专利名称：一种预测前列腺癌易感性的方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预测前列腺癌易感性的方法和试剂，更具体的说是通过测定与前列腺癌相关RFX6和GPRC6A基因间区rs339319位点多态性预测受试者对于前列腺癌的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断和新药开发，属于生物技术领域。
背景技术：
前列腺癌(prostate cancer, PCa)是发生在男性生殖系统中最常见的恶性肿瘤。美国在对1975-2006癌症发病率进行统计后，估算2010年PCa新发病例为217，730例，位居男性好发肿瘤中第一位，PCa的死亡人数估计为32，050，在男性肿瘤死亡率中位居第二。年龄是PCa的一个重要风险因素，年龄45岁以下的基本很少发病，随年龄的增长而增加。美国癌症协会统计，40岁以下的男性PCa发病率为1/8499,40-59岁男性中为1/38，60-69岁男性中为1/15，70岁以上男性中则为1/8。随着我们国家人口老龄化，PCa的发病率在我国正逐年上升，上海标化发病率从1973 1975年的1.8/10万上升至1997 1999年的
5.5/10万，贵州省南部地区部分县市PCa的发病率已从1994 1998年的1.72/10万上升到2004 2008年的4.28/10万，成为威胁我国男性健康的公共问题。目前进行PCa遗传病因研究，多采用大规模全基因组关联研究和小样本多人群中的验证，并且GWAS鉴定的多个PCa易感SNPs已在多个不同人群中被复制确定，证明了 SNPs作为基因组标志的关联分析方法在PCa遗传研究中的有效性。SNPs是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需> I %，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1 %为同型碱基之间的转换:如G/A或T/C，29.1 %为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。SNPs包含了已知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。由于生存的选择压力 导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNPs以其密度高(平均每Ikb就有I个)、代表性强(位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNPs在人群中为双等位基因标记，可简单以“+/—或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。GPRC6A (G 蛋白偶联受体 C 家族 6 组 A 亚型)(G protein-coupled receptor,familyC, group 6, member A), GPRC6A 基因是 Wellendorph P 等在 2004 年发现提出的，编码G蛋白偶联受体C家族6组A成员，G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是一类有7次跨膜区域，是人类基因组上由约近千个基因编码的大的受体家族，在许多生理病理进程包括发育、造血、血管生成、炎症、精神障碍、代谢疾病及病毒感染等中起重要作用。研究表明许多GPCRs和他们的配体参与肿瘤发生发展，如内皮缩血管肽类通过与GPCRs相互作用介导组织分化、发育和细胞增殖，通过增强细胞增殖抑制凋亡和调节基质成分在PCa和其他肿瘤中起重要作用。许多趋化因子受体如CXCR4、CXCR2、CCR7等在许多肿瘤表达上调，在肿瘤生长、侵袭和转移中起重要作用。许多被称为内皮分化基因家族的GPCRs是溶血磷脂酸或鞘氨醇-1-磷酸盐的受体，调节细胞的增殖、迁移和生存。如肺腺癌或肺腺癌3期时许多化学因子受体、神经肽受体、激素受体等:PAR2 (GPRll)、Edg2(GPR2)等GPCRs表达上调；乳腺癌或乳腺癌3期时PAR2和CXCR-4表达增加；PCa时CXCR_3、GPR68等在PCa组织表达高于正常前列腺组织，其他肿瘤胃癌、转移黑色素瘤等的发展中也有多种GPCRs参与。据估计，市场上接近30 %的药物靶标是GPCRs或者与其相关的信号通路，其研发依据部分为许多疾病与GPCRs的变异和多态性关联，因此研究GPCRs与肿瘤包括GPCRs的多态性与肿瘤的关联可以为以干扰GPCRs或其介导的信号通路为基础的药物研发提供理论依据。GPRC6A基因的功能已有研究，GPRC6A广泛表达在脑和外周组织，在睾丸、肾脏、骨骼肌中高表达。GPRC6A敲除的小鼠表现为代谢综合征:成骨细胞缺陷介导的骨钙化，肾脏处理钙磷异常，脂肪肝，糖耐受和类固醇合成紊乱等性状。最近的体内体外GPRC6A功能研究也表明其是一个调节PCa生长和肿瘤发展相关的靶分子。再者，GPRC6A是骨-胰腺分泌环中调节骨钙素应答的基因，骨-胰腺分泌环调节胰岛素信号通路，而胰岛素受体和胰岛素样生长因子也在许多研究中被证明与PCa相关。从GPRC6A可以调节激素和影响胰岛素信号通路这两方面支持基因上位点的变异可能会影响PCa的易感性。Rfx6(调节因子 X6)-属于转录因子 RFX (regulatory factor X_box binding)
