专利名称：一种奇异变形菌及其在微生物被膜抑制和减毒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种与生物被膜抑制和减毒相关的细菌菌株，特别涉及一种与生物被膜抑制和减毒相关的奇异变形菌(Proteus mirabilis)及其应用。
背景技术：
众所周知，在当今生物及医药领域，对抗细菌的入侵和感染的主要方法是使用抗生素。但是抗生素的频繁使用，却使细菌产生了日趋严重的耐药性，大大降低抗生素的治疗效果。最近，更是出现了“超级细菌”，对抗生素完全免疫。这无疑为人类与动植物的健康敲响了警钟。因此，寻找治疗细菌感染的新方法已成为燃眉之急。研究表明，细菌产生耐药性的原因主要来自两个方面一方面是因为抗生素对病原菌产生胁迫压力，而病原菌在压力下产生适应性变异；另一方面是因为在正常情况下，致病菌会形成微生物被膜，为其提供一层保护屏障。细菌生物被膜，是指细菌吸附于惰性物体 如医学材料或机体黏膜表面后，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖蛋白复合物，使细菌相互粘连并将自身菌落聚集缠绕其中形成的膜样物。现已证实约有90%的微生物生活在微生物被膜(bacterial biofilm, BF)系统中，80%的细菌性疾病与细菌生物膜有关。受微生物被膜的保护，大多数药物只能杀灭微生物被膜表面的微生物，而微生物被膜内部的微生物则是产生变异的主要原因。由于微生物被膜在病原菌耐药性方面的巨大作用，因此，通过干扰或抑制病原菌微生物被膜来减弱其致病性已成为防治细菌性疾病的新思路。微生物被膜抑制剂主要通过抑制微生物之间的群体交流达到控制毒力释放并抑制生物膜结构的目的，它并不对微生物本身进行杀灭，因此，不会对微生物的生存产生压力，也就不会导致新的“耐药性”产生。它不仅可以控制病原微生物的毒性，而且可以通过抑制微生物的生物被膜，使病原微生物丧失保护，增加对普通药物的易感性。因此，微生物被膜抑制剂很有可能成为“超级抗生素”，实现对多种致病菌甚至包括“超级细菌”的控制。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与生物被膜抑制和减毒相关的细菌菌株。本发明所提供的细菌菌株具体为奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#,该菌株已于2012年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏登记号为 CGMCC No. 6426。所述奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426为革兰氏阴性菌，菌落成淡黄色，表面湿润、表面平坦、边缘放射状，在显微镜下观察为短棒状。生理生化特征实验结果显示明胶水解阳性，鸟氨酸脱羧酶阳性，尿素酶阳性，木糖阳性。其16s rDNA的序列详见序列表中序列I。本发明的另一个目的是提供一种制剂。本发明所提供的制剂的活性成分为所述奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426 的代谢物。所述奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426,或所述制剂在如下(al)- (a3)中的应用也属于本发明的保护范围(al)制备抑制病原菌生物被膜形成的产品；(a2)制备抑制病原囷毒力因子的广品；(a3)鉴定病原菌生物被膜抑制菌。
所述奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426,或所述制剂在如下(bl)- (b4)中的应用也属于本发明的保护范围(bl)制备降低病原菌生物被膜形成总量的产品；(b2)制备抑制病原囷弹性蛋白酶广生量的广品；(b3)制备抑制病原菌水解酶产生量的产品；(b4)制备与抗生素共同作用提高对病原菌的杀伤效率的产品。在上述应用中，所述病原菌具体可为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),其对应的抗生素为卡那霉素。在上述应用中，所述水解酶具体可为葡萄糖苷酶、磷酸酶或脂酶。本发明的再一个目的是提供所述制剂的制备方法。本发明所提供的所述制剂的制备方法具体可包括如下步骤发酵培养所述奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426,收集发酵产物(即所述奇异变形菌(Proteusmirabilis) 10#CGMCC No. 6426的代谢物)，获得所述制剂。在上述方法中，所述发酵培养的温度可为28 37°C。在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的温度具体为30°C。所述发酵培养的时间可为24-36小时；所述发酵培养的方式可为旋转震荡培养，所述旋转震荡培养的转速可为150-220转/分钟，具体如220转/分钟，旋转半径可为13. 