一种i型胶原材料、脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可缝合高浓度的具有三螺旋结构的I型胶原材料、一种由所述I型胶原材料制备的脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法，所述脑膜或脊膜生物膜片可用于制备硬脑膜或脊膜组织修复材料。
【专利说明】一种I型胶原材料、脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学、生物材料学、组织工程学以及再生医学【技术领域】，具体涉及一种I型胶原材料、脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法和应用，即:一种高纯度保持胶原纤维特有三螺旋结构的I型医用胶原材料制作高浓度、高密度、高强度的脑膜或脊膜制备方法及应用。
[0002]更具体地说，本发明涉及一种高纯度的具有三螺旋结构的I型胶原材料、一种由所述I型胶原材料制备的脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法，以及所述脑膜或脊膜生物膜片在制备硬脑膜或脊膜组织修复材料中的应用。
【背景技术】
[0003]二十世纪末随着医学的高速发展，细胞生物学，分子生物学、遗传基因学，组织工程学以及再生医学也随之不断进步与发展。具有优良性能的生物材料也同时在被迅速发现与利用。近年来，组织工程学和再生医学在医学临床中的快速掘起就证明了这一点。使用自然生物材料的I型胶原做为支架或载体的组织工程和再生医学的产品获得了显著的发展与应用。
[0004]在此领域内的一个重要课题是:如何应用上述材料制备成具有不同理化、生物学特性并能充当细胞外间质物 质的支架，使机体受损伤的组织细胞能有很好的修复再生的环境，且为损伤组织细胞提供尽可能接近正常的内外环境从而促使受损组织器官得以修复再生。这不仅需要考虑自然生物材料本身特性，而且还要考虑在技术使用与操作方面更具良好性能。这需要应用不同医疗领域的组织工程学和再生医学的组织器官修复再生技术。
[0005]硬脑膜/硬脊膜在外伤以及肿瘤侵及时，可造成不同程度的脑膜或脊膜的损伤与缺损，继而形成脑脊液渗漏，继发感染，甚至因脑膜不正常愈合形成的瘢痕而引发癫痫。严重的损害缺损，将造成颅脑中枢神经系统器官实质性不可逆的损伤与变性。目前通常的治疗方法是在损伤缺损的情况下，选用自体其他部位的颅脑筋膜，体肌筋膜，或其他抗原性较高的生物材料产品进行严密的缝合。由于自身组织难以获取，或因选取材料的不充分往往治疗达不到预期的效果，而其他代用品又往往有较高的免疫反应，而且会形成瘢痕组织，影响治疗效果。
[0006]中国专利申请CN101569765A“保持胶原特有三螺旋结构的I型医用胶原材料及其产品和应用”公开了一种保持胶原特有三螺旋结构的I型医用胶原材料及其提取方法，采用该I型医用胶原材料制备的脑膜/脊膜生物膜片，以及该生物膜片的制备工艺及其在制备脑膜/脊膜组织修复材料中的应用。该专利申请涉及的I型胶原人工硬脑/脊膜发明特点着重在于对损伤缺损的脑膜或脊膜的缺损部位使用具有一定强度、具有高开放性三维孔隙结构的类海绵状脑膜或脊膜生物膜片进行覆盖包裹、目的在于免缝合。这样不仅机械性的保护脑实质部位的组织不受外周其他组织的侵入干扰，同时还建立了受损脑膜或脊膜部位的纤维组织的再生内环境，防止脑脊液和其内的生长因子过度丢失，保持受损组织的内环境的相对稳定，为修复脑膜或脊膜和其再生提供最佳环境。同时可以大大地减少术后缝合缺损硬膜的时间，缩短手术整体时间，减少患者费用。
