胎盘萃取物及胎盘萃取物的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种胎盘萃取物及安全有效地制备胎盘萃取物的方法，本发明胎盘萃取物制备方法包括选自下列步骤所组成的群中的一个以上步骤：使用界面活性剂及溶剂将病毒灭活的步骤；照射紫外线将病毒灭活的步骤；以及使用纳米过滤器将病毒清除的步骤；本发明还提供如此得到的胎盘萃取物的哺乳类更年期障碍症状预防或治疗用途。
【专利说明】胎盘萃取物及胎盘萃取物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胎盘萃取物及安全有效地制备胎盘萃取物的方法，更具体地说，本发明胎盘萃取物的制备方法包括选自下列步骤所组成的群中的ー个以上步骤:使用界面活性剂及溶剂将病毒灭活的步骤；照射紫外线将病毒灭活的步骤；以及使用纳米过滤器将病毒清除的步骤所组成的群中的ー个以上步骤；本发明还涉及如此得到的胎盘萃取物的哺乳类更年期障碍症状预防或治疗用途。
【背景技术】
[0002]胎盘(placenta)是怀孕的哺乳类动物的子宫上长出来的器官。胎盘在分娩时从子宮排出，将胎盘排出来则称为后分娩。胎盘被认为含有必需氨基酸、褪黑激素、RNA及DNA之类的核酸成分，作为抗氧化酶的SOD (super oxide dismutase)、透明质酸(hyaluronicacid)、抗氧化剂、细胞因子以及各种生长因子(growth factor)。
[0003]现有的胎盘萃取物制备方法包括:利用盐酸之类的强酸或强碱把胎盘水解后获取其产物的方法、利用酶把胎盘水解的方法。但，该现有方法的水解条件以及长时间进行高温处理的过程中会让胎盘所含有的各种生理活性物质变性或破坏。
[0004]另ー方面，不利用酸、碱或酶水解与高温处理方法而采取温和(mild)方法萃取胎盘时虽然可以在各种生理活性物质不变性、不破坏的情形下萃取，但由于随着胎盘而来的潜在病毒可能会引起问题而必须进行将其灭活或清除的エ序，然而，目前为止除了热处理以外并没有任何灭活或清除病毒的胎盘萃取物制备方法。
[0005]解决的技术课题
[0006]本发明的基本目的是提供ー种胎盘萃取物的制备方法，其包括选自下列步骤所组成的群中的ー个以上步骤:使 用界面活性剤及溶剂将病毒灭活的步骤；照射紫外线将病毒灭活的步骤；以及使用纳米过滤器将病毒清除的步骤。
[0007]本发明的另ー个目的是提供ー种安全有效的胎盘萃取物的制备方法，其包括下列步骤:(i)在水介质里粉碎胎盘组织后获取胎盘溶液的步骤；(ii)把上述胎盘溶液分离成液相部分与固相部分的步骤；(iii)在上述步骤(ii)所获取的液相部分添加界面活性剤及溶剂而将病毒灭活的步骤；(iv)从上述步骤(iii)所获取的混合溶液中清除上述界面活性剂及上述溶剂的步骤；(V)针对上述步骤(iv)所获取的溶液照射紫外线将病毒灭活的步骤 '及(vi)使用纳米过滤器及除菌过滤器对上述步骤(V)中照射了紫外线的溶液进行过滤而清除病毒与细菌的步骤。
[0008]本发明的再ー个目的是提供ー种上述方法制备的胎盘萃取物，还提供一种包括由上述方法制备的胎盘萃取物及药学上允许的载体的哺乳类更年期障碍症状预防或治疗用药物组合物。
[0009]解决课题的技术方案
[0010]本发明的基本目的可以由下列胎盘萃取物制备方法实现，该方法包括下列步骤所所组成的群中的ー个以上步骤:使用界面活性剤及溶剂将病毒灭活的步骤；照射紫外线将病毒灭活的步骤；以及使用纳米过滤器将病毒清除的步骤。
[0011]上述方法不使用现有技术的热处理工序也能将胎盘所含病毒加以灭活或清除。本发明方法中的上述胎盘组织可以来自人、猪、马或羊之类的哺乳动物。
[0012] 较佳地，本发明方法所使用的上述界面活性剤与溶剂能溶解细胞膜却不会钝化诸如蛋白质等结合于细胞膜的成分的活性。而且，上述界面活性剤不能让蛋白质变性。上述界面活性剂可以使用非离子系及两性界面活性剤。
