根据本发明的方法改造的免疫结合剂组合物，例如scFv抗体。附图简述图I是概括根据本发明的方法的scFv的一般的基于序列的分析的流程图。在第一个步骤中，提供了待在溶解性和稳定性方面进行改善的scFv的序列(框1)，其随后与抗体序列数据库进行比较(框2)，例如开放源种系序列数据库(例如，Vbase,IMGT ;框3)、开放源成熟抗体序列数据库(例如，KDB ;框4)或全长人稳定和可溶scFv片段的数据库(例如，QC ;框5)。 应用例如框3中描述的开放源种系序列数据库允许鉴定高度保守的位置，其在进化过程中进行选择，并且因此被认为促成全长抗体背景中的可变结构域的稳定性(框3’)。针对开放源成熟抗体序列数据库4的比较允许鉴定这样的模式，其代表不依赖于各自的⑶R的稳定性、溶解性和/或结合的改善(框4’)。此外，针对全长人稳定和可溶scFv片段的数据库(框5)的比较导致鉴定对于稳定性和/或溶解性关键的残基(特别是在scFv形式中)，以及鉴定这样的模式，其代表特别是在scFv形式，例如VL和VH组合中不依赖于各自的CDR的稳定性、溶解性和/或结合的改善(框5’)。在下一个步骤中(框6)，用各个数据库中鉴定的最频繁的合适氨基酸置换关键残基。最后(框7)，可以在酵母QC系统中进行关键残基的随机或偏好性诱变并且随后就改善的稳定性和/或溶解性进行筛选。突变体可以再次经历上文描述的操作(至框2的箭头)。图2是用于scFv的基于序列的分析的示例性多步骤方法的流程图。在第一个步骤中(框1)，基于生物信息学工具提供的结果，通过比较每个位置处不同氨基酸的出现情况，测定每一个残基在构架中的频率。在第二个步骤中，例如通过使用用式D=Sni (ni-1) /N (N-I)计算的辛普森(Simpson’s)指数,定义每个位置处的保守程度。在第三个步骤中，测定了使总体自由能降到最低的最佳置换(例如，通过应用玻尔兹曼(Boltzmann’s)定律Δ AGth=-RTln (f亲本/f共有区))。最后(步骤4),测定潜在的稳定性突变的作用。为了这个目的，可以考虑因素例如局部和非局部相互作用、规范残基(canonical residue)、界面、暴露程度和β-转角倾向。图3是用于在酵母中选择稳定和可溶scFv的示例性质量控制(QC)系统的示意图。利用这个系统，通过诱导型报告构建体的存在(所述构建体的表达依赖于稳定和可溶scFv-AD-Galllp融合蛋白的存在)选择在还原环境中能够表达稳定和可溶scFv的宿主细胞。融合蛋白与Gal4 (1-100)的相互作用形成激活可选标记的表达的功能转录因子(参见图3A)。不稳定和/或不溶性scFv无法形成功能转录因子并且诱导可选标记的表达，并且因此从选择中排除(图3B)。即使在其中二硫键不折叠的还原条件下，所选择的scFv也能够获得稳定和可溶的蛋白质折叠，而不稳定和/或不溶性scFv趋于去折叠、聚集和/或降解。在氧化条件下，所选择的scFv仍展现优良的溶解性和稳定性特征。
图4是另一个不例性质量控制(QC)系统的不意图。用于选择可溶和稳定scFv的总体概念与图3描述的相同，然而，在这个形式中，scFv与包含活化结构域(AD)和DNA结合结构域(DBD)的功能转录因子直接融合。图4A描述了示例性可溶和稳定scFv,其当与功能转录因子融合时，不阻碍可选标记的转录。相比之下，图4B描述了其中不稳定scFv与转录因子融合而产生无功能融合构建体的情形，所述构建体无法激活可选标记的转录。图5是体细胞突变前在天然种系序列内的特定构架(FW)位置处(图5A)，和在QC系统中选择的体细胞突变后在成熟抗体序列内的相应FW位置处(图5B)的变异性分析的示意图。可以赋予种系和QC序列内分别的FW位置(例如，高度可变构架残基(“hvFR”))不同的变异性值(即，分别为“G”和“Q”值)。如果对于特定位置G>Q，那么在那个位置处存在有限数目的合适的稳定FW残基。如果对于特定位置G〈Q，那么这可能表明该残基已就最佳溶解性和稳定性进行了天然选择。图6描述了在25_95°C下的热诱导胁迫后对于ESBA105变体观察到的变性曲线图。虚线表示具有至种系共有残基的回复突变(V3Q、R47K或V103T)的ESBA-105变体。实线表示包含通过本发明的方法鉴定的优选置换的变体(QC11. 