[0007]但是这种具有多孔隙的海绵状膜在临床使用过程中由于其力学性能较弱、缝合的性能欠佳，导致在神经外科手术中受到了一定的限制。在神经外科的手术中有相当部分的手术病例如颅底部位的病变在术中需要修补时必须需要紧密缝合缺损，为此发明一种提高材料力学性能的可缝合的人工脑膜成为了发展的必然趋势。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种可缝合的1型胶原材料、脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法和应用。
[0009]本发明的目的在于提供一种高纯度的具有三螺旋结构的1型胶原材料、一种由所述I型胶原材料制备的脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法，以及所述脑膜或脊膜生物膜片在制备硬脑膜或脊膜组织修复材料中的应用。
[0010]一种1型胶原材料、脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法使用一种保持胶原三螺旋结构的1型医用胶原材料在戊二醇特殊冷冻条件下使其胶原溶液保持在-4~+4度的温度状态，并以每分3，000~18，000转速进行搅拌，使之胶原浆液的温度保持在上述摄氏温度的状态，其1性胶原原料的三螺旋结构必不遭到破坏。为此生产的脑膜或脊膜生物膜片中的胶原纤维操持其三螺旋结构。
[0011]1型胶原是人体多种胶原的一种，普遍存在于很多的组织器官中；它是由2条a 1肽链和1条a 2肽链组成；按右手螺旋结构盘旋组成。如图4所示。
[0012]此种结构保持I型胶原的属性，如氨基酸按一定顺序紧密排列，相邻肽链上的氨基酸残基可以通过不同方法使之交联。但是这种结构在一定温度的时候变得不稳定，三螺旋结构间的螺旋状开散相成下一级产物-明胶。所以一种高纯度的总蛋白含量在98%以上，羟基脯氨酸含量大于10%结构保持自身特有的三螺旋结构的1型胶原材料，其特征在于制造构成中保持在低温条件下以一定的速度进行搅拌才能使其结构不遭到破坏。
[0013]本发明的第一个方面在于提供一种高纯度的具有三螺旋结构的I型胶原材料，其特征在于，总蛋白含量在98%以上，羟基脯氨酸含量大于10%，1型胶原纤维结构保持自身特有的三螺旋结构。
[0014]以及由上述具有三螺旋结构的I型胶原材料制成的生物膜片。
[0015]本发明的第二个方面在于提供一种由如上所述1型胶原材料制备的脑膜或脊膜生物膜片及其制备方法。
[0016]其中，上述脑膜或脊膜生物膜片的制作浓度在1.5%~3%，膜片厚度为1~3毫米，是具有20~80微米大小孔隙的致密微三维孔隙结构膜片状物。
[0017]在有长、宽、厚存在的情况下就形成三维，当其内的孔隙结构与大小在微米/纳米级别的时候可以称之为“微”孔隙结构。
[0018]其中，如上所述脑膜或脊膜生物膜片的制备方法，包括如下步骤:
步骤一，选用I~4% (重量/体积)的I型胶原溶于0.001~IN的盐酸或者0.01~
0.5M的冰醋酸内；
步骤二，在酸碱度为pHl~5的环境下进行均质搅拌0.5~3小时，搅拌速度为3，OOO ~6，000 转 / 分；
步骤三，在搅拌过程中加入0.001~4N的氢氧化钠溶液调节酸碱度使其逐步提升为pH9~14的碱性环境；
步骤四，搅拌0.5~I小时，搅拌速度为10，000~18，000转/分。其后在搅拌过程中再加入0.001~IN的盐酸再次调节酸碱度,使其酸碱度再下调为pH4~8的环境；
