专利名称：白藜芦醇纳米脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明属于功能性保健食品技术领域，涉及一种白藜芦醇纳米脂质体及其制备方法。
背景技术：
白藜芦醇又称芪三酚，是植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌、病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒素，具有抗癌、抑菌、抗炎症、保护心血管、调节雌激素、保护神经和肝脏、抗辐射、镇咳平喘、降低血压、改善微循环、治疗艾滋病和休克等多种生理功能，被美国《抗衰老圣典》列为“100种最热门有效的抗衰老物质”之一。但由于白藜芦醇化学性质不稳定，见光遇热易分解，且水溶性差，因此存在口服吸收性差、生物利用率低、难以持久作用等缺点，导致其应用受到一定程度的限制。纳米脂质体作为一种新型药物载体，是以卵磷脂、胆固醇等为膜材对目的物质进行包封，制成的一种具有类似生物膜结构的双分子层囊泡，具有稳定性好、靶向性强、可延缓释放、无免疫毒性等特点，成为近年来现代医学和食品功能化学共同关注的焦点。因此，将纳米脂质体用于白藜芦醇的包封与载运，有利于提高其生物利用率与缓释作用，促进其渗皮吸收性，从而进一步扩大其在食品、药品、化妆品等行业的应用范围。目前，纳米脂质体的制备方法主要有薄膜分散法、逆向蒸发法、乙醇注入法、超声法、高压均质法等，但都存在有机试剂残留、磷脂成分易氧化、生产成本高、周期长，制备过程难以控制等缺点，放大为工业化生产存在难度
发明内容
本发明的目的是提供一种白藜芦醇纳米脂质体及其制备方法。本发明提供的制备白藜芦醇纳米脂质体的方法，包括如下步骤将白藜芦醇、膜材、抗氧化剂和有机溶剂混合溶解，成膜同时除去所述有机溶剂，再加入缓冲液进行水合，得到白藜芦醇脂质体的粗悬液，将所得粗悬液进行高压微射流处理，得到所述白藜芦醇纳米脂质体。上述方法中，所述混合溶解的方法为超声；所述成膜同时除去所述有机溶剂的方法为减压旋转蒸发。构成所述膜材的物质选自大豆卵磷脂、脑磷脂、神经鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、牛胆酸钠、谷留醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种，优选大豆卵磷脂和胆固醇中的至少一种；所述抗氧化剂选自维生素Ε、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和二丁基羟基甲苯中的至少一种,优选维生素E ；所述有机溶剂选自无水乙醇、甲醇、氯仿、乙醚和石油醚中的至少一种，优选乙醇。所述白藜芦醇、膜材、抗氧化剂、有机溶剂和缓冲液的用量比为O. 05 lg:1 2g 0. 04 O. 5g :200 500mL :15(T350mL,优选 O.1g :1.1g :0.1g 500mL 250mL,具体为0.05-0.1g 1. 1-1. 5g 0. 04-0.1g :200_500mL :150_250mL 或 0.1-1g :1. 0-1.1g :0. 1-0. 5g 5OOmL :250_350mL 或 0.05-1. Og :1.0-1. 5g :0.04-0. 5g :200_500mL :150_350mL 或 0.05g
1.5g 0. 04g 200mL 150mL 或 Ig :1. Og :0. 5g 500mL 350mL ；所述缓冲液为pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，浓度为O. 002、. 02mol/L,优选O. 01mol/L，具体为 O. 002-0. 01mol/L。所述超声步骤中，超声频率为28 IOOHz，，优选45Hz，具体为45-100HZ或28-45HZ，功率12(T300W，优选240W，具体为120-240W或240-300W ;时间为3 5min，具体为3_4min或4-5min，温度为 40 6(TC，优选 45°C，具体为 40_45°C或 45_60°C ；所述减压旋转蒸发步骤中，温度为4(T60°C，优选45°C，具体为40_45°C或45-60 °C，真空度为-O. 09 -O.1MPa,具体为-O. 09 或-O. 01 或-O. 08 或-O. 08 至-O. 01或-O. 09 至-O. 01 或-O. 09 至-O. 08MPa ；所述水合步骤中，温度为4(T60°C，优选45°C，具体为40_45°C或45_60°C，时间为20 45min,优选 30min,具体为 20_30min 或 30_45min ；所述高压微射流处理步骤中，处理压力为1000(T30000PSI，优选18000PSI，具体为10000-18000PSI或18000-30000PSI，循环次数为I 6次，优选3次，具体为1-3次或3-6次；为了将减压旋转蒸发所得类脂膜洗至水合介质中，以利于洗膜完全，避免有部分类脂膜粘附在茄形瓶壁上，难以洗下来，上述制备白藜芦醇纳米脂质体的方法，还可包括在所述溶解步骤之后，所述水合步骤之前，向所述缓冲液中加入玻璃珠。利用上述方法制备得到的白藜芦醇纳米脂质体，也属于本发明提供的保护范围。所述脂质体的粒径为24. 53 219. 2nm，Zeta电位为-24. 6 _65mV，包封率为34. 40% 89. 30%,具体为 75. 27%、88. 27%、88. 68%、75. 27%-88. 68%、75. 27%-88. 27% 或 88. 27%-88. 68% ；pH值为7.33 7.47，且对人肝癌细胞册 6-2、人胃癌细胞463的抑制率分别为31. 589Γ76. 85%、11. 49% 58. 37%。本发明优选条件下提供的白藜芦醇纳米脂质体特征为外观呈均匀乳白色悬浮液，电镜下呈圆形或椭圆形微球体，颗粒间分散、独立，粒径为(76. 09±1. 38) nm, Zeta电位(-53. 90±2. 26) mV，包封率为 88. 27%，pH 值(7. 35±O. 035)，且对人肝癌细胞 HEPG-2、人胃癌细胞AGS的抑制率分别为76. 85%和58. 37%。另外，上述本发明提供的白藜芦醇纳米脂质体在制备抑制肿瘤细胞产品中的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述肿瘤细胞具体为肝癌细胞或胃癌细胞；所述肝癌细胞具体为人肝癌细胞HEPG-2 ;所述胃癌细胞具体为人胃癌细胞AGS。本发明采用高压微射流法经过溶解、脂质形成、充分水合、微射流分散等步骤制得白藜芦醇纳米脂质体，具有如下有益效果1、制备方法操作简便、易于控制、清洁安全、无有毒有机溶剂残留，且可连续化生产。2、制得的纳米脂质体形态均一、粒径小、包封率高、稳定性好，实现了白藜芦醇的载运与缓释，改变其溶解性，提高其生物利用率。
3、本发明提供的脂质体中含有抗氧化剂，避免了药物由体内外氧化而造成的毒副作用，降低不良反应。
图1为白藜芦醇纳米脂质体的透射电镜图。图2为白藜芦醇纳米脂质体的粒径分布图。图3为白藜芦醇纳米脂质体的Zeta电位图。图4为高效液相色谱(HPLC)测定白藜芦醇的谱具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例1、白藜芦醇纳米脂质体制备准确称取O.1g白藜芦醇、Ig大豆卵磷脂、O.1g胆固醇和O.1g抗氧化剂VE，加入500mL无水乙醇，于45HZ、240W条件下45°C水浴超声3min至充分溶解，45°C水浴条件下减压(真空度-O. 09MPa)旋转蒸发除去乙醇，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。加入250mL0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7. 4)和适量玻璃珠，45°C水浴条件下旋转水合30min，得到白藜芦醇脂质体粗悬液。将白藜芦醇粗悬液于高压微射流仪器中分散，18000PSI条件下循环3次，即得到白藜芦醇纳米脂质体。实施例2、白藜芦醇纳米脂质体制备准确称取O. 05g白藜芦醇、Ig蛋黄卵磷脂、O. 5g牛胆酸钠和O. 04g抗氧化剂丁基羟基茴香醚，加入200mL无水甲醇，于28HZ、120W条件下40°C水浴超声5min至充分溶解，40°C水浴条件下减压(真空 度-O. OlMPa)旋转蒸发除去乙醇，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。加入150mL0. 002mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7. 4)和适量玻璃珠，40°C水浴条件下旋转水合45min，得到白藜芦醇脂质体粗悬液。将白藜芦醇粗悬液于高压微射流仪器中分散，10000PSI条件下循环6次，即得到白藜芦醇纳米脂质体。实施例3、白藜芦醇纳米脂质体制备准确称取Ig白藜芦醇、1. Sg脑磷脂、O. 2g 谷留醇和O. 