Tuft1在制备肝癌诊断和治疗制剂中的应用的制作方法

Tuft1在制备肝癌诊断和治疗制剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及TUFT1在制备肝癌诊断和治疗制剂中的应用。首次发现肝癌组织中TUFT1基因的表达显著高于周围的癌旁组织，提示检测TUFT1基因表达水平可成为肝癌早期诊断的辅助诊断指标之一，干扰TUFT1基因表达可成为肝癌治疗的新途径。
【专利说明】TUFT1在制备肝癌诊断和治疗制剂中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学特别是基因诊断和基因治疗领域，尤其是TUFTl在制备肝癌诊断和治疗制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上发病率和致死率较高的恶性肿瘤之一，全世界每年新发HCC病人中约50%在中国。HCC的发生发展和恶性转移机制是一个由多基因、多信号通路参与的复杂的网络调控系统。
[0003]哺乳动物TUFTl基因(编码Tuftelinl蛋白)最早是由Deutsch从牛成釉细胞的cDNA文库中鉴别、克隆并完成测序工作[Z.Mao等，The human Tuftelinlgene:cloningand characterization, Gene 279(2001) 181-196.]。之后，发现 Tuftelinl 蛋白在许多类型的组织中表达，包括矿化和非矿化组织均可表达[D.Deutsch等，The human Tuftelinlgene and the expression of Tuftelinl in mineralizing and nonmineralizingtissues, Connect Tissue Res.43(2002)425-434]。人类的 TUFTl 基因是单拷贝基因，大小为43279bp，位于lq21.3染色体上；包含13个外显子，开放阅读框为1170bp，编码全长为390个氨基酸的蛋白质(Tuftelinl)，不含信号肽序列[1.Thesleff等，Epithelial - mesenchymal signaling during tooth development, Connect TissueRes.32(1995)9-15]。目前研究Tuftelinl的功能主要是:参与牙釉质的矿化过程，促进牙齿的发育[J.V.Ruch 等；Int.J.Dev.Biol.39 (1995) 51-68 ;Α.S.Tucker 等，Moleculargenetics of tooth morphogenesis and patterning:the right shape in the rightplace, J.Dent.Res.78 (1999) 826-834]。
[0004]已有研究证实，Tuftelinl是一种缺氧诱导基因[P.T.Sharpe等，Test-tubeteeth, Sc1.Am.293(2005)34-41]，在生理情况下，Tuftelinl蛋白在肾脏和睾丸中表达量很高[D.Deutsch 等，Tuftelin`1-aspects ofprotein and gene structure, Eur.J.0ralSc1.106(Suppl.1) (1998) 315-323]，而肾脏和睾丸常处于低氧环境。现有技术中没有TUFTl与肿瘤的关系的研究报导。
[0005]目前临床已有的甲胎蛋白(AFP)等辅助诊断标记物具有一定的假阴性率，可以造成部分患者漏诊，且检测AFP难以排除慢性活动性肝炎、生殖腺肿瘤的干扰，诊断特异性有待提高。临床诊断仍然需要特异性高、敏感性好的可以在血清中方便检出的肿瘤标记物来协助AFP诊断肝癌。因此，本领域对于特定癌症的准确和特异性的检测有迫切的需求。

【发明内容】

[0006]本发明的目的在于提供TUFTl在肝癌诊断和治疗中的应用。
[0007]在本发明的第一方面，提供一种TUFTl基因或其编码的蛋白(Tuftelinl)的下调剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗肝癌的组合物。
[0008]在一个优选例中，所述的TUFTl基因或其编码的蛋白的下调剂选自:核酸抑制物(如干扰分子)，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子，其能够在蛋白或基因水平上下调TUFTl基因或其编码的蛋白的表达或活性。
[0009]在另一优选例中，所述的TUFTl基因或其编码的蛋白的下调剂选自:以TUFTl基因或其转录本为靶序列、且能够抑制TUFTl基因表达或基因转录的干扰分子，包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(SiRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；或特异性与TUFTl编码的蛋白结合的结合分子(如能够抑制TUFTl蛋白活性的抗体或配体)。
[0010]在另一优选例中，所述的TUFTl基因或其编码的蛋白的下调剂是选自下组序列的SiRNA:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6。
[0011]在另一优选例中，所述的TUFTl基因或其编码的蛋白的下调剂还用于:抑制肝癌细胞的侵袭、抑制肝癌细胞的增殖。
[0012]在本发明的另一方面，提供一种用于预防、缓解或治疗肝癌的TUFTl基因或其编码的蛋白的下调剂，其是选自下组序列的SiRNA:SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5或 SEQ ID NO:6。
[0013]在本发明的另一方面，提供一种用于预防、缓解或治疗肝癌的组合物，所述的组合物含有:
[0014](1)所述的TUFTl基因或其编码的蛋白下调剂(较佳地，为有效量的)；和
