专利名称：一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及其在骨关节炎中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及干细胞技术领域，具体来说，涉及向软骨诱导的UC-MSCs的制备方法及其在骨关节炎中的应用。
背景技术：
关节软骨是一种负重结缔组织，常因肿瘤，运动、退行性变或老年性疾病造成损伤；然而关节软骨自身修复能力有限，给临床治愈软骨缺损造成了很大困难。近些年出现了多种治疗软骨缺损的方法，包括自体软骨细胞移植、微裂缝和镶嵌成形术，但这些方法各自都有其局限性。近年来，组织工程软骨成为软骨修复研究的新热点，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是其当前最有前景的种子细胞。MSCs是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现。目前MSCs的主要来源为成人骨 髓，但成人骨髓源MSCs细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且供者MSCs的采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制。研究发现，MSCs在人胎儿和出生后多种组织广泛存在，包括骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝和脐血等。在前一个国家自然基金《脐带间充质干细胞生物特性、造血支持研究及在移植中的应用》(30570905)的资助下，我们应用改进的胶原酶和胰酶相结合的酶直接消化法，通过磁珠筛选，从脐带中获得了大量的MSCs。并建立了一种可以分离扩增脐带MSCs的方法，且操作简单易行(ZL200910242375. 8)。根据本方法，90%足月脐带可以分离出MSCs，获得I X IO9 MSCs细胞，充分满足临床和实验研究的需要。现有技术尚没有将脐带源间充质干细胞向软骨诱导分化的尝试，我们将脐带源间充质干细胞作为我们的种子细胞，将其诱导分化为无支架软骨，并对其修复受损关节软骨的能力进行了研究，具有重要的临床指导意义。
发明内容
本发明在第一方面提供了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其中，在15ml尖底离心管中使用小球法诱导培养间充质干细胞，并且每隔约24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离。在一个特定的实施方案中，使用的诱导分化培养基为高糖DMEM加入100 μ g/ml丙酮酸钠，10 ng/ml TGF^ 3，100 nM地塞米松，25 48/1111维生素(，40 μ g/ml脯氨酸，IXITS + I premix ;诱导分化培养时间为21天。优选地，所述间充质干细胞为脐带源间充质干细胞。在本发明的第二个方面，提供了根据本发明的方法制备的向软骨细胞分化的间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞为脐带源间充质干细胞。在本发明的第三个方面，提供了向软骨细胞分化的间充质干细胞在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。优选地，所述间充质干细胞为脐带源间充质干细胞。本发明具有如下优点
I.采用小球法诱导培养间充质干细胞，可以制得无支架软骨，每隔约24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离，保证了细胞球与诱导分化培养基充分接触，细胞球中的间充质干细胞分化状态均一。2.诱导分化培养基中使用TGFP 3代替了常用的TGFP 1，达到了更好的诱导效
果O 3.脐带源间充质干细胞相对于常规的骨髓源间充质干细胞分离制备简便，来源丰富。
图I向软骨诱导分化21天后的UC-MSCs小球的甲苯胺蓝染色结果，紫红色证明为软骨细胞。图2大鼠骨关节炎模型经向软骨诱导的UC-MSCs细胞悬液治疗后的HE染色结果。A正常对照组；B模型组；C关节腔内细胞悬液治疗组I ;D关节腔内细胞悬液治疗组2 ；E尾静脉注射细胞悬液治疗组3 ； F尾静脉注射细胞悬液治疗组4。
具体实施例方式实施例I脐带源间充质干细胞向软骨细胞诱导
I.MSC生长培养基单层扩增脐带源间充质干细胞