步骤五，然后保持搅拌温度低于15摄氏度，快速搅拌I~3个小时，搅拌速度为18，000 ~30，000 转 / 分；
步骤六，过滤均质液；
步骤七，再加入100%的酒精；
步骤八，其后在搅拌温度为O摄氏度~+15摄氏度，搅拌速度为3，000~10，000转/分的条件下，继续搅拌0.5~I小时，将得到的悬浊液倒入医用不锈钢冷冻盘内，应用冷冻干燥技术制成脑膜或脊膜生物膜片。
[0019]其中，如上所述制备方法中，上述所有步骤中经慢速或高速低温进行均质搅拌，搅拌温度为O摄氏度~+15摄氏度，搅拌时间为I~8小时，搅拌速度为3，000~30，000转/分。所述“均质”就是“搅拌”的意思，均质搅拌是指0.5%浓度胶原的搅拌要求为质地均一性的搅拌。现有技术的低浓度0.5%海绵状生物膜的搅拌从开始到完成均在固定同一酸性环境下不变的高速搅拌，而且胶原在其酸性环境下的条件不变；但是本发明的不同之处在于，搅拌时间变化不同、转速变化不同；同时胶原在搅拌溶液中的酸碱度不同。其中关键是搅拌的环境不同，其酸碱度的变化为酸性-中性-碱性-近中性。
`[0020]其中，如上所述脑膜或脊膜生物膜片的制备方法，还包括特殊冷冻干燥步骤，具体为:
O冷冻温度的设置为(I) +4摄氏度/30分钟/呈持续状态；(2) -75~-50摄氏度/60-120分钟/呈快速保持状态；(3) -70~-50摄氏度/120~300分钟/呈直线保持状态；过程中冷冻干燥机冷柜的温度保持-90~-80摄氏度；
2)干燥阶段的温度设置为(I)O摄氏度/保持15~24小时；(2) 二次升温的温度设置为20摄氏度，时间为30~120分钟；
3)上述所有程序进行过程当中其真空度设置应在200~350毫托。
[0021]更具体地，
O冷冻温度的设置为(I) +4摄氏度/30分钟/呈持续状态；(2) -60~-40摄氏度/120~300分钟/呈曲线状态；(3)-60~-40摄氏度/60~180分钟/呈持续状态；过程中冷冻干燥机冷柜的温度应保持-80摄氏度，而冷冻室温度为-45摄氏度；
2)干燥阶段的温度设置为(I)O摄氏度/保持15~24小时；(2) 二次升温的温度设置为20摄氏度，时间为30~120分钟；
3)上述所有程序进行过程当中其真空度设置为200~350毫托。
[0022]其中，如上所述脑膜或脊膜生物膜片的制备方法，还包括真空高温脱水(DHT)步骤，以加强胶原分子肽链间的铰链，具体为:将得到的脑膜或脊膜生物膜片放入真空烤箱内，其负压设置应为负I个大气压，温度为100~120摄氏度处理48~96小时。
[0023]其中，如上所述脑膜或脊膜生物膜片的制备方法，还包括环氧乙烷消毒灭菌步骤，制成孔隙在20~80微米的具有微三维孔隙结构脑膜或脊膜生物膜片。[0024]其中，如上所述的环氧乙烷消毒灭菌条件如下:
A、50%纯环氧乙烷加以50%的二氧化碳在消毒器内进行灭菌；
B、灭菌温度为50摄氏度±5摄氏度；
C、灭菌湿度为30%~70%RH；
D、预真空为-30~-1OOKpa；
E、换气真空度为-30~-50Kpa；
F、换气次数为6~10次；
G、灭菌时间为3~5小时。
[0025]上述方法中，盐酸为N为当量。2)冰醋酸为M为摩尔。
[0026]海面状胶原生物膜片的内孔隙形成原理为其均质浆液中的液体在冷冻过程中形成的冰晶所决定。因为胶原蛋白分子具有很强的粘稠性。高密度、高质量胶原生物膜的化学制作思路以及操作困难之处在于如何将粘稠的物质形成可流动性的均质浆液。为此如何能将长胶原纤维从均质 浆液中析出形成高浓度的纤维本体是本发明的关键。添加酒精是本发明独特的技术。
