专利名称：与神经增殖功能相关的大鼠源miRNA、相应的miRNA前体和反义寡核苷酸及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学专业领域，涉及与神经增殖功能相关的大鼠源miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，以及在制备治疗神经再生药物中的用途。
背景技术：
周围神经损伤是常见的临床病症，而周围神经损伤后能够再生。miRNACmicroRNA,微RNA)是一类具有19 25nt的RNA分子，由其前体分子在酶的作用下加工生成，其前体序列一般为70 120nt，广泛存在于生物体中。由于miRNA在各种生物体中具有保守性，因此普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程；在动物机体，miRNA通过转录后调控许多基因和蛋白的表达，在发育、分化、增殖、细胞的存活与癌变以及神经系统等发挥重要作用。基础和临床研究表明，miRNA无论在正常生理过程还是在疾病过程中都是重要 的调节因子。许多miRNA呈现组织特异性表达，因此在调控组织特异性和组织特异性基因的功能中发挥重大作用。近年来的研究发现miRNA与神经再生有着极为密切的关系，例如，miRNA在轴突生长及突触功能和可塑性等方面具有调控作用。虽然已经在各种生物发现了相当数量的miRNA，但仍不断有许多新的miRNA被挖掘，特别是那些在特定组织或特定阶段表达的miRNA。周围神经损伤和再生过程中，许多基因和蛋白的表达水平发生改变，而单个miRNA能够调控成千上百个靶基因的表达，因此作为转录后调控的miRNA的发现和功能鉴定对基于miRNA的周围神经损伤的修复具有十分重要的意义。
发明内容
由于各种意外造成的神经损伤的发病率逐年增加；而神经损伤后，再生能力差，致残率高，因此本发明针对神经损伤和治疗的生物分子的发现具有重要的应用价值。本发明以大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和近端神经为材料进行miRNA的Solexa测序。测序结果经过SOAP软件与大鼠基因组序列比对，MIREAP软件分析miRNA前体的发夹结构，滤掉自由能大于-20 kcal/mol的候选miRNA,基于miRBasel7. O过滤掉已报道的miRNA，MiPred软件进一步过滤掉功能上非保守的虚拟的miRNA前体等生物信息学分析，并进一步通过RT-PCR验证。然后对这些新的miRNA进行功能筛选，结果发现了与增殖有关的miRNA。本发明所提供的miRNA克隆自大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和近端神经，成熟miRNA序列长度约为22nt，其前体序列具有miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA的结构特征。本发明的目的是提供一种与神经增殖功能相关的大鼠源miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸序列，以及该发明所涉及的miRNA、miRNA前体和其反义寡核苷酸在制备神经损伤药物中的用途。本发明的具体技术方案如下
本发明所提供的与神经增殖功能相关的大鼠源miRNA序列如下miRNA-sx8 5CAUAAGUGUAGAGAGUCUGUAGU -3’，染色体定位 lq31 。据此，本发明所提供的与神经增殖功能相关的大鼠源miRNA的前体RNA序列如下
miRNA-sx8 前体
5，-GAUG⑶腳GGAGACACAGCUUCUCUUCACUUAUUAUAUUUCAUUCCUUAUAA UCAUAAGUGUAGAGAGUCUGUAGUCACCACCCAU -3，。据此，本发明所提供的与神经增殖功能相关的大鼠源miRNA的反义寡核苷酸序列如下
miRNA-sx8 反义寡核苷酸 5’ - ACTACAGACTCTCTACACTTATG -3 ’。本发明提供的miRNA及其前体序列、反义寡核苷酸序列也可采用化学合成的方法得到；为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行硫代修饰或甲氧基修饰，也可采取两种方法结合修饰。本发明提供的miRNA及其前体序列、反义寡核苷酸序列可用于制备治疗周围神经损伤修复的药物。可以以其单独或混合形式为有效组分配制成非肠道给药制剂，依据给药模式、受害者的体征以适量剂量给药，也可采用基因治疗的方法，以治疗或病毒为表达载体，使其在周围神经损伤部位高效表达。
图I为本发明所述的miRNA及其前体和反义寡核苷酸序列。图2为本发明所述的miRNA RT-PCR电泳结果。图3为本发明所述的miRNA转染施万细胞后对施万细胞增殖的影响图示。图4为本发明所述的miRNA转染施万细胞后对施万细胞增殖的影响结果。图5为本发明所述的miRNA的靶基因双报告基因系统分析结果。
具体实施例方式以下通过实施例说明本发明的具体工艺步骤，但不受实施例限制。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例I动物模型构建和样品制备
成年雄性 SD 大鼠(180 220g)被麻醉后(10 mg/kg xylazine, 95 mg/kg keUamine,acepromazine 0.7 mg/kg),左后肢外侧坐骨神经被切开一个I cm长的切口，然后皮肤被缝合。动物饲养在合适的温度和湿度条件下进行，每天12 h光照，自由饮水和采食。坐骨神经切断后的0，I, 4，7和14天，处死大鼠，取大鼠坐骨神经离断后的L4-6背根神经节和坐骨神经缺口处向上O. 5 cm的近端神经用于分析。实施例2 RNA提取和Solexa测序
