专利名称：隐孔菌在制备慢病毒抑制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及隐孔菌的新用途，特别涉及隐孔菌在制备慢病毒抑制剂中的应用。
背景技术：
慢病毒属是反转录病毒科下的一个属，此属病毒的特征是需要较长的时间才能培养出来，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血(EIA)病病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)都是慢病毒属，慢病毒属的原文是Lentivirus，其中Lenti-在拉丁文中有慢的意思。慢病毒属可以由宿主细胞直接感染周围的细胞，不必经由形成病毒颗粒此一步骤。隐孔菌(Cryptoporus volvatus (Peck) )Shear是一种生于松林树干上的野生大型真菌，也有记载生于衰老的冷杉、云杉的树干或枯立木上，我国的云南、广东、广西、海南等 多个省份都有分布。隐孔菌子实体较小，无柄或偶尔有柄，一般侧生于基物上，木栓质，扁球形或近球形，I. 5-3. 5cmX 2-4. 5cm,厚l_3cm,盖表面光滑，浅土黄色或深蛋壳色，老后淡红褐色。边缘纯滑而厚，与菌幕相连。菌幕白色至污白色，且与菌盖色调明显不同，厚约1_。菌管层由菌幕所包盖，初期完全封闭，后逐渐在靠近基部出现一个圆形或近圆形的孔口，偶有两个，孔径2-4. 5mm。菌肉纯白至污白色,软木栓质,厚2_8mm。菌管同菌肉色,长2_5mm,管口圆形至近多角形，管口面浅粉灰色或带褐色，每毫米3-5个，壁厚，口缘完整。孢子光滑、无色、长椭圆形，10-13 μ mX 4-6 μ m。云南丽江民间曾作为小儿断奶时的口含物，或水煎服治疗气管炎和哮喘。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供隐孔菌的新用途。本发明所提供的隐孔菌的新用途是下述I) -6)中的至少一种I)隐孔菌提取物在制备慢病毒抑制剂中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质。2)隐孔菌提取物在制备抑制慢病毒在寄主细胞中合成RNA的产品(如药物)中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质。3)隐孔菌提取物在制备抑制慢病毒在寄主细胞中进行基因表达的产品(如药物)中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质。4)隐孔圃在制备慢病毒抑制剂中的应用。5)隐孔菌在制备抑制慢病毒在寄主细胞中合成RNA的产品(如药物)中的应用。6)隐孔菌提取物在制备抑制慢病毒在寄主细胞中进行基因表达的产品(如药物)中的应用。上述I) -6)中，所述隐孔菌可为子实体和/或菌丝体和/或孢子。所述隐孔菌子实体可为新鲜的子实体也可为干燥的子实体。上述慢病毒可为野生型的慢病毒也可为重组的慢病毒，在本发明的实施例中，所述慢病毒为重组慢病毒，如含有GFP基因的重组慢病毒(上海吉玛制药技术有限公司，货号D03003)o在本发明的实施例中，上述寄主细胞为Hela细胞。上述隐孔菌提取物可按照如下方法获得将隐孔菌子实体粉碎后用水浸提，收集水溶性物质得到所述隐孔菌提取物。上述隐孔菌提取物的制备方法中，所述隐孔菌子实体可粉碎至50-80目。上述隐孔菌提取物的制备方法中，所述用水浸提可为在4_65°C (如4-10°C、50-65。。、4。。或 50°C)用水浸提 10-14 小时。上述隐孔菌提取物的制备方法中，可采用离心分离所述水溶性物质。所述离心采 用的离心力可为8000-10000g，离心时间可为10-20分钟(如10-15分钟或15-20分钟)。本发明的实验证明用隐孔菌制备的隐孔菌提取物能够剂量依赖性地抑制含有GFP基因的重组慢病毒在Hela细胞中合成GFP的RNA和进行GFP基因表达，在隐孔菌提取物浓度为O. 5mg/ml时能使GFP的RNA表达量降至不加隐孔菌提取物对照的二十分之一，从而抑制慢病毒感染寄主细胞。