[0027]在冷冻干燥程序中，低温的设置方法以及冷度温度是形成浆液中液体成冰晶的关键。胶原纤维的其上附着形成了其孔隙。胶原溶液可以根据其酸碱度的高低控制其高密度的胶原浆液的粘稠度。这个调解限度可根据胶原等电点的酸碱度为调解中心增添酸或碱溶液使之浆液状态发生变化。同时在适当均质搅拌的胶原纤维在其浆液升高PH值后可以将其内的短纤维聚合成较长的纤维。
[0028]本发明的第三个方面在于提供如上所述脑膜或脊膜生物膜片在制备硬脑膜或脊膜组织修复材料中的应用。
[0029]其中，如上所述脑膜或脊膜生物膜片在制备用于修复受损的硬脑膜/硬脊膜神经组织的材料、用于治疗或预防因外伤和肿瘤造成硬脑膜或脊膜损伤或缺损的材料、用于治疗或预防因硬膜缺损引起的脑脊液漏、感染、癫痫的材料中的用途。
[0030]其中，上述脑膜或脊膜生物膜片能在6~12个月内降解吸收。
[0031]其中，上述脑膜或脊膜生物膜片是覆盖在损伤或缺损的任何部位的硬膜外表面。
[0032]其中，上述脑膜或脊膜生物膜片可应用于颅脑损伤的任何部位而且可以缝合。
[0033]其中，上述脑膜或脊膜生物膜片在防止或减少脑脊液渗漏的材料中的用途。
[0034]其中，上述脑膜或脊膜生物膜片在防止或减少组织粘连的材料中的用途。
[0035]其中，为使具有三螺旋结构的I型医用胶原膜片具有良好的抗降解性能以及抗α -平滑肌收缩蛋白的性能，就必须对疏松的胶原分子进行铰链与加强，使之胶原蛋白分子肽链间的结构加以改变。
[0036]其中，应用上述方法在制备过程中，不同浓度的混合悬浊液，不同的冷冻温度以及不同的加强方法相匹配，就可以达到20~80微米基本无孔隙的具有较高强度以及不同的降解吸收率的产品。优选孔隙大小为20~80微米，更优选20~60微米，最佳优选值为25微米。
[0037]其中，上述I型胶原蛋白的浓度优选为1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%。优选浓度为1%~4%，更优选浓度为1.5~3%，最佳优选值为1.75~2%。本发明所述所有百分值单位均为质量/容积。[0038]总之，本发明提供一种使用98%高蛋白纯度、羟基辅氨酸含量大于10%的具有三螺旋结构的I型医用胶原为材料制作高浓度、高密度、微/无开放孔隙的可缝合胶原膜片的制备方法。可用于在脑膜或脊膜损伤与缺损后作为脑膜或脊膜组织的修复材料，用于缝合修补、修复受损的硬脑膜/硬脊膜组织以及保护中枢神经系统组织。
[0039]本发明的有益效果包括:本发明提供一种使用具有三螺旋结构的I型医用胶原材料制备高密度可缝合降解时间延长的脑脊膜的使用及制备方法。可以促进损伤缺损的硬脑膜/硬脊膜的细胞在提供的胶原支架上移行、分化、再生，形成自身相同的组织，同时干扰非序的成纤维细胞的增生形成瘢痕。本发明提高了人工脑膜材料的力学性能，可以在神经外科手术中(如颅底部位的病变在术中需要修补时)紧密缝合缺损，克服了现有技术因力学性能弱和缝合性能差而使神经外科手术受限的缺陷，有效修复损伤缺损的组织，减少病人的痛苦。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1A为脑膜或脊膜生物膜片的整体立体(透视效果)示意图。
[0041]图1B为脑膜或脊膜生物膜片的主视图。
[0042]图2A为具有三螺旋结构的I型医用胶原材料脑膜或脊膜生物膜片安放位置、缝合以及和颅脑组织的关系示意图。
[0043]图2B为沿图2A中的A-B剖面的剖面图。
[0044]图3A为生物膜在临床上的使用方法之一的示意图。
[0045]图3B为生物膜在临床上的使用方法之二的示意图。