5g抗氧化剂二丁基羟基甲苯，加入500mL石油醚，于100HZ、300W条件下60°C水浴超声4min至充分溶解，60°C水浴条件下减压(真空度-O. OSMPa)旋转蒸发除去乙醇，直至茄形瓶壁上形成一层均匀的脂质薄膜。加入350mL0. 002mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7. 4)和适量玻璃珠，60°C水浴条件下旋转水合20min，得到白藜芦醇脂质体粗悬液。将白藜芦醇粗悬液于高压微射流仪器中分散，30000PSI条件下循环I次，即得到白藜芦醇纳米脂质体。实施例4、白藜芦醇纳米脂质体的质量评价形态观察取实施例1制备所得白藜芦醇纳米脂质体以O. 01mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7. 4)稀释至较低浓度，滴于铜网上，用滤纸吸干多余的液体，醋酸铀染色3min，染色三次后于透射电镜下观察产物的形态，如图1所示，呈圆形或椭圆形微球体，颗粒间分散、独立，且粒径< lOOnm。粒径与Zeta电位测定取适量白藜芦醇纳米脂质体，用0. 45um滤膜过滤，采用Malvern Zeta电位仪测定其粒径与Zeta电位，测得粒径为(76. 09±1· 38) nm, Zeta电位(-53. 90±2. 26) mV，其粒径分布图如图2所示，Zeta电位图如图3所示。
pH 值测定结果为 · 35 ± (λ 035。包封率EE (%)测定(I) HPLC法建立白藜芦醇标准曲线色谱条件为测定仪器WaterS1525型高效液相色谱仪(配有紫外和示差检测器)；色谱柱C18柱，150mmX4. 6mm, 5um ;流动相乙腈/水/冰醋酸=25:75:0. 09 (V/V),流速O. 7mL/min,检测波长306nm，进样量10uL，柱温30°C。标准曲线的绘制精密称取12. 5mg (精确至O. OOOlg)白藜芦醇标准品，用甲醇溶解并定容至250mL，得到50mg/L白藜芦醇标准贮备液。准确移取1、2、4、6、8、IOmL白藜芦醇标准贮备液，用甲醇稀释并定容至50mL，得到一系列的标准工作溶液，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=l. 02 X 105x+0. 904X IO5 (r2=0. 9998)式中y为峰面积，X为白藜芦醇浓度(ug/mL)。(2)包封率EE (%)的测定取适量白藜芦醇纳米脂质体，采用HPLC测定其质量浓度C1。取5mL纳米脂质体于分子截留量为8000-14000D的透析袋中，置于200mL0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7. 4)中透析24h，每隔2h更换I次透析液。取出透析后的纳米脂质体，采用HPLC测定其质量浓度C2。计算其包封率EE (%)= / X 100%。如图4所示，经HPLC测得透析前白藜芦醇的峰面积为460868AU · min,透析后白藜芦醇的峰面积为407868AU · min，代入标准曲线分别计算其浓度C1' C2，根据EE (%) =C2/C1X 100%得包封率为88. 27%。
按照与上相同的方法，测得实施例2和3所得白藜芦醇脂质体的包封率分别为88. 68% 和 75. 27%。体外抗肿瘤活性测定收集生长良好的肿瘤细胞人肝癌细胞HEPG-2 (购自上海抚生试剂公司AGS细胞)、人胃癌细胞AGS(购自上海瑞齐生物科技有限公司)，用含10%胎牛血清的RPM1-1640或DMEM培养基配成6X 104/ml细胞悬液，接种于96孔板内，每孔100 μ I, 37°C、5%C02孵箱培养24h后，加入待测药液(药物终浓度6. 25、12. 5、25、50、100μ g/ml)，每浓度设3个平行孔，同时设空白对照。培养48h后弃上清，每孔加入MTT液10 μ I (5mg/mlRPM1-1640培养基配制)后继续培养4h，每孔加入200 μ 1DMS0，摇勻，用Bio-Tek MQX200型酶标仪在检测波长57Onnu参考波长450nm下测吸光度(A)值，抑制率计算(A空自对照一A样品)/A空自对照X 100。测定得白藜芦醇脂质体对人肝癌细胞HEPG-2的半抑制浓度(IC5tl)为52. 183ug/mL, 100ug/mL浓度条件下对其抑制率达76. 85% ;对人胃癌细胞AGS的半抑制浓度(IC5tl)为46. 809ug/mL, 50ug/mL浓度条件下对其抑制率达58. 37%。