[0015](2)药学上可接受的载体。
[0016]在本发明的另一方面，提供一种筛选预防、缓解或治疗肝癌的潜在物质的方法，所述方法包括:
[0017](1)用候选物质处理表达或含有TUFTl基因或其编码的蛋白的体系；和
[0018](2)检测所述体系中TUFTl基因或其编码的蛋白的表达或活性；
[0019]其中，若所述候选物质可降低TUFTl编码蛋白的表达或活性(优选显著降低，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗肝癌的潜在物质。
[0020]在另一优选例中，所述的体系选自:细胞体系(如表达TUFTl的细胞，更特别如HCCLM3细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系.
[0021]在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于):针对TUFTl基因或其编码的蛋白或其上游或下游基因或蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。
[0022]在另一优选例中，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗肝癌有用的物质。
[0023]在另一优选例中，步骤(1)包括:在测试组中，将候选物质加入到表达或含有TUFTl基因或其编码的蛋白的体系中；和/或
[0024]步骤(2)包括:检测测试组的体系中TUFTl基因或其编码的蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有TUFTl基因或其编码的蛋白的体系；[0025]如果测试组中TUFTl基因或其编码的蛋白的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是预防、缓解或治疗肝癌的潜在物质。
[0026]在本发明的另一方面，提供一种TUFTl基因或其编码的蛋白或特异性识TUFTl基因或其编码的蛋白的试剂的用途，用于制备检测(包括诊断、疗效评估和预后预测)肝癌的试剂或试剂盒。
[0027]在另一优选例中，所述的特异性识别TUFTl基因或其编码的蛋白的试剂选自:
[0028]特异性扩增TUFTl基因的引物；
[0029]特异性识别TUFTl基因的探针；或
[0030]特异性结合TUFTl编码的蛋白的抗体或配体。
[0031]较佳的，所述的特异性扩增TUFTl基因的引物是引物对，序列如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11 所示。
[0032]较佳的，所述的特异性结合TUFTl编码的蛋白的抗体是SIGMA公司的Tuftelinl特异性抗体。
[0033]在本发明的另一方面，提供一种检测(包括诊断、疗效评估和预后预测)肝癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有:特异性识别TUFTl基因或其编码的蛋白的试剂(较佳地，所述的试剂是抗TUFTl抗体)；以及使用说明书或标签，其中说明所述试剂盒用于诊断肝癌。
[0034]在本发明的另一方面，提供一种检测肝癌的方法，该方法包括下列步骤:
[0035]a)将与放射性核素偶`联的TUFTl核酸探针输给动物；
[0036]b)检测所述核酸探针在体内的聚集；
[0037]c)所述聚集表明肝癌的存在。
[0038]在另一优选例中，所述放射性核素是α -32Ρ。
[0039]在另一优选例中，所述动物是人。
[0040]在本发明的另一方面，提供一种肝癌诊断试剂盒，该试剂盒含有容器，所述容器中含有抗TUFTl抗体；以及标签，所述标签说明所述试剂盒用于诊断肝癌。
[0041]在本发明的另一方面，提供一种体外检测特异性TUFTl蛋白表达的方法，该方法包括:用抗TUFTl蛋白特异性抗体或TUFTl特异性核酸探针与细胞样品反应，以正常肝细胞为对照；比较抗体或探针的结合量，其中高于对照的量表明该细胞为肝癌细胞，低于或等于对照的量表明该细胞为正常细胞。
[0042]在另一优选例中，所述结合量是通过检测与探针或抗体偶联的可检测基团测得的。
[0043]在另一优选例中，所述可检测基团选自生色团、化学发光基团、荧光团或同位素。
[0044]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】

【附图说明】
[0045]图1、18对肝癌/癌旁组织TUFTl表达(C=肝癌，N=癌旁)。
[0046]图2、TUFTl在肝癌癌组织和癌旁组织的mRNA水平的Real Time-PCR分析(C=肝
癌，N=癌旁)。
[0047]图3、肝癌组织免疫组化染色结果。[0048]图4、癌旁组织免疫组化染色结果。
[0049]图5、TUFTl在肝癌细胞株中的表达情况(Real Time PCR结果)。
[0050]图6、TUFTl在肝癌细胞株中的表达情况(Western Blot结果)。
[0051]图7、SMMC-7721过表达细胞单克隆株的筛选结果。
[0052]图8、SMMC-7721过表达细胞CCK-8细胞增殖实验结果以及HCC-LM3细胞干扰后增
殖实验结果。
[0053]图9、过表达TUFTl对SMMC-7721细胞的侵袭作用效果，其中右图是左图的细胞平均数的统计结果。
[0054]图10、干扰TUFTl对HCCLM3细胞的侵袭作用效果，其中右图是左图的细胞平均数的统计结果。
[0055]图11、过表达TUFTl对SMMC-7721细胞的抗失巢凋亡作用效果。
【具体实施方式】
[0056]本发明人经过深入的研究，首次发现肝癌组织中TUFTl基因的表达显著高于周围的癌旁组织，提示检测TUFTl基因表达水平可成为肝癌早期诊断的辅助诊断指标之一，干扰TUFTl基因表达可成为肝癌治疗的新途径。
[0057]TUFTl及其用途