[0046]图4为I型胶原材料具有的三螺旋结构的示意图。
【具体实施方式】
[0047]以下结合附图和具体实例对本发明作进一步说明。
[0048]图1A为脑膜或脊膜生物膜片的整体立体(透视效果)示意图；图1B为脑膜或脊膜生物膜片的主视图。其中，附图标记含义为:1——孔隙(孔径为20~80微米)。其中，脑膜或脊膜生物膜片为20~80微米孔隙/1.5~3毫米厚98%纯度的具有三螺旋结构的I型医用胶原材料脑膜或脊膜生物膜，也就是，孔隙大小为20~80微米的微三维结构孔隙的高密度膜片。
[0049]图2A为具有三螺旋结构的I型医用胶原材料脑膜或脊膜生物膜片安放位置、缝合以及和颅脑组织的关系示意图；图28为沿图2A中的A-B剖面的剖面图。其中，附图标记含义为:2——颅骨骨板；3——胶原生物膜；4——正常脑膜；5——脑实体；6——缝线。
[0050]图3A为生物膜在临床上的使用方法之一的示意图，其中，生物膜大小略大于缺损部位的脑膜；图3B为生物膜在临床上的使用方法之二的示意图，其中生物膜大小符合缺损部位的脑膜。其中，附图标记含义为:2——颅骨骨板；3——胶原生物膜；4——正常脑膜；5——脑实体；6——缝线。
[0051]图4为I型胶原材料具有的三螺旋结构的示意图。其中，附图标记含义为-J—第一条α 1-肽 链右手螺旋结构；8——第二条α 1-肽链右手螺旋结构；9——α 2_肽链右手螺旋结构。[0052]制备实施例
制备脑膜或脊膜生物膜片实例:
实施例1:制备1.0%脑膜/脊膜生物膜片
应用7.2克高纯度的具有三螺旋结构的I型医用胶原材料在盐酸的环境下使用10，000和18，000转速搅拌30分钟和1.5小时制成1.%浓度的胶原复合悬浊液。其后使用氢氧化钠调节其酸碱度，使之达到粘稠度符合要求的状态。取500毫升倒入50X50厘米的冷冻托盘中，于-60摄氏度的低温条件下，冷冻3~4小时，干燥15小时，制成孔隙60微米，3毫米厚的脑膜/脊膜生物膜片。
[0053]实施例2:制备2%脑膜/脊膜生物膜片
应用14.4克高纯度的具有三螺旋结构的I型医用胶原材料在盐酸的环境下使用3，000、10，000和18，000转速搅拌30分钟、30分钟和1.0小时制成2%浓度的胶原复合悬浊液。其后使用氢氧化钠调节其酸碱度，使之达到粘稠度符合要求的状态。其后加入100%酒精继续搅拌30分钟。取500毫升倒入50X50厘米的冷冻托盘中，于_70摄氏度的低温条件下，冷冻3~4小时，干燥20小时，制成孔隙20微米，2.5毫米厚的脑膜/脊膜生物膜片。
[0054]实施例3:制备2.5%脑膜/脊膜生物膜片
应用18克高纯度的具有三螺旋结构的I型医用胶原材料在盐酸的环境下采用3，000、10，00、18，000以及28，000转速搅拌15分钟、30分钟、30分钟和I小时制成2.5%浓度的胶原复合悬浊液。其后使用 氢氧化钠调节其酸碱度和100%酒精，使之达到粘稠度符合要求的状态。继续搅拌15分钟。取500毫升倒入50X50厘米的冷冻托盘中，于-75摄氏度的低温条件下，冷冻3~6小时，干燥25小时，制成孔隙小于20微米，2毫米厚的脑膜/脊膜生物膜片。
[0055]效果实施例
试验方法和结果:脑膜或脊膜生物膜片扩大的覆盖在受损伤或缺损的硬脑膜/硬脊膜部位，其组织周围的血液中的血小板被大量吸附，同时凝血酶元将渗透于胶原膜的三维孔隙中被激活凝血活性，凝血纤维使胶原膜和正常脑膜紧密接触。由于其膜片三维孔隙很小或无孔隙所以生物膜片的粘附时间可能较长，高浓度的原料以及低温冷冻的生物膜具有高强度抗拉性能，所以可以和脑膜进行缝合防止脑脊液的渗出，使颅内的内环境相应稳定。硬膜本身的成纤维细胞借助胶原膜的三维结构以及外形移行，分化，再生从而促进损伤组织内新生的硬膜的再生。