5cm ；所述发酵培养的培养基为LB液体培养基，具体的溶质为蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，溶剂为水，所述蛋白胨在所述培养基中的终浓度为10g/L，所述酵母提取物在所述培养基中的终浓度为5g/L，所述氯化钠在所述培养基中的终浓度为10g/L ;所述培养基的pH可为7. O。在上述方法中，在所述收集发酵产物的步骤后还可包括将所述发酵产物离心，取上清过滤，获得滤液的步骤。在本发明的一个实施例中，所述滤液即为所述制剂。在本发明的一个实施例中，所述离心的转速具体为12000r/min，所述离心的时间具体为20min，所述离心半径具体为13. 5cm，所述离心温度具体为4°C ;所述过滤采用的滤膜孔径具体为0. 22 μ m。本发明的还一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定病原菌生物被膜抑制菌的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定病原菌生物被膜抑制菌的方法具体可为如下(A)或(B)所述(A)具体可包括如下(I)和(2)的步骤(I)向所述病原菌的生长体系中添加待检测菌的发酵产物作为实验组，以不添加所述待检测菌的发酵产物的空白中所述病原菌的生长体系作为对照组；检测所述实验组和所述对照组中所述病原菌的生物被膜的形成总量；(2)根据如下方法判断所述待检测菌是否为所述病原菌的生物被膜抑制菌若所述实验组中所述病原菌的生物被膜形成总量低于(统计学上显著低于)所述对照组中所述病原菌的生物被膜形成总量，则所述待检测菌为或候选为所述病原菌的生物被膜抑制菌；反之，则所述待检测菌不为或候选不为所述病原菌的生物被膜抑制菌。所述(B)具体可包括如下(3)和(4)的步骤(3)向所述病原菌的生长体系中添加待检测菌的发酵产物作为实验组，以不添加所述待检测菌的发酵产物的空白中所述病原菌的生长体系作为对照组；检测所述实验组和所述对照组中所述病原菌的毒力因子的产生量；(4)根据如下方法判断所述待检测菌是否为所述病原菌的生物被膜抑制菌若所述实验组中所述病原菌的毒力因子的产生量低于(统计学上显著低于)所述对照组中所述病原菌的毒力因子的产生量，则所述待检测菌为或候选为所述病原菌的生物被膜抑制菌； 反之，则所述待检测菌不为或候选不为所述病原菌的生物被膜抑制菌。在上述方法中，所述实验组中，所述待检测菌的发酵产物在所述病原菌的生长体系中的体积分数具体可为1°/Γ5% ;所述病原菌的生长体系的0D_可为O. 02-0. 05 (如O. 02，或O. 05);所述病原菌的生长体系中的培养基具体可为LB液体培养基或M63液体培养基。在本发明的一个实施例中，所述病原菌具体为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。所述毒力因子具体为弹性蛋白酶、或水解酶；所述水解酶具体为葡萄糖苷酶、磷酸酶或脂酶。在实际应用中，所述待检测菌的发酵产物也可用所述待检测菌的代谢物替代；所述待检测菌的代谢物具体可包括如下步骤发酵培养所述待检测菌，收集发酵产物，将所述发酵产物离心，取上清过滤，获得滤液，所述滤液即为所述待检测菌的代谢物。在本发明中，所述生物被膜均为微生物被膜。本发明所提供的奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426具有抑制病原菌生物被膜形成和减毒的作用。本发明具有如下优点(1)奇异变形菌(Proteusmirabilis) 10#CGMCC No. 6426制剂的活性成分(代谢物)不影响病原菌的生长，不产生胁迫压力，产生耐药性几率低；(2)奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCCNo. 6426制剂的活性成分(代谢物)不仅仅抑制了病原菌生物被膜的形成，还降低了病原菌的毒力。保藏说明菌种名称奇异变形菌拉丁名(Proteusmirabilis)菌株编号10#保藏机构中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所保藏日期2012年8月13日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 642
图I为奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426的革兰氏染色结果。
图2 为奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426 代谢物对病原菌生物被膜形成的抑制效果。横坐标的百分含量(体积百分含量)表示奇异变形菌(Proteusmirabilis) 10#CGMCC No. 6426 代谢物的用量。图3 为奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426 代谢物对病原菌对弹性蛋白酶的抑制效果。横坐标的百分含量(体积百分含量)表示奇异变形菌(Proteusmirabilis) 10#CGMCC No. 6426 代谢物的用量。图4 为奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426 代谢物对病原菌β葡萄糖苷酶的抑制效果。