[0058]TUFTl基因编码的Tuftelinl蛋白(下文也称为TUFTl蛋白)包括全长的Tuftelinl蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的TUFTl蛋白的氨基酸序列可以与SEQID N0:2所示的序列基本上相同。所述的TUFTl基因的核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列或该序列的简并序列基本上相同。
[0059]本发明人构建了表达TUFTl的慢病毒载体以及表达针对TUFTl设计的SiRNA序列，并转染肝癌细胞，得到TUFTl过表达和干扰的肝癌细胞株，用于评价TUFTl过表达和干扰对肝癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移的影响。结果发现，TUFTl是一个新的、对肝癌的研究有用的药物靶点。针对TUFTl的各种治疗手段可以作为抑制肝癌的新颖和有效的手段。
[0060]TUFTl的下调剂及其用途
[0061]基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种TUFTl的下调剂的用途，用于制备抑制(哺乳动物)肝癌的组合物。
[0062]如本文所用，所述的TUFTl基因或蛋白的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。
[0063]所述的TUFTl基因或蛋白的下调剂是指任何可降低TUFTl蛋白的活性、降低TUFTl基因或蛋白的稳定性、下调TUFTI蛋白的表达、减少TUFTI蛋白有效作用时间、或抑制TUFTI基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调TUFTl有用的物质，从而可用于预防或治疗肝癌。例如，所述的抑制剂是:核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，只要其能够在蛋白或基因水平上下调TUFTl蛋白或其编码基因的表达。
[0064]作为本发明的一种选择方式，所述的TUFTl的下调剂是一种特异性与TUFTl结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用TUFTl蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达TUFTl或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur.J.1mmunol.6:511,1976 ；Kohler等人，Eur.J.1mmunol.6:292,1976 ;Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas, Elsevier, N.Y.，1981)。抗体的“特异性”是指抗体能结合于TUFTl基因产物或片段。较佳地，指那些能与TUFTl基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。抗Tuftelinl蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的Tuftelinl蛋白含量，还可以作为用于预防肝癌转移和侵袭的特异性治疗剂。血样或尿液中的Tuftelinl蛋白的直接测定可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标，也可作为肿瘤早期诊断的依据。抗体可以通过ELISA、Western Blot印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光、同位素示踪等方法来检测。
[0065]在得知了所针对的下调对象(TUFTl)后，可以设计出合适的SiRNA或shRNA等干扰分子，这些干扰分子都可应用于本发明中。
[0066]作为本发明的一种优选方式，所述的TUFTl的下调剂是一种TUFTl特异性的小干扰RNA分子(small interfering RNA, Si RNA) ?如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式,它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
[0067]在筛选有效的SiRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，结果检测出4种干扰效果较好的干扰分子，它们分别具有SEQ ID NO: 3,SEQ IDNO:4,SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所`示的序列，进一步地在细胞、动物水平实验，结果证明对于体内试验而言抑制效率非常高。`
[0068]作为本发明的一种可选方式，所述的TUFTl的下调剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA) ”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由编码需要的转录物的双链DNA模板来表达。编码需要的转录物的双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA (或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。[0069]本发明中，所述的“基本互补”或“基本上互补”指的是一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列有至少80%，较佳的90%，更佳的95%，最佳的100%的互补性。