(I)RNA提取取大鼠近端神经样品，用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA,操作步骤按Trizol试剂盒自带说明书进行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度计(AmershamBiosciences)测定提取的RNA在260nm (OD260)和280nm (OD28tl)波长的吸光度值以确定RNA的纯度和浓度。质量合格的RNA浓度应在I μ g/ μ I以上，0D26(l/0D28(l的比值在I. 8-2. O之间，且经电泳检测条带清晰，无明显降解和DNA污染。(2)小RNA文库的构建
将质量合格的大鼠总RNA用于构建小RNA文库，构建好的文库采用Solexa测序高通量测序(北京基因组研究所)。18 30 nt的小RNA经过凝胶纯化，连接到Solexa测序接头，连接产物被纯化、逆转录和PCR扩增。扩增产物经过凝胶纯化后进行测序，测序得到的图像文件被转换成数字信号，在移去杂质信号和接头序列后，结果被计算机分析处理。(3) miRNA 的筛选
从Solexa测序得到的小分子RNA序列首先用SOAP软件与大鼠基因组序列比对(LiRj Li Y， Kristiansen K， Wang J. 2008. SOAP: short oligonucleotide alignmentprogram. Bioinformatics 24:713-714) ；MIREAP 用来分析候选 miRNA 的发夹结构(Chen X，Li Q，Wang J，Guo X，Jiang X，Ren Z，Weng C，Sun G，Wang X，Liu Y，Ma Lj Chen JYj Wang J，Zen K，Zhang J，Zhang CY. 2009. Identification andcharacterization of novel amphioxus microRNAs by Solexa sequencing. GenomeBiol 10:R78);滤掉自由能大于-20 kcal/mol 的候选 miRNA (Wang X，Zhang J，Li F，GuJj He Tj Zhang X，Li Y. 2005. MicroRNA identification based on sequence andstructure alignment. Bioinformatics 21:3610-3614);基于 miRBasel7. 0，过滤掉已报道的 miRNA (Griff iths-Jones S，Saini HKj van DSj Enright AJ. 2008. miRBase:tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res 36:D154_D158) ;MiPred进一步过滤掉功能上非保守的虚拟的 miRNA 前体(pre-miRNA) ( Jiang P，Wu H，Wang Wj Ma Wj SunX， Lu Z. 2007. MiPred: classification of real and pseudo microRNA precursorsusing random forest prediction model with combined features. Nucleic Acids Res35:W339-W344)。(4) RT-PCR 分析
同Solexa测序的小分子RNA用来进行定量RT - PCR分析；10 ng的RNA用茎环逆转录引物(RT-miRNA-sx8)和TaqMan反转录试剂盒(ABI)逆转录到cDNA。然后进行PCR实验，用三蒸水作为阴性模板对照，进行PCR分析，PCR条件为94°C 30 sec，60°C I min，72°C 20sec, 30 cycle。本发明所述的miRNA及其前体以及反义寡核苷酸的引物序列如下，图2为对应电
泳结果。引物序列如下
权利要求
1.与神经增殖功能相关的大鼠源miRNA，具有如下核苷酸序列 miRNA-sx8 5’ - CAUAAGUGUAGAGAGUCUGUAGU -3’，染色体定位 lq31 。
2.如权利要求I所述的大鼠源miRNA的前体RNA，具有如下核苷酸序列 miRNA-sx8 前体 5，-GAUG⑶腳GGAGACACAG⑶腳⑶UCA⑶UAUUAUAUUUCAUUC⑶UAUAAUCAUAA⑶⑶AGAGA⑶CUGUAGUCACCACCCAU -3'
3.如权利要求I所述的大鼠源miRNA的反义寡核苷酸，具有如下核苷酸序列 miRNA-sx8 反义寡核苷酸 5’ - ACTACAGACTCTCTACACTTATG -3’。
4.如权利要求1-3所述的核苷酸，其特征在于对该序列进行了硫代修饰、甲氧基修饰或两者的结合修饰。
5.如权利要求1-3所述的核苷酸，其特征在于该序列通过化学合成获得。
6.如权利要求1-3所述的核苷酸，其特征在于该序列通过构建真核细胞表达载体进行表达获得。
7.如权利要求6所述的核苷酸，其特征在于所述载体为质粒载体或病毒载体。
8.如权利要求3所述的反义寡核苷酸，该核苷酸选自DNA或RNA。
9.如权利要求1-3所述核苷酸序列在制备治疗周围神经损伤药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了与大鼠坐骨神经离断过程中神经增殖功能相关的大鼠源miRNA、其前体序列和反义寡核苷酸序列，以及其在制备治疗周围神经损伤药物中的用途。
文档编号A61P25/02GK102864149SQ20121039437
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月17日 优先权日2011年10月24日
发明者王勇军, 李石营, 顾晓松, 丁斐, 于彬, 顾芸, 周松林 申请人:南通大学