2、QC15. 2和QC23. 2)。 图7描述了包含共有序列回复突变(S-2、D-2、D_3)、至丙氨酸(D_l)或QC残基(QC7. I、QC11. 2、QC15. 2、QC23. 2)的突变的一组ESBA105变体的热稳定性的比较。提供了每种变体的热稳定性(以任意去折叠单位表示)。图8描述了在25-95°C下的热诱导胁迫后对于ESBA212变体观察到的变性曲线图。虚线表示具有至种系共有残基的回复突变(V3Q或R47K)的ESBA-212变体。实线表示亲本ESBA212 分子。图9举例说明了 VHla家族的scFv构架支架。第一行显示使用Kabat系统的重链可变区编号。第二行显示使用AHo系统的重链可变区编号。第三行显示scFv构架支架序列(SEQ ID N0:1)，其中在标记为“X”的那些位置处，该位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸残基占据。标记为“X”的位置以及标记为⑶Rl HlXDR H2和⑶R H3的区域可以由任
何氨基酸占据。图10举例说明了 VHlb家族的scFv构架支架。第一行显示使用Kabat系统的重链可变区编号。第二行显示使用AHo系统的重链可变区编号。第三行显示scFv构架支架序列(SEQ ID NO :2)，其中在标记为“X”的那些位置处，该位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸残基占据。标记为“X”的位置以及标记为⑶Rl HlXDR H2和⑶R H3的区域可以由任何氨基酸占据。图11举例说明了 VH3家族的scFv构架支架。第一行显示使用Kabat系统的重链可变区编号。第二行显示使用AHo系统的重链可变区编号。第三行显示scFv构架支架序列(SEQ ID NO :3)，其中在标记为“X”的那些位置处，该位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸残基占据。标记为“X”的位置以及标记为⑶Rl HlXDR H2和⑶R H3的区域可以由任
何氨基酸占据。图12举例说明了 V K I家族的scFv构架支架。第一行显示使用Kabat系统的轻链可变区编号。第二行显示使用AHo系统的轻链可变区编号。第三行显示scFv轻链构架支架序列(SEQ ID NO :4)，其中在标记为“X”的那些位置处，该位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸残基占据。标记为”的位置以及标记为⑶Rl LlXDR L2和⑶R L3的区域可以由任何氨基酸占据。图13举例说明了 Vk 3家族的scFv构架支架。第一行显示使用Kabat系统的轻链可变区编号。第二行显示使用AHo系统的轻链可变区编号。第三行显示scFv轻链构架支架序列(SEQ ID N0:5)，其中在标记为“X”的那些位置处，该位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸残基占据。标记为”的位置以及标记为⑶Rl LI、⑶R L2和⑶RL3的区域可以由任何氨基酸占据。图14举例说明了 VLl家族的scFv构架支架。第一行显示使用Kabat系统的轻链可变区编号。第二行显示使用AHo系统的轻链可变区编号。第三行显示scFv轻链构架支架序列，其中在标记为“X”的那些位置处，该位置可以由“X”下所列出的任何氨基酸残基占据。标记为”的位置以及标记为⑶Rl LlXDR L2和⑶R L3的区域可以由任何氨基酸 占据。在特定的优选实施方案中，在⑶R LI内的AHo位置58和67-72分别由下述残基占据D 和 NNQRPS。图15描述了野生型ESBA105及其可溶性变体的PEG沉淀溶解度曲线。图16描述了如在广泛温度范围(25_96°C)下的热攻击后测量的野生型ESBA105及其可溶性变体的热变性曲线图。图17描述了 SDS-PAGE凝胶，其显示了在热胁迫条件下温育2周后各种ESBA105可溶性突变体的降解行为。发明详述本发明涉及用于免疫结合剂性质，特别地scFv性质(包括但不限于稳定性、溶解性和/或亲和力)的基于序列的改造和优化的方法。