MSC生长培养基(每75平方厘米培养瓶中加入13. 5ml DF12，10%人血清，20 ng/mlEGF、5ng/ml FGF2)培养P3代脐带源间充质干细胞(UC-MSCs)，细胞生长达到70-80%融合，用D-Hank’s洗液洗两遍后，加入I. 5ml胰酶-EDTA (O. 25%胰酶-O. 02% EDTA)进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用I. 5ml人血清终止消化，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，取200微升计数确定细胞数量，其余细胞悬液离心，IOOOrpm, IOmin0倒掉离心后的上清，以1:3的比例传代，培养至P4代，细胞生长达到70-80%融合，用D-Hank’ s洗液洗两遍后，加入I. 5ml胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用
I.5ml人血清终止消化，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，离心，IOOOrpm, IOmin0倒掉离心后的上清,加入30ml D-hank’ s洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入30mlD-hank’s洗液,混勻后,取出200微升计数,其余细胞悬液离心，IOOOrpm, lOmin。离心后去掉上清。2. MSC生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度至IXlOfVml个细胞。3. Pellet (小球法)培养细胞将Iml含有I X IO6个细胞的细胞悬液加入15ml尖底离心管中，离心(240g，5分钟)，将离心管放入37°C，5% CO2细胞培养箱中，约24小时后，轻轻晃动离心管，使细胞球与管底分离，之后换加入诱导分化培养基(高糖DMEM加入100 yg/ml 丙酮酸钠，10 ng/ml TGF^ 3，100 nM 地塞米松，25 48/1111维生素(，40 μ g/ml 月甫氨酸，IX ITS + I premix (10 ug/ml Insulin, 5.5 ug/ml transferrin, 5ng/mlselenium, 5. 35 μ g/ml linoleic acid),每隔24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管壁分离，每两天更换一次软骨分化培养基。21天后，取出小球，甲苯胺蓝染色，如图I所示，紫红色证明为软骨细胞。实施例2向软骨诱导的UC-MSCs在骨关节炎中的应用
将实施例I中得到的向软骨诱导的细胞球在离心管中用3ml 2%(w/v)的II型胶原酶消化半小时后，1000rpm，5min离心后，用与实施例I同样的诱导分化培养基重悬后接种于底面积为25 cm2的培养瓶中扩增培养，长满后用O. 5ml胰酶-EDTA消化，制成向软骨诱导的UC-MSCs细胞悬液。选健康雄性Wistar大鼠，体重200±50 g，60只。随机分为⑴关节腔内注射向软骨诱导的UC-MSCs细胞悬液治疗组I J2)关节腔内注射向软骨诱导的UC-MSCs细胞悬液治疗组2 ;⑶尾静脉注射向软骨诱导的UC-MSCs细胞悬液治疗组3 ;⑷尾静脉注射向软骨诱导的UC-MSCs细胞悬液治疗组4 ;(5)对照组(关节腔内注射细胞悬液溶剂)；(6)模型组；(7)正常组，其中前四组每组10只，后三组每组6只。造模方法为按0.3 ml/100 g腹腔注射10 %的水合氯醛，麻醉后，大鼠双侧膝关节注射4 %木瓜蛋白酶泊洛沙姆磷酸缓冲溶液，将下肢置 于50°C自制烤箱里2h，结束后即完成造模。造模完成后的第I周为O周，分别于0、2、4周注射细胞悬液。关节腔内注射组I和尾静脉注射组3每只注射100 μ I 4X IO7个/ml，关节腔内注射组2和尾静脉注射组4每只注射100 μ I 2X IO7个/ml，对照组分别于0、2、4周注射ΙΟΟμΙ细胞悬液溶剂。所有组动物于第6周处死，取材。治疗6周后，按O. 3 ml/100 g体重腹腔注射10 %的水合氯醛进行麻醉。腹主动脉取血，3000 r/min离心10分钟，分离血清，4°C保存，备用。病理取材取完整右膝关节，去除周围皮肤、肌肉，10 %福尔马林固定，常规石蜡包埋，HE染色，光镜下观察关节的病理组织学变化，如图2所示。A正常对照组，图示正常软骨结构，软骨表面较光滑，连续性好，表层、移行层、辐射层、钙化层4层结构清晰可辨，软骨细胞排列整齐，基质染色均匀，潮线完整模型组，关节软骨表面粗糙，表层可见较多裂隙，裂隙周围可见脱水固缩坏死的软骨细胞且排列紊乱，各层结构不易分辨；C关节腔内细胞悬液治疗组I，关节软骨表面较模型组平整，表层裂隙减少，但软骨细胞弥漫增多，潮线欠完整；D关节腔内细胞悬液治疗组2，基质着色变浅，染色欠均匀，恢复情况弱于关节腔内细胞悬液治疗组I ;E尾静脉注射细胞悬液治疗组3，关节软骨结构向正常软骨发展，但基质染色仍欠均匀；F尾静脉注射细胞悬液治疗组4，关节软骨细胞坏死，恢复情况次于尾静脉注射细胞悬液治疗组3。经上述对关节软骨病理形态学观察，治疗组的关节软骨较模型组得到明显改善，且高剂量尾静脉注射细胞悬液治疗骨关节炎的软骨损伤效果最显著，综上，向软骨诱导的UC-MSCs细胞具有一定程度的修复受损关节软骨的作用。