图I为荧光显微镜观察加入0、0. 3和O. 5mg/L的隐孔菌提取物的Hela细胞中GFP基因的表达情况。图中，0、0. 3和O. 5mg/L为隐孔菌提取物培养液的浓度。图2为加入的隐孔菌提取物的Hela细胞中GFP的mRNA表达水平。图中横坐标为隐孔菌提取物培养液的浓度。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的隐孔菌(Cryptoporusvolvatus (Peck) Shear) (KohmeiKADOWAKI. Behavioral observation of two fungivorous beetles (Coleoptera:Tenebrionidae)on wood-decaying bracket fungus Cryptoporus volvatusens_. EntomologicalScience (2010) 13, 159-161)采自中国云南，公众可从野外采集，也可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。实施例I、用隐孔菌制备慢病毒抑制剂一、隐孔菌提取物的制备用蒸馏水浸泡隐孔菌干子实体，水与隐孔菌干子实体的重量比为6:1，4°C浸泡2-4小时，匀浆器充分搅碎至60目，4°C浸提10小时，8000g离心20分钟，收集上清液，冻干，得到隐孔菌提取物。该隐孔菌干子实体是将新鲜的隐孔菌子实体在常温下干燥得到的。下述步骤二的实验中所用的隐孔菌提取物，均用生理盐水溶解并通过0. 22微米的过滤器过滤除菌后使用。二、隐孔菌提取物抑制重组慢病毒体外感染
I、实验方法I. I隐孔菌提取物抑制重组慢病毒感染细胞活性的测定将Hela (人宫颈癌细胞)细胞于96孔板中，用RPMI 1640培养液(10%胎牛血清FBS)于37°C、5% CO2环境下培养24h。接种含有GFP基因的重组慢病毒(上海吉玛制药技术有限公司，货号D03003)颗粒(MOI=O. I)，在病毒感染的同时分别加入100 μ I含有0、0. 3和O. 5mg/ml隐孔菌提取物的新鲜RPMI 1640培养液(用新鲜RPMI1640培养液稀释隐孔菌提取物，得到隐孔菌提取物终浓度分别为O. 3和O. 5mg/ml的隐孔菌提取物培养液，以等体积的新鲜RPMI 1640培养液(Omg/ml隐孔菌提取物的新鲜RPMI 1640培养液)做对照)，每一浓度的隐孔菌提取物培养液8孔，37°C、5% CO2环境下培养48h,通过在突光显微镜下观察绿色荧光表达的方法检测隐孔菌提取物抑制重组慢病毒感染Hela细胞的活性。I. 2、隐孔菌提取物抑制重组慢病毒基因在细胞内RNA合成活性的测定实验前一天接种Hela(人宫颈癌细胞)细胞于96孔板中，用RPMI 1640培养液 (10%胎牛血清FBS)于37°C、5% CO2环境下培养24h。接种重组慢病毒颗粒(MOI=O. 1)，在病毒感染的同时分别加入100 μ I含有O、O. 3和O. 5mg/ml隐孔菌提取物的新鲜RPMI1640培养液(用新鲜RPMI 1640培养液稀释隐孔菌提取物，得到隐孔菌提取物终浓度分别为O. 3和O. 5mg/ml的隐孔菌提取物培养液，以等体积的新鲜RPMI 1640培养液(Omg/ml隐孔菌提取物的新鲜RPMI 1640培养液)做对照)，每一浓度的隐孔菌提取物培养液8孔，37°C、5% CO2环境下培养48h，收集细胞，提取细胞总RNA做Real-Time PCR0RNA提取、反转录以及Real-Time PCR :每孔细胞加Iml RNA提取试剂Trizol,反复用移液器吹打混匀，转移至I. 5ml离心管中，室温静置5min ;在上述离心管中，加入O. 2ml氯仿，盖上盖子，在手中用力震荡15秒，室温静置IOmin ;4°C、12000g离心15min ;取上层水相置于新的I. 5ml离心管中,加入O. 5ml异丙醇，室温静置IOmin ；4°C、12000g离心IOmin ；小心弃上清，加Iml 75%乙醇进行洗涤，4°C、7500g离心5min，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥，最后加入 20 μ I DEPC 水溶解 RNA,用 Nanodrop 1000 (Thermo scientific)定量 RNA。