更具体地，本发明公开了使用抗体序列分析鉴定scFv中待突变的氨基酸位置来优化scFv抗体,从而提高scFv的一个或多个物理性质的方法。本发明还涉及按照本发明的方法产生的或可获得的经改造的免疫结合剂例如ScFv0本发明至少部分基于抗体序列的多个数据库中的各重链和轻链构架位置上的氨基酸频率的分析。特别地，已将抗体序列数据库(例如，种系抗体序列数据库或成熟抗体数据库，例如Kabat数据库)的频率分析与因具有期望的功能性质而被选择的scFv序列的数据库的频率分析相比较。通过给各构架位置的变异性程度赋值(例如，通过使用辛普森指数)和通过比较不同类型的抗体序列数据库中的各构架位置上的变异性程度，现已能够鉴定对于scFv的功能性质(例如，稳定性、溶解性)是重要的构架位置。这现允许对构架氨基酸位置定义“功能共有区”，其中已鉴定了比免疫球蛋白序列(例如种系或成熟免疫球蛋白序列)中的相应位置更耐受变异性或更不耐受变异性的构架位置。因此，本发明提供基于功能性选择的scFv序列的数据库的使用的“功能共有区”方法并证明了其优点。此外，本发明提供了通过突变使用本文中描述的“功能共有区”方法鉴定的特定构架氨基酸位置来对免疫结合剂(例如，scFv)进行改造的方法。首先定义某些术语，这样可使本发明更容易被理解。除非另外指出，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的技术人员通常理解的意义相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但下面描述了适当的方法和材料。本文中提及的所有公开物、专利申请、专利和其他参考资料以它们的全文通过引用合并入本文。在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例只是举例说明性的而非限定性的。本文中使用的术语“抗体”是免疫球蛋白的同义词。根据本发明的抗体可以是完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一个可变结构域，例如单个可变结构域，Fv (Skerra A.和 Pliickthun, A. (1988) Science240 :1038-41)、scFv (Bird, R. E.等人(1988) Science2M :423-26 ;Huston，J. S.等人(1988 ;Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-83)，Fab、(Fab’ ) 2、或本领域技术人员熟知的其他片段。本文中使用的术语“抗体构架(antibody framework)”是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环的支架(Kabat, E. A.等人，(1991) Sequencesof proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242)。本文中使用的“抗体⑶R”是指抗体的互补决定区，其如Kabat E. A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242)定义的由抗原结合环组成。抗体Fv片段的两个可变结构域中的每一个包含例如3个⑶R。 术语“单链抗体”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变区(Vh)和抗体轻链可变区(')的分子。此类scFv分子可具有一般结构=NH2-V^接头-Vh-COOH或NH2-Vh-接头-VfCOOH。如本文中所使用的，“同一性”是指两个多肽、分子之间或两个核酸之间匹配的序列。当两个进行比较的序列中的位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据(例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的位置都被赖氨酸占据)时，各个分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目再乘以100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，通过计算机程序例如Align程序(DNAstar，Inc.)