权利要求
1.一种制备白藜芦醇纳米脂质体的方法，包括如下步骤将白藜芦醇、膜材、抗氧化剂和有机溶剂混合溶解，成膜同时除去所述有机溶剂，再加入缓冲液进行水合，得到白藜芦醇脂质体的粗悬液，将所得粗悬液进行高压微射流处理，得到所述白藜芦醇纳米脂质体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述混合溶解的方法为超声；所述成膜同时除去所述有机溶剂的方法为减压旋转蒸发。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于构成所述膜材的物质选自大豆卵磷脂、脑磷脂、神经鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、胆固醇、牛胆酸钠、β -谷留醇和胆固醇乙酰酯中的至少一种，优选大豆卵磷脂和胆固醇中的至少一种；所述抗氧化剂选自维生素Ε、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和二丁基羟基甲苯中的至少一种，优选维生素E ;所述有机溶剂选自无水乙醇、甲醇、氯仿、乙醚和石油醚中的至少一种，优选乙醇。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述白藜芦醇、膜材、抗氧化剂有机溶剂和缓冲液的用量比为O. 05 Ig T2g 0. 04 O. 5g :200 500mL :15(T350mL,优选O.1g :1.1g :0.1g 500mL 250mL ；所述缓冲液为pH值为7· 4的磷酸盐缓冲液，浓度为O. 002、· 02mol/L,优选O. Olmol/L0
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述超声步骤中，超声频率为28 IOOHz，，优选45Hz，功率120 300W，优选240W ;时间为3 5min，温度为40 6(TC，优选45 0C ；所述减压旋转蒸发步骤中，温度为4(T60°C，优选45°C，真空度为-O. 09 -O.1MPaJt选-O.1MPa ；所述水合步骤中，温度为4(T60°C，优选45°C，时间为2(T45min，优选30min ；所述高压微射流处理步骤中，处理压力为1000(T30000PSI，优选18000PSI，循环次数为I飞次，优选3次。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括在所述溶解步骤之后，所述水合步骤之前，向所述缓冲液中加入玻璃珠。
7.权利要求1-6任一所述方法制备得到的白藜芦醇纳米脂质体。
8.根据权利要求7所述的脂质体，其特征在于所述脂质体的粒径为24.53^219. 2nm,优选 76. 09 ±1. 38nm ；Zeta 电位为-24. 6 _65mV，优选-53. 90 ±2. 26mV ；包封率为34. 40% 89. 30%，优选88. 27% ；pH 值为 7. 33 7. 47，优选 7. 35±0· 035 ；对人肝癌细胞HEPG-2和人胃癌细胞AGS的抑制率分别为31. 589Γ76. 85%和11.49% 58. 37%，优选分别为 76. 85% 和 58. 37%。
9.权利要求7或8所述白藜芦醇纳米脂质体在制备抑制肿瘤细胞产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞具体为肝癌细胞或胃癌细胞；所述肝癌细胞具体为人肝癌细胞HEPG-2 ；所述胃癌细胞具体为人胃癌细胞AGS。
全文摘要
本发明公开了一种白藜芦醇纳米脂质体及其制备方法。该方法，包括如下步骤将白藜芦醇、膜材、抗氧化剂和有机溶剂混合溶解，成膜同时除去所述有机溶剂，再加入缓冲液进行水合，得到白藜芦醇脂质体的粗悬液，将所得粗悬液进行高压微射流处理，得到所述白藜芦醇纳米脂质体。本发明采用高压微射流法经过溶解、脂质形成、充分水合、微射流分散等步骤制得白藜芦醇纳米脂质体。该白藜芦醇纳米脂质体均匀一致，粒径小，包封率高，稳定性良好。
文档编号A61P35/00GK103040754SQ20121056012
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者王强, 刘红芝, 刘丽, 陈琼玲, 胡晖 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所