[0013]更具体地说，上述界面活性剂是Triton-XlOO(聚乙二醇p-(l，I, 3，3_四甲基丁基)-苯基醚)、Triton-X114(聚乙二醇p-(l，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚)、Tween20 (PEG (20)山梨醇酐单月桂酸酷)、Tween80 (PEG (20)山梨醇酐单油酸)、NonidetP-40(聚乙二醇辛基苯基醚)、Brij-35(聚氧乙烯(23)十二醇)、Bri j_58 (聚氧乙烯(20)鲸腊基)、CHAPS (3-[ (3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐)或CHAPSO (3-[ (3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2_羟基-1-丙磺酸内盐)或它们的组合。较佳地，以上述液相部分的体积为基准添加0.lvol%到2vol%左右的上述界面活性剤。而且上述溶剂以TNBP(tr1-n-butylphosphate)较佳。例如，上述界面活性剂为Triton-XlOO、上述溶剂为TNBP，并且其含量各为 0.3% (v/v)及 l%(v/v)。
[0014]在本发明的方法中，上述照射紫外线是用来灭活可能存在于胎盘萃取物中的病毒。凭借紫外线照射将人来源病毒及模型病毒HIV、HAV、BHV、BVDV、PPV灭活而得以进ー步减少生物物质污染。较佳地，上述紫外线的能量为1，000J/m2到3，000J/m2。
[0015]在本发明的方法中，使用上述纳米过滤器的纳米过滤エ序可针对具有污染可能性的病毒及模型病毒HIV、HAV、BHV、BVDV、PPV的清除及灭活エ序进行效率性验证。上述纳米过滤器的过滤精度以15nm到30nm较佳。
[0016]本发明的另ー个目的可以由前述本发明胎盘萃取物制备方法的一较佳实施形态实现，其包括下列步骤:(i)在水介质里粉碎胎盘组织后获取胎盘溶液的步骤；(ii)把上述胎盘溶液分离成液相部分与固相部分的步骤；(iii)在上述步骤(ii)所获取的液相部分添加界面活性剤及溶剂而将病毒灭活的步骤；(iv)从上述步骤(iii)所获取的混合溶液中清除上述界面活性剤及上述溶剂的步骤；(V)针对上述步骤(iv)所获取的溶液照射紫外线将病毒灭活的步骤；及(vi)使用纳米过滤器及除菌过滤器对上述步骤(V)中照射了紫外线的溶液进行过滤而清除病毒与细菌的步骤。
[0017]在本发明方法中，上述胎盘组织可以来自人、猪、马或羊之类的哺乳动物。而且，本发明中的水介质表示水或以水为溶媒的介质。上述水介质以水或PBS (磷酸缓冲液)较佳。
[0018]上述粉碎可以使用搅拌机(blender)或均化器实现。上述粉碎把胎盘组织制成小粒子的同时还能对胎盘组织中的细胞进行物理溶解。上述粉碎可以把胎盘组织制成诸如3mm以下的尺寸。该粉碎把胎盘组织制成小粒子而得以增加诸如蛋白质等胎盘组织中的有用成分被溶解到介质中的表面积。上述粉碎的溶液可以是均相溶液(homogenoussolution)。上述粉碎在2°C到8°C下实行较佳。
[0019]而且，也可以把上述胎盘组织细切后在水介质里粉碎。胎盘组织的细切可以使用切碎机(mincer)或细切机(chopper)实行。该细切可以在2°C到8°C下实行。
[0020]较佳地，使用凭借清洗而清除了血液的上述胎盘组织。从胎盘组织清除血液时可以使用红细胞裂解液(RBC lysis buffer)等实现。上述红细胞裂解液(RBC lysis buffer)可以是含有NH4Cl、KHCO3及EDTA的水溶液，例如可以是1，OOOml水中含有8.3g的NH4C1、
1.0g 的 KHCO3 及 5%EDTA1.8ml 的水溶液。
[0021]在本发明的方法中，可以在上述(i)步骤后选择性地实行清除上述液相部分所含固体的预过滤步骤。上述预过滤可以通过离心分离实现。
[0022]上述液相部分是溶解了溶解性成分的水介质的部分，上述固相部分是液相部分以外的部分。上述固相部分可以包括细胞碎片(cell debris)与细胞器官等。上述离心分离可以在诸如10，OOOrpm到15，OOOrpm下实行。上述液相部分可以是从离心分离的试料的颗粒(pellet)中分离出来的。选择分离后获取的液相部分而排除固相部分。上述预过滤步骤可以使用0.4 y m到0.6 y m大小的过滤器实行。可以凭借该预过滤清除上述液相部分可能含有的杂质。
[0023]较佳地，本发明方法所使用的上述界面活性剤与溶剂能溶解细胞膜却不会钝化诸如蛋白质之类结合于细胞膜的成分的活性。而且，上述界面活性剤不能让蛋白质变性。上述界面活性剂可以使用非离子系及两性界面活性剤。[0024]更具体地说，上述界面活性剂是Triton-XlOO(聚乙二醇p-(l，I, 3，3_四甲基丁基)-苯基醚)、Triton-X114(聚乙二醇p-(l，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚)、Tween20 (PEG (20)山梨醇酐单月桂酸酷)、Tween80 (PEG (20)山梨醇酐单油酸)、Nonidet卩-40(聚乙二醇辛基苯基醚)、81^_-35(聚氧乙烯(23)十二醇)、Brij-58(聚氧乙烯(20)鲸蜡基)、CHAPS (3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐)或CHAPSO (3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2_羟基-1-丙磺酸内盐)或它们的组合。