方便地进行的 Needleman 等人(1970) J. Mol. Biol. 48 :443-453 的方法来提供。“相似的”序列是当比对时共有相同和相似氨基酸残基的序列，其中相似的残基是进行比对的参照序列中的相应氨基酸残基的保守置换。在这点上，参照序列中的残基的“保守置换”是用在物理或功能上与相应的参照残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。因此，“经保守置换修饰的”序列是与参照序列或野生型序列相异在于存在一个或多个保守置换的序列。两个序列之间的“百分数相似性”是包含由两个序列共有的匹配残基或保守置换的位置数目除以进行比较的位置数目再乘以100的函数。例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配以及10个位置中有2个包含保守置换，那么这两个序列具有80%的正相似性。本文中使用的“氨基酸共有序列”是指可使用至少两个，优选更多的进行比对的氨基酸序列的矩阵产生的氨基酸序列(允许在比对中出现缺口)，其使得可能确定各位置上出现频率最闻的氣基酸残基。共有序列是包含在各位置上出现频率最闻的氣基酸的序列。如果两个或更多个氨基酸等同地出现在单个位置上，那么共有序列包括两个或所有此类氨基酸。可在不同水平上分析蛋白质的氨基酸序列。例如，可在单个残基水平、多个残基水平、具有缺口的多个残基水平等上展示保守性或变异性。残基可展示相同残基的保守性或可在种类水平上保守。氨基酸种类的实例包括极性但不带电荷的R组(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；带正电荷的R组(赖氨酸、精氨酸和组氨酸);带负电荷的R组(谷氨酸和天冬氨酸);疏水R组(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他种类对于本领域技术人员来说是已知的并且可使用结构测定法或其他数据来定义以估量可置换性。在该意义上，可置换的氨基酸可以指可在该位置上进行置换并且保持功能保守性的任何氨基酸。如本文中所使用的，当一个氨基酸序列(例如，第一 Vh或\序列)与一个或多个另外的氨基酸序列(例如，数据库中的一个或多个VH或VL序列)比对时，可将一个序列(例如，第一 Vh或\序列)中的氨基酸位置与一个或多个另外的氨基酸序列中的“相应位置”相比较。如本文中所使用的，“相应位置”表示当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性或百分数相似性时进行比较的序列中的等同位置。如本文中所使用的，术语“抗体数据库”是指两个或更多个抗体氨基酸序列(“多 个”序列)的集合，通常是指数十个、数百个或甚至数千个抗体氨基酸序列的集合。抗体数据库可存储例如抗体Vh区、抗体' 区或两者的集合的氨基酸序列，或可存储由V1^P \区域组成的scFv序列的集合。优选，可将数据库存储在可检索的、固定的介质中，例如计算机上可检索的计算机程序中。在一个实施方案中，抗体数据库是包含或由种系抗体序列组成的数据库。在另一个实施方案中，抗体数据库是包含或由成熟(即，表达的)抗体序列组成的数据库(例如，成熟抗体序列的Kabat数据库，例如KBD数据库)。在另一个实施方案中，抗体数据库包含或由功能性选择的序列(例如，根据QC测定选择的序列)组成。术语“免疫结合剂”是指分子，所述分子包含抗体的全部或部分抗原结合位置，例如重链和/或轻链可变结构域的全部或一部分，这样免疫结合剂能够特异性识别靶抗原。