横坐标的百分含量(体积百分含量)表示奇异变形菌(Proteusmirabilis) 10#CGMCC No. 6426 代谢物的用量。图5为奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426代谢物对病原菌对磷酸酶的抑制效果。横坐标的百分含量(体积百分含量)表示奇异变形菌(Proteusmirabilis)10#CGMCC No. 6426代谢物的用量。图6为奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426代谢物对病原菌对脂酶的抑制效果。横坐标的百分含量(体积百分含量)表示奇异变形菌(Proteusmirabilis)10#CGMCC No. 6426代谢物的用量。图7为奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426代谢物对病原菌生物被膜结构以及抗生素敏感性的影响。其中，A为I号样；B为2号样；C为3号样；D为4号样。图8为奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426代谢物对病原菌生长影响情况。其中，A为5 μ I实施例2步骤I得到的滤液组；Β为5 μ I浓度为100 μ g/ml氨
苄青霉素组。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa):由中国科学院南海海洋研究所的王晓雪研究员惠赠(上海抚生实业有限公司，产品编号CL5201)。该菌为致病菌，经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了该菌可造成死亡。MUF-β -D 葡糖苷(sigma-aldrich 公司，产品目录号M3633), MUF-磷酸盐(sigma-aldrich公司，产品目录号M8883), MUF-油酸(sigma-aldrich公司，产品目录号75164)LB固体培养基蛋白胨Ig,酵母提取物O. 5g,氯化钠Ig,去离子水IOOml,琼脂I. 5g，ρΗ7· O0LB液体培养基蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，氯化钠lg，去离子水100ml，pH7. O。M63液体培养基硫酸铵O. 2g,磷酸二氢钾I. 36g,七水硫酸亚铁O. 5mg,甘油
O.2g，酪蛋白水解物O. 5g，七水硫酸镁O. 02g，葡萄糖O. 2g，去离子水100ml，用氢氧化钾调pH 至 7· O。弹性蛋白缓冲液弹性蛋白酶2g，IOOmM氯化钙lml，pH7. 2Tris_HCl 100 μ 1，去离子水 100ml, ρΗ7· O。实施例I、菌株10#的分离与鉴定一、菌株10#的分离在清华大学深圳研究生院的池塘中，放入若干个一次性塑料平皿。每天取出3块培养皿，无菌水洗涤3遍后，用灭菌棉签蘸无菌水涂抹培养皿，再将棉签涂布于12cm中号含LB固体培养基平板上，30°C过夜静置培养，直至长出清晰可见的单克隆。随后从培养平板上挑取100株单克隆于2ml EP管中，EP管中含Iml LB液体培养基，将这100管单克隆放入恒温摇床中30°C，220r/min培养过夜。将其中的一个菌株命名为10#菌。 二、菌株10#菌的鉴定从形态、生理生化特征和16s rDNA序列同源性几个方面对步骤一获得的菌株10#
进行鉴定。I、形态学鉴定将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离得到的菌株10#进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态(是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。对于处于对数生长期的所述菌株10#，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。结果表明，上述步骤一分离得到的菌株为革兰氏阴性菌，菌落成淡黄色，表面湿润、表面平坦、边缘放射状，在显微镜下观察为短棒状，如图I所示，革兰氏染色成红色。2、生理生化特征分析生理生化特征的检测采用变形杆菌套装生化鉴定试剂盒进行(上海丽臣ELISA试剂盒厂，产品编号20214)。实验结果显示明胶水解阳性，鸟氨酸脱羧酶阳性，尿素酶阳性，木糖阳性。3、16s rDNA序列同源性分析常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株10#,提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，采用通用引物27f 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，1492r 5 ' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 '扩增细菌16S rRNA基因保守区。25 μ L扩增体系包括:I XPCR反应缓冲液，200 μ mol/L dNTPs,上游及下游引物各O. 