以上述液相部分的体积为基准添加0.lvol%到2vol%左右上述界面活性剤。而且上述溶剂以TNBP(tr1-n-butylphosphate)较佳。例如，上述界面活性剂为Triton-XlOO、上述溶剂为TNBP，并且其含量各为 0.3% (v/v)及 l%(v/v)。
[0025]在本发明方法的步骤(iv)中，可以为了清除上述液相部分所含界面活性剤与溶剂而使用结合于特定成分的树脂予以清除，还能获取清除红细胞(RBC)并提高了纯度的萃取液。较佳地，上述步骤(iv)可以使用SDR树脂(solvent/detergent removal resin)实行。
[0026]在本发明方法的步骤(V)中，照射紫外线可以将上述步骤(iv)所获溶液中可能含有的病毒灭活。凭借紫外线照射将人来源病毒及模型病毒HIV、HAV、BHV、BVDV、PPV灭活而得以进ー步减少生物物质污染。较佳地，上述紫外线的能量以1，OOOJ/m2到3，OOOJ/m2较佳。
[0027]在本发明方法的(Vi)步骤中，为了针对具有污染可能性的病毒及模型病毒HIV、HAV、BHV、BVDV、PPV的清除及灭活エ序进行效率性验证而实行纳米过滤(nano-filtration)エ序。可以凭借超细过滤器(纳米过滤器)从潜在的病毒感染中确保胎盘萃取物的安全性。而且，可以凭借超细过滤器清除所精制的胎盘萃取物中可能含有的菌。上述纳米过滤器的过滤精度以15nm到30nm较佳。上述除菌过滤器的过滤精度则以0.2 y m到0.3iim大小较佳。
[0028]本发明的再ー个目的可以凭借提供由上述方法制备的胎盘萃取物，包含由上述方法制备的胎盘萃取物及药学上允许的载体的哺乳类更年期障碍症状预防或治疗用药物组合物而实现。上述胎盘萃取物的最终蛋白质浓度以2pg/ml到20pg/ml较佳。[0029]上述“药学上允许的载体”可以选自稀释剂、抛光剂、结合剂、崩解剂、甜味剂、稳定剂及防腐剂所组成的群。上述药物组合物还可以包括添加剤。上述添加剂可以包括香料、维生素及抗氧化剂。上述载体只要是药剂学上允许的即可，例如，稀释剂可以是乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露醇，抛光剂可以是硬脂酸镁或滑石(talc)，结合剂可以是聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基纤维素。而且，崩解剂可以是羧甲基纤维素钙、羧甲基淀粉钠、泼拉克林钾(polacrillin potassium)或交聚维酮(crospovidone),甜味剂可以是白糖、果糖、山梨醇或阿斯巴甜(Aspartame)，稳定剂可以是羧甲基纤维素钠、(6-环糊精、白蜡或黄原胶，防腐剂可以是羟甲基苯甲酸、羟丙基苯甲酸或山梨酸钾。
[0030]上述药物组合物可以制成本【技术领域】所公知的一般药剂学上的剂型，上述药物组合物可以制成ロ服剂、针剂、坐剂、透皮制剂及透皮制剂的剂型后给药。
[0031]例如，上述剂型可以是液剂、悬浮剂、散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂，或提取液之类的ロ服用剂型。
[0032]为了获得更年期障碍的改善、预防或治疗效果，上述药物组合物可以作为有效成分而以成人为准的姆日总给药量为上述萃取物0.lg/kg到100g/kg、0.lg/kg到50g/kg或
0.lg/kg到30g/kg地给药。上述给药量可以根据需要治疗或预防的更年期障碍的改善类型、疾病的进行程度、给药路径、性別、年龄、体重等因素适当地增减。上述更年期障碍的改善可以是针对更年期前的障碍的改善。上述哺乳动物可以是人。
[0033]有益效果
[0034]本发明胎盘萃取物制备方法可以安全有效地制备包含胎盘组织中的生理活性成分的胎盘萃取物。可以不钝化胎盘组织中的天然活性成分地萃取，还能完全排除潜在的病
毒污染。
[0035]本发明胎盘萃取物可以包含胎盘组织中的天然生理活性成分。