[0056]实施例4:有关脑膜或脊膜生物膜的动物实验
脑膜或脊膜生物膜片的动物实验:6只雄性猎狗进行右侧前外侧颅骨切除术。用直径3厘米的环钻行行右前外侧顶骨切开术。不损伤任何颅骨下组织。小心止血后将其下的硬脑膜提起，小心的剪切直径3厘米的硬脑膜。保护其下的蛛网膜和软脑膜不受任何损伤。
[0057]将直径3.5厘米的胶原膜片小心的植入硬脑膜缺损的部位，覆盖硬脑膜的缺损部位和脑实质的表面而进行缝合。其后小心止血后将切除的颅骨瓣放回颅骨缺损的部位。
[0058]术后动物全部健康成活，无任何神经，精神异常症状，无脑脊液渗漏，无感染。周后处死动物，用直径6厘米的环钻以第一次手术骨瓣复位后的原颅骨的中心为新中心，扩大范围切除颅骨，暴露其下的硬脑膜和脑实质组织。
[0059]肉眼观察:6只实验动物的右前外侧顶骨愈合亮好，无任何感染。掀开骨瓣后，颅骨和硬脑膜间无明显粘连，新生的硬脑膜组织光滑，硬脑膜，蛛网膜和脑实质间无明显粘连和瘢痕。脑实质表面正常，无任何退化性改变。
[0060]组织学检查:将颅骨/硬脑膜/脑实质整体切除。经脱钙，腊块包埋后，制成5~6微米厚的切片经HE染色后观察组织学形态。
[0061]显微镜下常规切片检查均未发现异常组织细胞出现。整体显示为序的成纤维细胞和纤维结碲组织。和正常硬脑膜相比除在新生硬脑膜基底有活动性新生细胞分化外，在结构，形态和正常硬脑膜无异。无粘连，无瘢痕形成。偏光显微镜下显示新生的纤维组织
呈现出I型胶原特有的结构-阶段性光谱结构，而且植入的胶原膜均已降解吸收，无任何残留的胶原材料。
[0062]本发明提供一种使用具有三螺旋结构的I型医用胶原材料制备高密度可缝合降解时间延长的脑脊膜的使用及制备方法，可以促进损伤缺损的硬脑膜/硬脊膜的细胞在提供的胶原支架上移行、分化、再生，形成自身相同的组织，同时干扰非序的成纤维细胞的增生形成瘢痕，有效修复损伤缺损`的组织，减少病人的痛苦，为社会谋取更大的福利。
【权利要求】
1.一种高纯度的具有三螺旋结构的I型胶原材料，其特征在于，总蛋白含量在98%以上，羟基脯氨酸含量大于10%，I型胶原纤维结构保持自身特有的三螺旋结构。
2.如权利要求1所述具有三螺旋结构的I型胶原材料制成的生物膜片。
3.一种脑膜或脊膜生物膜片，其特征在于，由如权利要求1所述的I型胶原制成。
4.如权利要求3所述的脑膜或脊膜生物膜片，其特征在于，膜片厚度为I~3毫米，是具有20~80微米大小孔隙的致密微三维孔隙结构膜片状物。
5.如权利要求3或4所述脑膜或脊膜生物膜片的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤: 步骤一，选用I~4% (重量/体积)如权利要求1所述的I型胶原溶于0.001~IN的盐酸或者0.01~0.5M的冰醋酸内； 步骤二，在酸碱度为pHl~5的环境下进行均质搅拌0.5~3小时，搅拌速度为3，000 ~6，000 转 / 分； 步骤三，在搅拌过程中加入0.001~4N的氢氧化钠溶液调节酸碱度使其逐步提升为pH9~14的碱性环境； 步骤四，搅拌0.5~I小时，搅拌速度为10，000~18，000转/分，其后在搅拌过程中再加入0.001~IN的盐酸再次调节酸碱度,使其酸碱度再下调为pH4~8的环境； 步骤五，然后保持搅拌温度低于15摄氏度，快速搅拌I~3个小时，搅拌速度为18，000 ~20，000 转 / 分； 步骤六，过滤均质液； 步骤七，再加入100%的酒精； 步骤八，其后在搅拌温度为O摄氏度~+15摄氏度，搅拌速度为3，000~10，000转/分的条件下，继续搅拌0.5~I小时，将得到的悬浊液倒入医用不锈钢冷冻盘内，应用冷冻干燥技术制成脑膜或脊膜生物膜片。