免疫结合剂的非限定性实例包括全长免疫球蛋白分子和scFv，以及抗体片段，包括但不限于⑴Fab片段，由Vh、(^和ChI结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有铰链区的一部分的 Fab (参见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul 编辑，3. sup. rd ed. 1993) ; (iv)由Vh和ChI结构域组成的Fd片段；(V)由抗体的单臂的\和Vh结构域组成的Fv片段；(vi)单结构域抗体例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature 341 :544-546),其由Vh或Vl 结构域组成，Camelid (SlHamers-Casterman,等人，Nature 363:446-448 (1993)和 Dumoulin 等人，Protein Science 11 :500-515 (2002))或 Shark 抗体(例如，sharkIg-NARs ISianohodk1S^));和(vii)纳米抗体(Nanobody),包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。如本文中所使用的，术语“功能性质”是例如为了提高多肽的生产性质或治疗功效，其提高(例如相对于常规多肽)对于本领域技术人员来说是期望的和/或有利的多肽(例如，免疫结合剂)的性质。在一个实施方案中，功能性质是提高的稳定性(例如，热稳定性)。在另一个实施方案中，功能性质是提高的溶解性(例如，在细胞条件下)。在另一个实施方案中，功能性质是非聚集性。在另一个实施方案中，功能性质是表达(例如，在原核细胞中)的提高。在另一个实施方案中，功能性质是在内含体纯化方法后重折叠产量的提高。在某些实施方案中，功能性质不是抗原结合亲和力的提高。
scFv的某于序列的分析本发明提供了用于分析scFv序列的方法，其允许鉴定scFv序列中选择用于突变的氨基酸位置。选择用于突变的氨基酸位置是经预测影响scFv的功能性质例如溶解性、稳定性和/或抗原结合的氨基酸位置，其中预测该位置上的突变提高scFv的性能。因此，本发明允许对scFv进行比简单随机突变scFv序列中的氨基酸位置更集中的改造以优化性能。在图I的流程图中示意性地图解了 scFv序列的基于序列的分析的某些方面。如该图中所示的，将要优化的scFv序列与一个或多个抗体数据库(包括由因稳定和可溶而被选择的scFv序列组成的抗体数据库)中的序列相比较。这可允许鉴定特别地scFv形式中对于稳定性和/或溶解性至关重要的残基，以及鉴定特别地在scFv形式(例如，Vl和Vh的组合)中显示不依赖于各自CDR的稳定性、溶解性和/或结合的提高的模式。在鉴定了至关重要的残基后，它们就可用例如在各自数据库中鉴定的出现频率最高的适当的氨基酸进行置换，和/或通过随机或偏好性诱变进行置换。
因此，在一个方面，本发明涉及鉴定单链抗体(scFv)中用于突变的氨基酸位置的方法，所述scFv具有Vh和\氨基酸序列，该方法包括a)将scFv VH,VL或Vh和\氨基酸序列输入包含许多抗体VH、'或Vh和\氨基酸序列的数据库，以使scFv VH、Vl或Vh和\氨基酸序列与数据库的抗体VH、Vl或Vh和\氨基酸序列比对；b)将scFv Vh或\氨基酸序列中的氨基酸位置与数据库的抗体Vh或\氨基酸序列中的相应位置相比较；c)确定scFv Vh或\氨基酸序列中的氨基酸位置是否被在数据库的抗体Vh或\氨基酸序列中的相应位置上保守的氨基酸残基占据；和d)当氨基酸位置被在数据库的抗体Vh或'氨基酸序列中的相应位置上不保守的氨基酸残基占据时，将scFv Vh或'氨基酸序列中的氨基酸位置鉴定为用于突变的氨基酸位置。因此，在本发明的方法中，将目的scFv的序列(S卩，VH、'或两者的序列)与抗体数据库的序列相比较，然后确定目的scFv中的氨基酸位置是否被在数据库中的序列的相应位置上“保守的”氨基酸残基占据。如果scFv序列的氨基酸位置被在数据库的序列中的相应位置上不“保守的”氨基酸残基占据，则scFv的该氨基酸位置选择用于突变。优选，被分析的氨基酸位置是目的scFv中的构架氨基酸位置。更优选，可分析目的scFv中的每一个构架氨基酸位置。在备选的实施方案中，可分析目的scFv的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸位置。在另外的实施方案中，可分析目的scFv中的各氨基酸位置。为了确定氨基酸残基在抗体数据库的序列中的特定氨基酸位置(例如，构架位置)上是否“保守”，可计算在特定位置上的保守程度。