针对磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和t细胞抗原的双特异性抗体的制作方法
【专利摘要】本发明的第一方面涉及一种双特异性抗体，其包含特异性识别磷脂酰肌醇蛋白多糖-3的第一功能域，特异性识别人T细胞抗原CD3的第二功能域，和连接上述功能域的接头。本发明的第二方面涉及编码上述抗体的核苷酸序列。本发明的第二方面涉及包含上述核苷酸序列的载体，包括表达性载体。本发明的第四方面涉及包含上述载体的真核或原核表达系统。本发明的第五方面涉及上述抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
【专利说明】针对磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和T细胞抗原的双特异性抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤相关抗体，更具体的，基因工程抗体领域。
【背景技术】[0002]磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3,又称DGSX，GTR2-2，MXR7, 0C1-5，SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70-kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40-kDa左右能够分泌进入血液的可溶性氨基端肽，和30-kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的羧基端肽。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚依附在细胞膜上。
[0003]GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织。但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出GPC3的表达。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤等肿瘤中的高表达，GPC3被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。
[0004]利用抗GPC3抗体进行肝癌检测和利用抗GPC3抗体的抗体依赖的(ADCC)或补体依赖的(CDC)细胞毒性的研究已有报道，例如CN101186650A(中外制药株式会社)，发明名称为“抗存在于血液中的GPC3的分泌性N-端肽或C-端肽的抗体” ；CN102180969A(中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所)，发明名称为“抗肝癌活性单克隆抗体及其应用”，其涉及用GPC3氨基端359-580位氨基酸残基为抗原制备的抗GPC3单克隆抗体；CN101633693A (中国人民解放军第二军医大学)，其涉及针对GPC3的氨基端抗原的单克隆抗体；CN101052878A (株式会社英仙蛋白质科学)，其涉及以使用识别GPC3的N端部位的抗体测定GPC3为特征的监控肝炎重症化的方法；CN1842540A (中外制药株式会社)，其涉及一种据称与传统抗体相比具有较高ADCC活性和CDC活性的抗GPC3单克隆抗体。
[0005]此外，表1总结了另外一些自2003年来报道的针对GPC3的单克隆抗体(mAbs)。其中，一种针对GPC3的治疗性mAb最近被报道(Advances in LiverCancer AntibodyTherapies:A Focus on Glypican-3 and Mesothelin, BioDrugs.2011 October I ；25 (5):275-284.)，其针对GPC3位于C端524-563位氨基酸残基形成的抗原决定簇。根据该报道单克隆抗体GC33(IgG2a，κ)诱导抗体依赖细胞毒作用(ADCC)并表现出抑制小鼠皮下移植HepG2和HuH-7异种移植物的肿瘤生长，其抗肿瘤作用主要源于自然杀伤细胞。
[0006]表1.已知的一些抗GPC3单克隆抗体
【权利要求】
1.一种双特异性抗体，其包含： 特异性识别磷脂酰肌醇蛋白多糖-3的第一功能域， 特异性识别人T细胞抗原CD3的第二功能域，和 连接上述功能域的接头。
2.权利要求1所述的抗体，其中第一功能域特异性识别GPC3的C末端肽。
3.权利要求1所述的抗体，其中第一和/或第二功能域选自完整抗体，单链抗体(scFV)，Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab，)2片段和其衍生物。
4.权利要求1所述的抗体，其中第一和/或第二功能域各自为包含一个重链可变区和一个轻链可变区的单链抗体。
5.权利要求1的抗体，其中第一功能域的氨基酸序列为，SEQID NO :5或与该氨基酸序列相似性为95%及以上的氨基酸序列。
6.权利要求1的抗体，其中第二功能域的氨基酸序列为，SEQID NO :7或与该氨基酸序列相似性为95%及以上的氨基酸序列。
7.权利要求1所述的抗体，其中第一和/或第二功能域是人源化的，嵌合的或鼠源的。
8.编码权利要求1-7任一所述的抗体的核苷酸序列。
9.包含有权利要求8所述核苷酸序列的载体。
10.权利要求9的载体，其为pH载体。
11.包含有权利要求9所述的载体的真核宿主细胞或原核宿主细胞。
12.权利要求11的真核宿主细胞，其为中国仓鼠卵巢细胞。
13.权利要求1-7任一所述的抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK103833852SQ201210480326
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月23日 优先权日:2012年11月23日
【发明者】李宗海, 王华茂, 蒋华, 石必枝, 王红阳, 杨胜利, 顾健人 申请人:上海市肿瘤研究所