2 μ mol/L, IUTaq DNA聚合酶，I μ L模板DNA。反应条件94°C预变性5min ;94°C变性30s，55 °C退火40s，72 °C延伸30s，共25个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物用I %凝胶电泳检测，阳性结果用27f :5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，1492r :5 ' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 '进行双向测序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心 NCBI 数据库(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)在线完成。菌株10#的16s rDNA的序列详见序列表中序列I。鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离筛选得到的菌株10#鉴定为奇异变形菌(Proteus mirabilis)。该奇异变形菌(Proteusmirabilis)lO#已于2012年8月13日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称06110，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101)，保藏登记号为CGMCC No. 6426。实施例2、奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426抑制病原菌生物被膜的检测I、奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426的发酵培养以及发酵产物(代谢物)的提取从-80 V的冰箱中取出保种的实施例I分离鉴定得到的奇异变形菌(Proteusmirabilis) 10#CGMCC No. 6426，室温解冻后，在LB固体培养基平板上多次划线分离，37°C静置培养12h以上，直至长出清晰可见的单克隆。从中挑出3株单克隆于Iml的LB液体培养基中，37°C，220r/min摇床培养过夜。取Iml菌液加入250ml含有IOOmlLB液体培养基的锥形瓶中，放入摇床上，30°C，220r/min (离心转头半径为13. 5cm)培养24tT36h，直·至培养基营养成分基本耗尽，细胞密度不再增加为止。收集发酵液，40C，12000r/min,离心20min(离心半径为13. 5cm)，取上清液。将获得的上清液进一步用O. 22 μ m滤膜过滤(除去剩余菌液和杂质)，取滤液(奇异变形菌(PiOteusmirabilis) 10#CGMCC No. 6426的代谢物)，保存在灭菌容器中，4°C保存备用。2、病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的活化培养从_80°C的冰箱中取出保种的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),室温解冻后，在LB固体培养基平板上划线，37°C静置培养12h以上，直至长出清晰可见的单克隆。从中挑出3株单克隆于Iml的LB液体培养基中，37°C，220r/min摇床培养过夜。再转接入20ml LB液体培养基中，37 0C，220r/min摇床培养8h，备用。3、检测奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426的代谢物对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜的抑制效果(I)将步骤2得到的活化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌液用M63液体培养基稀释至0D_为0. 02。(2)将稀释后的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液加入到96孔板中，100 μ I/孔，再向各孔中加入不同体积分数的步骤I得到的滤液(0，1%，3%，5%)，每个浓度设12个复孔。盖上板盖，37°C下静置培养48小时，注意保持空气湿度。(3)倒去培养基，用无菌水轻柔清洗平板，加入100 μ 1,1% (lg/100ml)结晶紫染液，室温染色20分钟,倒去染料,彻底而轻柔的清洗。(4)用DMSO溶解附着于壁上的结晶紫，并适度稀释，测0D57(i。实验重复三次，结果取平均值。检测原理如下铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)经过一段时间培养，会在96孔板的侧壁和底部形成生物被膜，弃去培养基，洗去悬浮细菌后，侧壁和底部的生物被膜中的细菌不会洗去，用结晶紫对这部分细菌进行染色，再用DMSO溶解结晶紫，溶解产物在570nm波长下有最大吸收峰。此时，吸光度越大，说明溶解产物的浓度越大，生物被膜的生物量也就越大。