存在许多不同的本领域内已知的可定量给定的位置上的氨基酸多样性的方法，其全都可用于本发明的方法。优选，使用辛普森多样性指数计算保守程度，该指数是多样性的量度。其考虑到存在于各位置上的氨基酸的数目，以及各氨基酸的相对丰度(abundance)。辛普森指数(S. I.)代表两个随机选择的抗体序列在某些位置包含相同的氨基酸的概率。当测量保守性时，辛普森指数考虑了两个主要因素，丰富度(richness)和均匀度(evenness)。如本文中所使用的，“丰富度”是存在于特定位置上的氨基酸的不同种类的数目的量度(即，数据库中在该位置上显示的不同氨基酸残基的数目是丰富度的量度)。如本文中所使用的，“均匀度”是存在于特定位置上的氨基酸中的每一个的丰度的量度(即，数据库的序列中氨基酸残基在该位置上发生的频率是均匀度的量度)。虽然残基丰富度独自可用作检查特定位置上的保守程度的量度，但其没有考虑存在于某些位置上的各氨基酸残基的相对频率。其对在数据库的序列中的特定位置上极少发生的氨基酸残基与对在相同位置以极高的频率发生的残基给予同样的权重。均匀度是组成位置的丰富度的不同氨基酸的相对丰度的量度。辛普森指数将两者(丰富度和均匀度)都考虑到了，从而是按照本发明定量保守程度的优选方法。特别地，在非常保守的位置上的低频率残基被认为是潜在有问题的，从而其可选择用于突变。辛普森指数的公式为D= Σ Iii (Iii-I) /N(N-I)，其中N是调查的序列(例如，在数据库中)的总数，Iii是各氨基酸残基在被分析的位置上的频率。氨基酸事件(i)在数据库中的频率是氨基酸在数据库中发生的次数00。计数Iii本身以相对频率给出，其表示它们按照事 件的总数进行了标准化。当最大多样性发生时，S. I.值是0，当最小多样性发生时，S. I.值是I。因此S.I.的范围是O至1，多样性和指数值呈负相关。在图2中更详细地描述了概述用于分析数据库的序列中的构架氨基酸位置的多个步骤的流程图。因此，在上述方法的优选实施方案中，使用辛普森指数给数据库的抗体Vh或 '氨基酸序列中的相应位置的保守程度赋值。该相应位置的S. I.值可用作该位置的保守性的指标。在其他实施方案中，将密切相关的抗体序列的可信比对(trusted alignment)(即，考虑蛋白质结构相似性的序列比对)，用于本发明以产生氨基酸的相对丰度和确定的位置的保守程度的矩阵。这些矩阵经设计用于抗体-抗体数据库比较。计算各残基的观察到的频率，并且将其与预期的频率(其基本上是数据集中各残基对于各位置的频率)相比较。使用所述方法对给定的scFv抗体进行的分析提供了关于给定的scFv抗体中的某些位置上的生物学上允许的突变和罕见残基的信息，以及允许预测其构架中的潜在弱点。可将常规技术用于对“最佳”拟合一组氨基酸-频率数据的氨基酸置换进行工程设计(使用
S.I.值和相对频率作为标准)。上述基于序列的分析可用于scFv的Vh区域，scFv的\区域或两者。因此，在一个实施方案中，将scFv Vh氨基酸序列输入数据库并且与数据库的抗体Vh氨基酸序列比对。在另一个实施方案中，将scFv '氨基酸序列输入数据库并且与数据库的抗体'氨基酸序列比对。在另一个实施方案中，将scFv V1^P'氨基酸序列输入数据库并且与数据库的抗体Vh和\氨基酸序列比对。用于将一个序列与数据库中的其他序列的集合进行比对的算法在本领域内已良好地建立。将序列进行比对以获得序列之间的最高百分数同一性或相似性。本发明的方法可用于分析scFv序列中的一个目的氨基酸位置或更优选，可用于分析多个目的氨基酸位置。因此，在上述方法的步骤b)中，可将scFv VH*'氨基酸序列中的多个氨基酸位置与数据库的抗体Vh或\氨基酸序列中的相应位置相比较。要分析的优选位置是scFv的Vh和/或\序列中的构架位置(例如，可分析各VH和VL构架位置)。另外或备选地，可分析scFv的一个或多个⑶R中的一个或多个位置(虽然突变⑶R中的氨基酸位置可能不是优选的，因为CDR中的突变比构架区中的突变更可能影响抗原结合活性)。此外，本发明的方法允许分析scFv VH、'或Vh和'氨基酸序列中的各氨基酸位置。在本发明的方法中，可将目的scFv的序列与多种不同类型的抗体序列数据库的一种或多种中的序列相比较。例如，在一个实施方案中，数据库的抗体VH、'或Vh和\氨基酸序列是种系抗体VH、Vl或Vh和\氨基酸序列。