取500ng RNA 做 RT-PCR。于 250 μ I 离心管中加入 500ng RNA 与 I μ I RandomPrimer (10 μ m, TaKaRa),混勻；70°C 5min,迅速置冰上冷却2min ;向上述混合物中加入以下组分M-MLV 5x Reaction Buffer 5 μ I, dNTP (2. 5mM each) 5 μ 1，重组 RNA 酶抑制剂25单位，M-MLV RT (Promega) 200units,最后加DEPC水补齐体积到25 μ I ;轻轻混匀，37°C60min ;将PCR管转移至70°C，15min ;置于冰上冷却，cDNA产物保存于_20°C。Real-Time PCR使用 TaKaRa 的 SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)反应体系。SYBR Premix Ex TaqTM (2Χ)10μ I, PCR 引物 GFPF(TGCAGTGCTTCAGCCGCTAC)(序列表中的序列 I)、GFPRC CGTTCTTCTGCTTGTCGGCCAT )(序列表中的序列 2 )；GAPDH( forward5，-CCTTCCGTGTCCCTACTGCCAAC-3，，reverse5，-GACGCCTGCTTCACCACC(均 10 μ m)各 O. 8 μ 1，ROXReference Dye II (50X ) 0· 4 μ I, cDNA 模板 2 μ I,无菌双蒸水 6 μ I,总体积 20 μ I。在ABI 7900Real-Time PCR System上反应，采取两步法PCR扩增标准程序95°C 30s ;95°C 5s、60°C 30s (40个循环)。用SDS2. 2. 2for 7900软件分析处理数据。以细胞看家基因GAPDH为参照，定量GFP的表达。3、数据分析
所有数据都是独立重复三次得到的平均值，用双尾T-test (成对)分析差异显著性，P 彡 O. 05 被认为差异显著，O. OKP 彡 O. 05(*)，0· OOKP 彡 O. 01(**)，P 彡 O. 001(***)。2、实验结果结果表明随着隐孔菌提取物浓度的增高，GFP基因表达的绿色荧光蛋白量明显减少，加入O. 5mg/ml的隐孔菌提取物处理中已经观察不到绿色荧光(图1)，加入O. 5mg/ml的隐孔菌提取物处理中GFP基因表达量是加入Omg/ml的隐孔菌提取物处理的二十分之一(图 2)。上述实验结果表明，隐孔菌提取物能够剂量依赖性地抑制重组慢病毒基因在Hela细胞内的RNA转录和基因表达，从而抑制病毒感染细胞。
权利要求
1.隐孔菌提取物在制备慢病毒抑制剂中的应用，所述隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体 中提取的水溶性物质。
2.隐孔菌提取物在制备抑制慢病毒在寄主细胞中合成RNA的产品中的应用，所述隐孔 菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质。
3.隐孔菌提取物在制备抑制慢病毒在寄主细胞中进行基因表达的产品中的应用，所述 隐孔菌提取物是从隐孔菌子实体中提取的水溶性物质。
4.隐孔菌在制备慢病毒抑制剂中的应用。
5.隐孔菌在制备抑制慢病毒在寄主细胞中合成RNA的产品中的应用。
6.隐孔菌提取物在制备抑制慢病毒在寄主细胞中进行基因表达的产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了隐孔菌的新用途。本发明所提供的隐孔菌的新用途是下述1)-3)中的至少一种1)隐孔菌或其提取物在制备慢病毒抑制剂中的应用；2)隐孔菌或其提取物在制备抑制慢病毒在寄主细胞中合成RNA的产品中的应用；3)隐孔菌或其提取物在制备抑制慢病毒在寄主细胞中进行基因表达的产品中的应用。
文档编号A61K36/06GK102949417SQ20121045503
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者王贺祥, 封文海, 高丽, 张薇薇, 马增强, 朱孟娟, 杜芳, 张瑞, 刘芹, 特日根, 陈晓, 王丽 申请人:中国农业大学