反之，则表明微生物被膜的生物量变小，生物被膜形成受到抑制。检测结果如图2所示，从图中可以看出，与对照(O浓度组)相比，加入了步骤I得到的滤液(奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426的代谢物)的各组，对病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜的形成均具有明显的抑制作用(p〈0. 01，差异极显著)，且这种抑制作用随着加入的所述滤液的浓度的增大而增强。实施例3、奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426抑制病原菌毒力因子的检测I、检测奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426的代谢物对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)弹性蛋白酶的抑制效果(I)将实施例2步骤2得 到的活化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌液用LB液体培养基稀释至0D_为0. 05。(2)向稀释后的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液中加入不同体积分数的实施例2步骤I得到的滤液(0，3%，5%)，每个浓度3次重复，放入摇床中，220r/min，37°C培养21小时后，4°C，12000g/min，离心5分钟。(3)取500 μ I离心后的上清液加入ImL弹性蛋白缓冲液，振荡共培养6小时，加入600 μ I浓度为0. IM的EDTA终止反应，离心去沉淀(10000r/min, 2分钟)，测OD4950实验重复三次，结果取平均值。检测原理如下弹性蛋白微溶于水，弹性蛋白酶可将弹性蛋白水解，形成红色水解产物，此红色水解产物在495nm的波长下有最大吸收峰。此时，水解产物的浓度越大，光能量越强，得到的数值就越大。检测结果如图3所示，从图中可以看出，与对照(O浓度组)相比，加入了实施例2步骤I得到的滤液(奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426的代谢物)的各组，对病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的弹性蛋白酶的产量均具有明显的抑制作用(P〈0. 01，差异极显著)，且这种抑制作用随着加入的所述滤液的浓度的增大而增强。2、检测奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426的代谢物对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)水解酶的抑制效果(I)将实施例2步骤2得到的活化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的菌液用LB液体培养基液体培养基稀释至0D_为0. 05。(2)向稀释后的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液中加入不同体积分数的实施例2步骤I得到的滤液(0，1%，3%, 5%)，每个浓度3次重复，放入摇床中，220r/min,30°C条件下培养 16h 后,4°C, 12000r/min 离心 15min。(3)取三份IOml上清液，分别加入20 μ I浓度为5mM的三种不同的水解底物(MUF-β -D葡糖苷，MUF-磷酸盐，MUF-油酸)，黑暗中共培养9h。空白对照为煮沸的所述上清液(未加实施例2步骤I得到的滤液)与底物共培养的产物。(4)将共培养9h后的产物，取出100μ I于96孔板中(注意用锡箔纸包好，避光)，放入酶标仪中，设定激发光为365nm,发射光为455nm,检测突光值。实验重复三次，结果取平均值。检测原理如下水解酶能将带有荧光标记(MUF)的底物水解，荧光标记转移至水解产物上，在365nm的激发光激发后，产生455nm的荧光，根据荧光强弱，可知水解产物的浓度大小，从而可知水解酶的浓度大小，荧光值越小，受到抑制越大。检测结果如图4-图6所示，从图中可以看出，与对照(O浓度组)相比，加入了实施例2步骤I得到的滤液(奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426的代谢物)的各组，对病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的3种不同水解酶的产量均具有明显的抑制作用(P〈0. 01，差异极显著)，且这种抑制作用随着加入的所述滤液的浓度的增大而增强。