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，上述所有步骤中经慢速或高速低温进行均质搅拌，搅拌温度为O摄氏度~+15摄氏度,搅拌时间为I~8小时,搅拌速度为3，000 ~20，000 转 / 分。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤八经特殊冷冻干燥程序冷冻干燥，具体为: O冷冻温度的设置为(I) +4摄氏度/30分钟/呈持续状态；(2) -75~-50摄氏度/60~120分钟/呈快速保持状态；(3) -70~-50摄氏度/120~300分钟/呈直线保持状态；过程中冷冻干燥机冷柜的温度保持-90~-80摄氏度； 2)干燥阶段的温度设置为(I)O摄氏度/保持15~24小时；(2) 二次升温的温度设置为20摄氏度，时间为30~120分钟； 3)上述所有程序进行过程当中其真空度设置应在200~350毫托。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括真空高温脱水(DHT)步骤，以加强胶原分子肽链间的铰链，具体为:将得到的脑膜或脊膜生物膜片放入真空烤箱内，其负压设置应为负I个大气压，温度为100~120摄氏度处理48~96小时。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括环氧乙烷消毒灭菌步骤，制成孔隙在20~80微米的致密微三维孔隙结构膜片状物。
10.如权利要求5或7所述的制备方法，其特征在于，所述的冷冻干燥技术中 O冷冻温度的设置为(I) +4摄氏度/30分钟/呈持续状态；(2) -60~-40摄氏度/120~300分钟/呈曲线状态；(3)-60~-40摄氏度/60~180分钟/呈持续状态；过程中冷冻干燥机冷柜的温度应保持-80摄氏度，而冷冻室温度为-45摄氏度； 2)干燥阶段的温度设置为(I)O摄氏度/保持15~24小时；(2) 二次升温的温度设置为20摄氏度，时间为30~120分钟； 3)上述所有程序进行过程当中其真空度设置为200~350毫托。
11.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，使用环氧乙烷消毒灭菌步骤为: A、50%纯环氧乙烷加以50%的二氧化碳在消毒器内进行灭菌； B、灭菌温度为50摄氏度±5摄氏度； C、灭菌湿度为30%~70%RH； D、预真空为-30~-1OOKpa； E、换气真空度为-30~-50Kpa； F、换气次数为6~10次； G、灭菌时间为3~5小 时。
12.如权利要求3或4所述的脑膜或脊膜生物膜片在制备硬脑膜或脊膜组织修复材料中的用途。
13.如权利要求3或4所述的脑膜或脊膜生物膜片在制备用于修复受损的硬脑膜/硬脊膜神经组织的材料、用于治疗或预防因外伤和肿瘤造成硬脑膜或脊膜损伤或缺损的材料、用于治疗或预防因硬膜缺损引起的脑脊液漏、感染、癫痫的材料中的用途。
【文档编号】A61L27/50GK103800941SQ201210445760
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2012年11月9日
【发明者】许和平, 马克·斯拜克, 许剑懿, 李登云 申请人:北京银河巴马生物技术股份有限公司