权利要求
1.一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法，其中，在15ml尖底离心管中使用小球法诱导培养间充质干细胞，并且每隔约24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离。
2.权利要求I所述的方法，其中，使用的诱导分化培养基为高糖DMEM加入100μ g/ml丙酮酸钠，10ng/ml TGFβ 3, IOOnM地塞米松,25 μ g/ml维生素C,40 μ g/ml脯氨酸，IXITS+lpremix。
3.权利要求I或2所述的方法，其中，诱导分化培养时间为21天。
4.权利要求I或2所述的方法，其中，所述间充质干细胞为脐带源间充质干细胞。
5.权利要求4所述的方法，其步骤包括 1)在每个75cm2培养瓶中加入13.5ml间充质干细胞生长培养基培养P3代脐带源间充质干细胞，细胞生长达到70-80%融合，用D-Hank’ s洗液洗两遍后，加入I. 5ml胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用I. 5ml人血清终止消化，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，取200微升计数确定细胞数量，其余细胞悬液离心，IOOOrpm,IOmin ;倒掉离心后的上清，以1:3的比例传代，培养至P4代，细胞生长达到70-80%融合，用D-Hank’s洗液洗两遍后，加入I. 5ml胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用I. 5ml人血清终止消化，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，离心，IOOOrpm,IOmin ;倒掉离心后的上清，加入30ml D_hank’ s洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入30ml D-hank’ s洗液,混勻后，取出200微升计数,其余细胞悬液离心，IOOOrpm, IOmin ；离心后去掉上清； 其中，所述间充质干细胞生长培养基为DMEM/F12加入10%人血清、20ng/ml EGF、5ng/ml FGF2 ； 2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度至IX IO6细胞/ml ； 3)小球法诱导培养细胞将Iml含有IXIO6个细胞的细胞悬液加入15ml尖底离心管中，240g离心5分钟，将离心管放入37°C，5%C02细胞培养箱中，约24小时后，轻轻晃动离心管，使细胞球与管底分离，之后换加入诱导分化培养基；每隔24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离，每两天更换一次诱导分化培养基；21天后，取出小球； 其中，所述诱导分化培养基为高糖DMEM加入100 μ g/ml丙酮酸钠，10ng/mlTGFβ 3，IOOnM 地塞米松,25 μ g/ml 维生素 C, 40 μ g/ml 脯氨酸，I X ITS+lpremix。
6.根据权利要求1-5任一项的方法制备的向软骨细胞分化的间充质干细胞。
7.权利要求6所述的向软骨细胞分化的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞为脐带源间充质干细胞。
8.权利要求6或7所述的向软骨细胞分化的间充质干细胞在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及其在骨关节炎中的应用，具体提供了向软骨细胞分化的脐带间充质干细胞的制备方法，该方法得到的向软骨细胞分化的间充质干细胞，及其制备的药物在治疗骨关节炎中的应用。其中，所述方法包括在15ml尖底离心管中使用小球法诱导培养间充质干细胞，并且每隔约24小时轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离；诱导分化培养基为高糖DMEM加入100μg/ml丙酮酸钠，10ng/mlTGFβ3，100nM地塞米松，25μg/ml维生素C，40μg/ml脯氨酸，1×ITS+1premix。采用本发明的方法构建的无支架软骨可用于受损关节软骨的修复。
文档编号A61K35/44GK102899287SQ20121041004
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者刘拥军, 王立华, 许放, 董方 申请人:天津和泽干细胞科技有限公司