实施例4、奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物被膜结构以及抗生素敏感性影响的检测(I)将实施例2步骤2得到的活化的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液用M63液体培养基稀释至OD6tltl为0. 05。实验设置四组，分别记为1、2、3、4。其中，I和2号样品各IOml上述稀释后的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液；3和4号样品各9ml上述稀释后的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌液，同时分别加入Iml的实施例2步骤I得到的滤液。从这四组样品中分别取出500 μ I滴加在灭菌的盖玻片(盖玻片置于培养皿中)上，在37°C培养箱中培养8h后，I号样品和2号样品补充10ml M63液体培养基，3号和4号样品补充IOml含有10%体积含量的实施例2步骤I得到的滤液的M63液体培养基至盛有盖玻片的培养皿中，再培养3天。接着取出2号和4号样，分别加入10 μ I浓度为100mg/ml的卡那霉素溶液,继续培养24h。I号样0ml实施例2步骤I得到的滤液,浓度为O μ g/ml卡那霉素；
2号样0ml实施例2步骤I得到的滤液,浓度为100 μ g/ml卡那霉素；3号样1ml实施例2步骤I得到的滤液,浓度为O μ g/ml卡那霉素；4号样1ml实施例2步骤I得到的滤液,浓度为100 μ g/ml卡那霉素。(2)配制荧光染色剂(现配现用)，所用荧光染色剂为-7012LIVE/DEADBacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes Inc),将其中的 SYT09 和 PI 染液按如下比例稀释，SYT09 PI :蒸馏水=1. 5μ I 1. 5μ I :1ml，振荡混匀(注意避光)。(3)取出4个样品中的盖玻片，用0.9% (0. 9g/100ml)的氯化钠溶液清洗，自然晾干，在每个盖玻片上滴加200 μ I步骤(2)配制好的荧光染料(注意避光)，黑暗中染色30min,自然晾干后，放置共聚焦显微镜上观察。红色为死菌，绿色为活菌。检测原理SYT09染料可以透过细胞膜，能将死菌或者活菌的DNA结合，在488nm波长的激发光下，产生绿色荧光。而PI不能透过细胞膜，只能与死菌的DNA结合，且能取代SYT09，在488nm波长的激发光下，产生红色荧光。在用激光共聚焦显微镜观测时，利用Z轴逐层扫描，根据上下表面的距离即得厚度。检测结果如图7所示，从图中可以看出，不加实施例2步骤I得到的滤液(奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426的代谢物)，且不加抗生素的样品(I号样)，形成完整的连续的生物被膜，视野中都成绿色，说明活菌占了绝大多数。不加实施例2步骤I得到的滤液(奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426的代谢物)，只加抗生素的样品(2号样)，只有表面一层出现红色，杀菌效果并不明显。加了实施例2步骤I得到的滤液(奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426的代谢物)，未加抗生素的样品(3号样)，成绿色，生物被膜厚度降低，成分散状排列。加了实施例2步骤I得到的滤液(奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCCNo. 6426的代谢物)和抗生素后的样品(4号样)，出现大片分散状的红色死菌。以上结果表明奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCCNo. 6426的代谢物能够抑制生物被膜的形成，与抗生素一同作用，可大大提高杀菌效果。实施例5、奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生长的影响检测(I)取出200μ I实施例2步骤2得到的活化的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)菌液，分成2份，每份100 μ I。在一份中加入5μ I实施例2步骤I得到的滤液，另一份中加入5 μ I浓度为100 μ g/ml氨苄青霉素。(2)在两块培养有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的固体LB培养基平板上均匀铺上3张滤纸片,在一块板的滤纸片上滴加5 μ I含有实施例2步骤I得到的滤液的菌悬液，另一块板滴加5μ I含有氨节青霉素的菌悬液,放入30°C培养箱中静置培养过夜，观察抑菌圈的产生情况。检测结果如图8所示，从图上可以看出，在加入实施例2步骤I 得到的滤液(奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426的代谢物)的滤纸片上，并未形成抑菌圈，而在加入了氨苄青霉素的滤纸片周围形成了明显的抑菌圈。这表明，实施例2步骤I得到的滤液(奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426的代谢物)并不影响病原菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的生长。
权利要求