在另一个实施方案中，数据库的抗体VH、Vl或Vh和\氨基酸序列是重排的亲和力成熟的抗体VH、'或Vh和\氨基酸序列。在另一个优选实施方案中，数据库的抗体VH、'或Vh和\氨基酸序列是因具有至少一种期望的功能性质例如scFv稳定性或scFv溶解性而被选择(下面进一步论述的)的scFv抗体VtnVlj或％和\氨基酸序列。可从种系序列的序列比对或从天然发生的任何其他抗体序列获得、汇编和/或产生抗体序列信息。序列的来源可包括但不限于一种或多种下列数据库 · Kabat 数据库(· immuno. bme. nwu. Edu (到 2007 年 10 月为止)；Johnson 和 Wu(2001) Nucleic Acids Res. :205-206 ;Johnson 和 Wu (2000) Nucleic Acids Res. 28 214-218)。来自2000年的原始数据可通过在美国的FTP和在英国的镜像获得。·Kabatman包含允许用户就序列的罕见特征检索Kabat序列和使用户能够发现对于特定抗体序列中的⑶R的正则分配(canonical assignment)的数据库。· AAAAA 网站(www. bioc. unizh. ch/antibody/ (到 2007 年 10 月为止))，由Annemarie Honegger制作的提供关于抗体的序列信息和结构数据的抗体网页。· ABG :抗体的 3D 结构的目录(directory)-由 Antibody Group (ABG)产生的目录允许用户访问汇编在Protein Data Bank (PDB)中的抗体结构。在该目录中，各PDB条目(entry)具有至原始来源的超链接，从而使重新获得全部信息变得容易。· ABG 小鼠VH和VK种系区段的种系基因目录，在Instituto deBiotecnologia, UNAM(National University of Mexico)的 Antibody Group 的网页的一部分。· IMGT ，国际免疫遗传学信息系统馨(international ImMunoGeneTicsinformation system )-由 Marie-Paule Lefranc (UniversiteMontpellier II, CNRS)于1989年创建，IMGT是专门于人和其他脊椎动物物种的免疫系统的免疫球蛋白、T细胞受体和相关蛋白质的集成知识资源。IMGT由序列数据库(IMGT/LIGM-DB，来自人和其他脊椎动物的IG和TR的综合数据库，具有完全注释的序列的翻译，IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMER-DB)、基因组数据库(MGT/GENE-DB)、结构数据库aMGT/3Dstructure_DB)、网络资源(MGTRepertoire)组成(IMGT, the international ImMunoGeneTics information S》...Stem ;imgt.cines.fr (到 2007 年 10 月为止)；Lefranc 等人(1999) Nucleic Acids Res. 27 209-212 ;Ruiz 等人(2000)Nucleic Acids Res. 28 :219-221 ;Lefranc 等人(2001)NucleicAcids Res. 29 :207-209 ;Lefranc 等人(2003) Nucleic Acids Res. 31 :307_310)。·ν BASE -从一千多个公开序列(包括目前从Genbank和EMBL数据库释放的序列)汇编的所有人种系可变区序列的综合目录。在优选实施方案中，从scFv文库获得抗体序列信息，所述scFv文库具有已在还原性环境中就增强的稳定性和溶解性进行选择的确定的构架。更特别地，已描述了允许细胞内选择在还原性环境中具有增强的稳定性和溶解性的scFv构架的酵母质量控制(QC)-系统(参见例如，PCT
发明者D·尤里奇, L·博拉斯 申请人:艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司