[0036]本发明的药物组合物可以预防或治疗哺乳动物的更年期症状。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图1是本发明的实施例3中给药本发明胎盘萃取物时裸鼠的子宫及阴道的重量变化。
[0038]图2是本发明的实施例3中给药本发明胎盘萃取物时裸鼠的总胆固醇及IP的变化。
[0039]图3是本发明的实施例3中给药本发明胎盘萃取物时裸鼠的子宮及皮肤的厚度变化。
[0040]图4是本发明的实施例3中给药本发明胎盘萃取物时裸鼠的阴道表皮的变化。【具体实施方式】
[0041]下面结合下列实施例具体说明本发明。但，下列实施例只是以本发明的具体实施形态进行说明而已，不能因此将本发明的权利范围限定于该说明中所记载的内容或予以限制性地阐释。
[0042]实施例1.从人胎盘组织制备胎盘萃取物
[0043]在2°C到8°C下把冷冻的人胎盘组织予以解冻。利用50L的注射用水清洗解冻后的胎盘组织5kg。凭借该清洗把暴露于胎盘组织外部的血液清除了一部分。并且从胎盘组织清除了脐带与羊膜。接着，使用混合器细切胎盘组织。细切结果，得到了直径为3_以下的粒子所构成的胎盘组织。
[0044]在2°C到8°C下于其体积相当于上述经过细切的胎盘组织体积的3倍的PBS缓冲液(水 IL 中 4g NaCU0.1g KCl、0.575g Na2HPO4 及 0.1gKH2PO4)中利用均质器(IKA 公司)把经过细切及清洗的胎盘组织加以粉碎后得到粉碎的胎盘组织溶液。如此得到的溶液实质上是均相溶液。
[0045]接着，使用离心分离器(Hanil科学产业)在12，000rpm、4°C下对上述粉碎的溶液进行离心分离20分钟。离心分离后，回收上清液并且在2°C到8°C下保管，清除颗粒。
[0046]使用0.45 ii m过滤器(Sartorius公司)对上述上清液约12L进行预过滤而得到精制液。在预过滤后的蛋白质混合水让浓度成为lvol%Triton X-100及0.3vol%TNBP地添加各界面活性剤与溶剤，然后在2°C到8°C下静置30分钟。之后，为了清除界面活性剤与溶剂而使用SDR树脂(Solvent-Detergent Removal Resin)实行S/D清除エ序,还实行了清除RBC并提高纯度的エ序。
[0047]使用UVivatech公司的UVC设备以3000J/m2的能量让紫外线(UV-C irradiation)通过如此得到的混合水，对于通过的溶液，为了针对具有污染可能性的病毒的清除及灭活エ序进行效率性验证而利用纳米过滤器(Pali公司)进行过滤而精制。
[0048]在上述过滤エ序后，使用0.22 Pm过滤器(Millipore公司)以清除菌为目的进行精制而得到最終胎盘萃取物。
[0049]实施例2.动物实验结果
[0050](I)胎盘萃取物的`效能分析
[0051]本实施例摘除(Ovariectomy;0VX)母裸鼠(Mouse/CanN.Cg-Foxnl nu/Crl jOri)的卵巢诱发更年期后，反复地将胎盘来源试验物质予以皮下给药，为了评估试验物质的更年期改善效果而实行了内脏重量測量、血清生化分析及组织病理分析。
[0052](2)给药胎盘萃取物
[0053]考虑到Mouse/CanN.Cg-FoxnInu/CrI jOri裸鼠免疫性降低的特性,把饲育环境制成无菌状态并经过检疫及纯化后个别地測量体重，选出纯化期间中体重増加及一般症状没有异常的健康动物后实行了组分离。各组的构成如下列表1所示。
[0054]表1
[0055]
【权利要求】
1.ー种胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 其包括选自下列步骤所组成的群中的ー个以上步骤:使用界面活性剤及溶剂将病毒灭活的步骤；照射紫外线将病毒灭活的步骤；以及使用纳米过滤器将病毒清除的步骤。
2.根据权利要求1所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 上述界面活性剂选自Triton-XlOO (聚乙二醇P-(1，1,3, 3-四甲基丁基)-苯基醚)、Triton-Xl 14 (聚乙二醇 p-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚)、Tween20 (PEG (20)山梨醇酐单月桂酸酷)、Tween80 (PEG(20)山梨醇酐单油酸)、Nonidet P-40 (聚乙二醇辛基苯基醚)、Brij-35(聚氧乙烯(23)十二醇)、Bri j_58 (聚氧乙烯(20)鲸蜡基)、CHAPS (3-[ (3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐)及CHAPSO (3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐)所组成的群中的至少ー个。