[0070]本发明的核酸抑制物如SiRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
[0071]基因表达载体包括非病毒载体和病毒载体，其中病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体等。慢病毒载体将HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离而构建的载体系统，包括包装成分和载体成分:包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。包装成分可分别构建在两个质粒上，即一个表达gag和pol、另一个表达env，与载体质粒构成三质粒表达系统。为了进一步降低同源重组形成有复制能力的病毒(RCV)的可能性,Dull等人将包装质粒中的辅助基因去除,将gag-pol的转运需要的rev构建到另一个质粒上，构建成四质粒表达系统。
[0072]组合物
[0073]本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.00000 l-50wt% ;较佳的0.00001-20wt% ;更佳的，0.0001-10wt%)的所述的TUFTl的下调剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肝癌。任何前述的TUFTl的下调剂均可用于组合物的制备。
[0074]如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所 述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
[0075]在得知了所述TUFTl基因或蛋白的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于:皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
[0076]优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将TUFTl的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带TUFTl的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的TUFTl下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
[0077]本发明所述的TUFTl的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的TUFTl基因或蛋白的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的TUFTl的下调剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0078]药物筛选
[0079]在得知了 TUFTl与肝癌的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制TUFTl的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于预防或治疗肝癌真正有用的药物。
[0080]因此，本发明提供一种筛选抑制肝癌的潜在物质的方法，所述的方法包括:用候选物质处理表达TUFTl的体系；和检测所述体系中TUFTl的表达或活性；若所述候选物质可抑制TUFTl的表达或活性，则表明该候选物质是抑制肝癌的潜在物质。所述的表达TUFTl的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达TUFTl的细胞；或可以是重组表达TUFTl的细胞。所述的表达TUFTl的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
[0081]在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到TUFTl的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达TUFTl的体系。
[0082]作为本发明的优选方式，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肝癌真正有用的物质。
[0083]本发明对于TUFTl蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)=SDS-PAGE法，Western-Blot 法等。
[0084]另一方面，本发明`还提供了采用所述筛选方法获得的抑制肝癌的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制TUFTl的表达和活性，进而抑制肝癌有用的物质。
[0085]检测试剂或试剂盒
[0086]基于本发明人的上述新发现，可以将TUFTl作为检测肝癌的标志物:(i)进行肝癌细胞的鉴别诊断；(ii)评估相关人群的肝癌治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群肝癌患病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由TUFTl基因表达异常而潜在高发肝癌的人群，从而可进行更有针对性地诊断或治疗。
[0087]因此，本发明提供了 TUFTl基因或蛋白的用途，用于制备诊断(或检测)肝癌的试剂或试剂盒。
[0088]可采用各种本领域已知的技术来检测TUFTl的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。