家族。位于chrl5 (54166958-54222377)，19个外显子，编码蛋白长度1281，一个亚型，有B、C和D三个结构域，主要在胰腺表达，与其他同家族RFX比表达水平较低，在胰腺的发展和功能的调节中是关键的转录调节物。RFX6与RFX2和RFX3直接作用，而后二者在胰腺表达并发挥作用。在胰腺中，Rfx6位于促内分泌因子Neurog3下游,其他多种胰岛转录因子的上游，在胰岛细胞分化中发挥作用。这两种基因 的突变表现出相似而不同的表型。人类RFX6突变，会引起难治性腹泻和糖尿病，肠闭锁和胆道畸形，新生儿糖尿病。对Rfx6的充分理解有助于阐明胰岛及β细胞的形成、糖尿病的发病过程。DNA-binding蛋白RFX6在新生血色沉着病的病理中发挥重要作用，血色沉着病HFE基因与前列腺癌的相关性突出了血色沉着病的病理学与前列腺癌的交互作用。GPRC6A和RFX6基因附近位点，缩窄到基因RFX6区域的SNPs与前列腺癌显著相关，比最初的GWAS中与前列腺癌的相关位点GPRC6A/RFX6，RFX6基因变异可能是更优先的敏感位点。2010年，Takata R等鉴定了位于RFX6基因上的rs339331和PCa风险关联，此后，此位点在欧洲人群和中国人群中复制验证。rs339319在染色体上位置为117，295，427，位于RFX6和GPRC6A基因间区，用haploview软件分析GPRC6A和RFX6基因上包括rs339331在内的位点间的LD程度，rs339319 与位于 GPRC6A 基因的 rs2274911，rs600928 强关联(r2 分别为 0.959，0.940)。此位点所在基因组位置可能会对附近基因区进行调节，进而影响蛋白质的功能。经查询检索，截至目前，RFX6和GPRC6A基因间区的rs339319与PCa风险相关性还未见有报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种检测前列腺癌易感性基因的方法。
本发明的第二个目的是提供一种检测前列腺癌易感性基因的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，为序列表SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列为RFX6基因和GPRC6A基因区间的包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段。rs339319位点即是第+501位碱基Y(Y = C或T)。图1为RFX6和GPRC6A基因间区结构及rs339319多态性变异位点的示意图，rs339319位点标在RFX6和GPRC6A基因间区图中相应位置。本发明研究发现，所述单苷酸多态性位点rs339319的基因型为AG或GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为AA时，前列腺癌易感性较低。一组检测前列腺癌易感性的等位基因特异性的引物，能特异性扩增得到RFX6基因和GPRC6A基因区间的包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段。所述引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID N0.2和序列表SEQ ID N0.3所示。一种前列腺癌易感性基因的检测方法，包括如下步骤:(I)抽提样品的基因组DNA，扩增RFX6基因和GPRC6A基因区间的包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段；(2)检测步骤(I)产物中单苷酸多态性位点rs339319的基因型，基因型为AG或GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为AA时，前列腺癌易感性较低。所述扩增RFX6基因和GPRC6A基因区间的包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段，使用的一组引 物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.3所示。本发明提供了一种检测前列腺癌易感基因的试剂盒，其中含有本发明特异性扩增RFX6和GPRC6A基因间区rs339319位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下:一种预测PCa易感性的试剂盒，供10人份检测应用，由以下试剂组成:10 μ L 10XPCR 缓冲液(购自 Pharmacia)，2 μ L IOmM dNTP 混合液(购自 Pharmacia),2 μ L Taq DNA 聚合酶，2unit/ μ L (购自 Takara),IyL Fl引物，为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ；IyL Rl引物，为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ；8 μ L lOXLC-green PLUS饱和荧光染料；(购自美国Idaho公司)2μ L寡核苷酸内参引物各0.5 μ L，浓度为IOpmol/μ L，其中低温内参引物F为SEQID N0.4所示的核苷酸序列，低温内参引物R为SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高温内参引物F为SEQ ID N0.6所示的序列，高温内参引物R为SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列，高低温内参序列；64 μ L 纯水。使用方法:I) PCR扩增:通过PCR扩增RFX6和GPRC6A基因间区的部分片段，制备混合液:10XPCR 反应缓冲液 I μ L, IOmmoI/L dNTP 0.2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L, IOpmoI/L 上游引物0.lyL，10pmol/L下游引物0.1 μ L，IOXLC Green PLUS饱和荧光染料0.8 μ L，寡核苷酸内参0.2 μ L(高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05 μ L)(序列见表I)，基因组DNAl μ L，加去离子水至10 μ L。PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，总共45个循环，72°C总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理:95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s，24°C 4min。PCR时于每一体系中加入20 μ I的石蜡油，以防止液体挥发。