1.奇异变形菌(Proteusmirabilis)10#,它在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 6426。
2.一种制剂，其活性成分为权利要求I所述奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No. 6426 的代谢物。
3.权利要求I所述的奇异变形菌(Proteusmirabilis) 10#CGMCC No. 6426，或权利要求2所述的制剂在如下(al) - (a3)中的应用 (al)制备抑制病原囷生物被I旲形成的广品； (a2)制备抑制病原囷毒力因子的广品； (a3)鉴定病原菌生物被膜抑制菌。
4.权利要求I所述的奇异变形菌(Proteusmirabilis) 10#CGMCC No. 6426,或权利要求2所述的制剂在如下(bl) - (b4)中应用 (bl)制备降低病原菌生物被膜形成总量的产品； (b2)制备抑制病原菌弹性蛋白酶产生量的产品； (b3)制备抑制病原菌水解酶的产生量的产品； (b4)制备与抗生素共同作用提高对病原菌的杀伤效率的产品。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述病原菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa);所述水解酶为β _葡萄糖苷酶、磷酸酶或脂酶。
6.权利要求2所述制剂的制备方法，包括如下步骤发酵培养权利要求I所述的奇异变形菌(Proteus mirabilis) 10#CGMCC No. 6426，收集发酵产物，获得所述制剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵培养的温度为28 37°C;或 所述发酵培养的时间为24-36小时；或 所述发酵培养的方式为旋转震荡培养，所述旋转震荡培养的转速为150转/分钟 220转/分钟，旋转半径为13. 5cm ;或 所述发酵培养的培养基为LB液体培养基。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于所述方法中，在所述收集发酵产物的步骤后还包括将所述发酵产物离心，取上清过滤，获得滤液的步骤。
9.一种鉴定或辅助鉴定病原菌生物被膜抑制菌的方法，为如下(A)或(B) 所述(A)包括如下(I)和(2)的步骤 (O向所述病原菌的生长体系中添加待检测菌的发酵产物作为实验组，以不添加所述待检测菌的发酵产物的空白的所述病原菌的生长体系作为对照组；检测所述实验组和所述对照组中所述病原菌的生物被膜的含量情况； (2)根据如下方法判断所述待检测菌是否为所述病原菌的生物被膜抑制菌若所述实验组中所述病原菌的生物被膜形成总量低于所述对照组中所述病原菌的生物被膜形成总量，则所述待检测菌为或候选为所述病原菌的生物被膜抑制菌；反之，则所述待检测菌不为或候选不为所述病原菌的生物被膜抑制菌； 所述(B)包括如下(3)和(4)的步骤 (3)向所述病原菌的生长体系中添加待检测菌的发酵产物作为实验组，以不添加所述待检测菌的发酵产物的空白的所述病原菌的生长体系作为对照组；检测所述实验组和所述对照组中所述病原菌的毒力因子的含量情况；(4)根据如下方法判断所述待检测菌是否为所述病原菌的生物被膜抑制菌若所述实验组中所述病原菌的毒力因子的产生量低于所述对照组中所述病原菌的毒力因子的产生量，则所述待检测菌为或候选为所述病原菌的生物被膜抑制菌；反之，则所述待检测菌不为或候选不为所述病原菌的生物被膜抑制菌； 所述病原菌为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa);所述毒力因子为弹性蛋白酶或水解酶；所述水解酶具体为β -葡萄糖苷酶、磷酸酶或脂酶。
全文摘要
本发明公开了一种与生物被膜抑制和减毒相关的细菌菌株。本发明所提供的与生物被膜抑制和减毒相关的细菌菌株具体为奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#，它在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6426。本发明所提供的奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No.6426具有抑制病原菌生物被膜形成和减毒的作用。本发明具有如下优点(1)奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No.6426制剂的活性成分(代谢物)不影响病原菌的生长，不产生胁迫压力，产生耐药性几率低；(2)奇异变形菌(Proteus mirabilis)10#CGMCC No.6426制剂的活性成分(代谢物)不仅仅抑制了病原菌生物被膜的形成，还降低了病原菌的毒力。
文档编号A61P31/04GK102911899SQ20121040322
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者蔡中华, 余时琛, 陈璐, 常虹, 朱小山, 周进 申请人:清华大学深圳研究生院