[0089]本发明还提供了用于在分析物中检测TUFTl的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增TUFTl的引物；或特异性识别TUFTl的探针来确定TUFTl的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合TUFTl蛋白的抗体或配体来确定TUFTl蛋白的表达情况。
[0090]针对TUFTl的引物或特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与TUFTl基因上特定位点发生特异性结合，而不与TUFTl基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。
[0091]在获得了核酸序列后，可根据核酸序列设计特异性核酸探针。设计探针的方法是本领域常规的，可见Sambrook等人,分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述。检测生物样品中是否存在Tuftelinl蛋白或核酸的示范性方法包括获得测试受试者的生物样品，使该生物样品接触能与TUFTl mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。该核酸探针可以是，例如人的核酸或及一部分，如长至少15、30、50、100个核苷酸并能在严谨条件下与TUFTl mRNA或基因组DNA充分杂交的核酸探针。核酸探针与扩增的标记序列接触。该探针优选连接到一种发色团，但可被放射标记。在另一个实施例中，探针连接到一种结合伴侣上，如抗体或生物素，或另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。
[0092]在传统的方法中，检测可通过Southern印迹以及与标记的探针杂交来进行。Southern印迹所涉及的技术是本领域技术人员所熟知的(参见Sambrook等，1989)。常规的检测还有生物芯片、荧光显影技术、细胞流式计数等。
[0093]利用特异性结合TUFTl蛋白的抗体来检测分析物中TUFTl蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。
[0094]本发明还提供了用于在分析物中检测TUFTl的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括:特异性扩增TUFTl基因的引物；特异性识别TUFTl基因的探针；或特异性结合TUFTl蛋白的抗体或配体。
[0095]在一个非限制的实例中，所述试剂盒将以适当的容器形式包含这些试剂中的一种或多种。所述试剂盒也可包含用于RNA分离、扩增细胞中RNA的纯化的试剂、标记等。
[0096]此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于:抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。
[0097]试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
[0098]此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。
[0099]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0100]实施例1、肝癌组织切片的免疫组化研究
[0101]本发明收集了 254对肝癌患者的肝癌组织标本和癌旁组织(正常组织)标本，进行组织病理学研究。其中52对样本购自上海芯超生物科技有限公司，另外202对样本由上海交通大学附属仁济医院以及上海东方肝胆外科医院提供。
[0102]本发明将肝癌组织和癌旁组织制成石蜡切片，采用Tuftelinl特异性抗体(多克隆抗体，购自SIGMA公司；一抗)、辣根过氧化物酶标记二抗(购自Abmart公司；HRP_ 二抗)、二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色底物进行免疫染色。经免疫染色的成对标本切片进行镜检，以癌旁组织切片为对照，肝癌组织切片染色较深者为高表达，较浅者为低表达，进行组织病理学研究，并统计研究结果。
[0103]选取部分标本,采用Tuftelinl特异性抗体(一抗)、抗兔突光二抗,进行WesternBlot研究，用于和免疫组化结果进行验证。
[0104]免疫染色实验
[0105]上述肝癌组织、癌旁组织顺序编号，按常规方法制备石蜡切片。
[0106]将石蜡切片置于60°C烘片机上烘烤20分钟，然后按二甲苯10minx2-l/2 二甲苯10min-100% 酒精 10minx2_95% 酒精 10min_85% 酒精 10min_75% 酒精 IOmin 流程脱蜡。将脱蜡完毕的切片在流水中冲洗10分钟，然后放置于0.01M柠檬酸钠缓冲液中在沸水浴中抗原复活10分钟。将切片自然冷却至室温后，放置于37°C 0.3%H202中去除内源过氧化物酶。用IXPBS清洗一遍后用10%BSA室温封闭I小时，然后用1%BSA配置好的一抗4°C孵育过夜。第二天用I X PBS清洗3遍，用1%BSA配置的HRP 二抗室温孵育1-2小时。之后用IXPBS清洗3遍，用DAB显色液进行显色5-10秒。显色完毕后用流水冲洗10分钟以上，然后再用苏木精染色I分半，在流水中冲洗5分钟。之后按75%酒精5min-85%酒精5min_95%酒精5min-100%酒精5minX 2-1/2 二甲苯5min_ 二甲苯5minX 2流程进行脱水。最后用中性树脂封片。
[0107]结果
[0108]用显微镜观察肝癌组织样本中TUFTl的表达的染色情况。以癌旁组织作为对照，按照阳性反应的区域大小以及颜色的强弱将标本分组并进行统计。18对肝癌/癌旁组织TUFTl表达情况如图1 ; 18对肝癌/癌旁组织中，肝癌组织标本表达量显著高于癌旁组织标本的占72.22%。