3.根据权利要求1所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 上述溶剂为 TNBP(tr1-N-butyl phosphate)。
4.根据权利要求1所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 上述紫外线的能量为1，000J/m2到3，000J/m2。
5.根据权利要求1所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 上述纳米过滤器的过滤精度为15nm到30nm大小。
6.ー种胎盘萃取物的制备方法，其特征在于，包括下列步骤: (i)在水介质里粉碎胎盘`组织后获取胎盘溶液的步骤；(ii)把上述胎盘溶液分离成液相部分与固相部分的步骤；(iii)在上述步骤(ii)所获取的液相部分添加界面活性剤及溶剂而将病毒灭活的步骤；(iv)从上述步骤(iii)所获取的混合溶液中清除上述界面活性剤及上述溶剂的步骤；(V)针对上述步骤(iv)所获取的溶液照射紫外线将病毒灭活的步骤；及(vi)使用纳米过滤器及除菌过滤器对上述步骤(V)中照射了紫外线的溶液进行过滤而清除病毒与细菌的步骤。
7.根据权利要求6所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 上述界面活性剂选自Triton-XlOO (聚乙二醇P-(1，1,3, 3-四甲基丁基)-苯基醚)、Triton-Xl 14 (聚乙二醇 p-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚)、Tween20 (PEG (20)山梨醇酐单月桂酸酷)、Tween80 (PEG(20)山梨醇酐单油酸)、Nonidet P-40 (聚乙二醇辛基苯基醚)、Brij-35(聚氧乙烯(23)十二醇)、Bri j_58 (聚氧乙烯(20)鲸蜡基)、CHAPS (3-[ (3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐)及CHAPSO (3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐)所组成的群中的至少ー个。
8.根据权利要求6所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 上述溶剂为 TNBP(tr1-N-butyl phosphate)。
9.根据权利要求6所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 上述步骤(iv)使用 SDR 树月旨(solvent/detergent removal resin)实现。
10.根据权利要求6所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 上述紫外线的能量为1，000J/m2到3，000J/m2。
11.根据权利要求6所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干， 上述纳米过滤器的过滤精度为15nm到30nm大小。
12.根据权利要求6所述的胎盘萃取物的制备方法，其特征在干，上述除菌过滤器的过滤精度为0.2 i! m到0.3 i! m大小。
13.ー种胎盘萃取物，其特征在干， 利用权利要求1到权利要求12之任何一项所述的胎盘萃取物的制备方法制成。
14.ー种哺乳类更年期障碍症状的预防或治疗用药物组合物，其特征在干， 包含利用权利要求1到权利要求12之任何一项所述的胎盘萃取物的制备方法制成的胎盘萃取物及药学上允许的载体。
15.根据 权利要求14所述的哺乳类更年期障碍症状的预防或治疗用药物组合物，其特征在干， 包含2pg/ml到20pg/ml的上述胎盘萃取物。
【文档编号】A61K35/50GK103533944SQ201280010127
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年2月28日 优先权日:2011年2月28日
【发明者】韩圭范, 俞龙善, 林美亨 申请人:查拜和迪奥思特有限责任公司