2)基因型判定:将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light scanner TMHR-196上进行HRM分析，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，根据熔解曲线的差异判定基因型。序列表SEQ ID N0.1所示核苷酸序列及其包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段在制备诊断或治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途。RFX6基因和GPRC6A基因区间单苷酸多态性位点rs339319在制备诊断或治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途。本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如:体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含RFX6和GPRC6A基因间区突变位点rs339319的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含RFX6和GPRC6A基因间区突变点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据RFX6和GPRC6A基因间区rs339319突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定rs339319基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。本发明的优点是:本发明首次阐明了 RFX6和GPRC6A基因间区rs339319多态性位点与PCa的相关性，提供了一 种预测PCa易感性的方法和试剂盒，该方法可用于PCa的预防、辅助诊断，还可以用于新药研发。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步叙述，以便公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为RFX6和GPRC6A基因间区结构及多态性变异位点的示意2为RFX6和GPRC6A基因间区rs339319位点经HRM分型溶解曲线3为RFX6和GPRC6A基因间区rs339319位点的测序图
具体实施例方式用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下:10XPCR 缓冲液:10mM Tris-HCl (pH = 8.3)，500mM 氯化钾(KCl)，IOmM 氯化镁(MgCl2)70.01% (W/V)白明胶dNTP:脱氧核苷三磷酸
EDTA:乙二胺四乙酸二钠TE:10mM Tris-HCl (pH = 7.5)，ImM EDTA (pH = 8.0)实施例1:血液样本收集和基因组DNA的提取1.PCa患者均经组织病理学诊断，共选取来自北京和天津地区无血缘关系的PCa患者273例(年龄:46-93岁，平均72.3岁)，同地区的年龄匹配的对照606例(年龄:58-94岁，平均70.4岁)，均为男性，无PCa家族史、DRE阴性并且PSA < 4ng/mL。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合世界医学会赫尔辛基宣言:人体医学研究的伦理原则。2.根据下列方法，制备人基因组DNA。①首先在已标号的1.5mL EP管中加1000 μ L红细胞裂解液，后加入400 μ L EDTA抗凝血(抗凝血加入前颠倒混匀3-5次)，颠倒混匀，室温静置10分钟德13000rpm离心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480 μ I核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20 μ L蛋白酶Κ(用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K)，颠倒混匀，65°C孵箱10分钟，(期间不时上下混匀，确保无凝块)；④取出后降至室温，加300yL蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；⑤将上清液移至新EP管中，加入670 μ L预冷的异丙醇，充分颠倒混匀(10次以上)，可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；⑥弃上清液并确保沉淀留在EP中，加入670 μ L 70%乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；⑦弃上清，使管内乙醇挥发干净；⑧加入TE溶解液(400 μ L)，充分溶解，然后对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/l.! L，放置于4°C备用，剩余基因组DNA置_20°C冰箱保存。实施例2: SNP的识别鉴定本发明采用PCR-高分辨率溶解曲线(HRM)分析法和PCR测序技术同时对RFX6和GPRC6A基因间区的rs339319位点(其等位位点为A/G)的基因型进行检测。1.PCR-HRM引物 的确定从Genebank中查取rs339319附近的DNA碱基序列(SEQ ID N0.1)，引物设计在Oligo 6.0和primer5.0软件下完成。