[0109]进一步统计发现，254对`标本中，70.4%肝癌组织标本中TUFTl表达显著高于癌旁组织。如图2。
[0110]代表性的肝癌组织免疫组化染色结果如图3所示。
[0111]代表性的癌旁组织免疫组化染色结果如图4所示。
[0112]实施例2、干扰、过表达慢病毒载体构建及慢病毒包装
[0113]TUFTl基因采用人TUFTl cDNA的完整编码区(开放阅读框)作为目的基因，完整编码区序列如下(SEQ ID NO:1):
[0114]atgaacggga cgcggaactg gtgtaccctg gtggacgtgc acccagagga ccaggcggcg 60
[0115]ggcagcgtgg acattctcag gctgactctc cagggtgaac tgacaggaga tgaacttgaa 120
[0116]cacatagccc agaaggcggg caggaagacc tatgccatgg tgtccagcca ctcagctggt 180
[0117]cattctctgg cttcagaact ggtggagtcc catgatggac atgaggagat cattaaggtg 240
[0118]tacttgaagg ggaggtctgg agacaagatg attcacgaga agaatattaa ccagctgaag 300
[0119]agtgaggtcc agtacatcca ggaggccagg aactgcctac agaagctccg ggaggatata 360
[0120]agtagcaagc ttgacaggaa cctaggagat tctctccatc gacaggagat acaggtggtg 420
[0121]ctagaaaagc caaatggctt tagtcagagt cccacagccc tgtacagcag cccacctgag 480
[0122]gtggacacct gtataaatga ggatgttgag agcttgagga agacggtgca ggacttgctg 540
[0123]gccaagcttc aggaggccaa gcggcaacac cagtcagact gtgtggcttt tgaggtcaca 600
【权利要求】
1.一种TUFTl基因或其编码的蛋白的下调剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗肝癌的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TUFTl基因或其编码的蛋白的下调剂选自: 核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子，其能够在蛋白或基因水平上下调TUFTl基因或其编码的蛋白的表达或活性。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的TUFTl基因或其编码的蛋白的下调剂是选自下组序列的 SiRNA:SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID N0:6。
4.一种用于预防、缓解或治疗肝癌的TUFTl基因或其编码的蛋白的下调剂，其特征在于，其是选自下组序列的 SiRNA:SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQ ID N0:6。
5.一种用于预防、缓解或治疗肝癌的组合物，其特征在于，所述的组合物含有: (1)权利要求4所述的TUFTl基因或其编码的蛋白下调剂；和 (2)药学上可接受的载体。
6.一种筛选预防、缓解或治疗肝癌的潜在物质的方法，所述方法包括: (1)用候选物质处理表达或含有TUFTl基因或其编码的蛋白的体系；和 (2)检测所述体系中TUFTl基因或其编码的蛋白的表达或活性； 其中，若所述候选物质可降低TUFTl编码蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗肝癌的潜在 物质。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括:在测试组中，将候选物质加入到表达或含有TUFTl基因或其编码的蛋白的体系中；和/或 步骤(2)包括:检测测试组的体系中TUFTl基因或其编码的蛋白的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有TUFTl基因或其编码的蛋白的体系； 如果测试组中TUFTl基因或其编码的蛋白的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是预防、缓解或治疗肝癌的潜在物质。
8.—种TUFTI基因或其编码的蛋白或特异性识TUFTI基因或其编码的蛋白的试剂的用途，用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的特异性识别TUFTl基因或其编码的蛋白的试剂选自: 特异性扩增TUFTl基因的引物； 特异性识别TUFTl基因的探针；或 特异性结合TUFTl编码的蛋白的抗体或配体。
10.一种检测肝癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有:特异性识别TUFTl基因或其编码的蛋白的试剂；以及使用说明书或标签，其中说明所述试剂盒用于诊断肝癌。
【文档编号】A61K45/00GK103800919SQ201210455058
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月14日 优先权日:2012年11月14日
【发明者】张志刚, 马铭泽, 李军 申请人:上海市肿瘤研究所