目的片段定位在RFX6和GPRC6A基因间区，全长69bp，确定了正义链Fl (+457bp—+474bp)与反义链Rl (+508bp—+525bp)，特异性引物序列如下:Fl:5，-CAAACAGAGTGAGGAATGA-3’ (SEQ ID N0.2)Rl:5，-ATTAACTCAAGGCTGTGG-3，(SEQ ID N0.3) 2.PCR-HRM反应体系及条件通过PCR扩增RFX6和GPRC6A基因间区的rs339319位点所在片段，PCR反应体系为:10XPCR 反应缓冲液 I μ L，10mmol/L dNTP 0.2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，10pmol/L 上游引物0.lyL，10pmol/L下游引物0.1yL, 10XLC Green PLUS饱和荧光染料0.8 μ L，寡核苷酸内参0.2 μ L(高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05 μ L)，3’端C3封闭，阻止延伸，见表I),基因组DNA I μ L，加去离子水至10 μ L。PCR时于每一体系中加入20 μ I的石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，总共45个循环，72°C总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理:95°C 30s, 25°C 2min,94°C 30s,24°C 4min。表I高、低温寡核苷酸内参引物序列、退火温度及产物片段长度
权利要求
1.一种检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于:为序列表SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于:所述核苷酸序列为RFX6基因和GPRC6A基因区间的包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段。
3.根据权利要求2所述的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于:所述单苷酸多态性位点rs339319的基因型为AG或GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为AA时，前列腺癌易感性较低。
4.一组检测前列腺癌易感性的引物，其特征在于:能扩增得到RFX6基因和GPRC6A基因区间的包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段。
5.根据权利要求4所述的一组检测前列腺癌易感性的引物，其特征在于:所述引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID N0.2和序列表SEQ ID N0.3所示。
6.一种前列腺癌易感性基因的检测方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)抽提样品的基因组DN A，扩增RFX6基因和GPRC6A基因区间的包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段； (2)检测步骤(I)产物中单苷酸多态性位点rs339319的基因型，基因型为AG或GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为AA时，前列腺癌易感性较低。
7.根据权利要求6所述的前列腺癌易感性基因的检测方法，其特征在于:所述扩增RFX6基因和GPRC6A基因区间的包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段，使用的一组引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
8.—种检测前列腺癌易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成:10 μ L 10 X PCR 缓冲液； 2 μ L IOmM dNTP 混合液；2 μ L Taq DNA 聚合酶，2unit/ μ L ； IuL Fl引物，为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ； IuL Rl引物，为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ； 8 μ L lOXLC-green PLUS 饱和荧光染料； 2 μ L寡核苷酸内参引物各0.5 μ L，浓度为IOpmol/μ L，其中低温内参引物F为SEQIDN0.4所示的核苷酸序列，低温内参引物R为SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高温内参引物F为SEQ ID N0.6所示的序列，高温内参引物R为SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列； 64 μ L纯水。
9.序列表SEQID N0.1所示核苷酸序列及其包含单苷酸多态性位点rs339319的核苷酸片段在制备诊断或治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途。
10.RFX6基因和GPRC6A基因区间单苷酸多态性位点rs339319在制备诊断或治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种预测前列腺癌易感性的方法和试剂，属于生物技术领域。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的RFX6和GPRC6A基因区间的rs339319位点的基因型，预测受试者对前列腺癌的易感性；RFX6和GPRC6A基因区间的rs339319的基因型为AG或GG时，受试者的易感性最高；rs339319的基因型为AA时，受试者的易感性较低。本发明的优点是首次阐述了rs339319基因多态性位点与前列腺癌的相关性，提供了一种预测前列腺癌易感性的方法，该方法可用于前列腺癌的早期预防诊断、辅助诊断，还可以用于新药研发。
文档编号A61P35/00GK103205486SQ20121059523
公开日2013年7月17日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者杨泽, 赵承孝, 刘铭, 王建业, 史晓红, 魏东, 朱小泉, 杨帆, 张耀光, 梁思颖, 王飞, 唐雷, 孙亮 申请人:卫生部北京医院