Wnt组合物及其使用方法

Wnt组合物及其使用方法
【专利摘要】提供了Wnt组合物和它们的使用方法。本发明的组合物包含具有期望的生物活性的wnt多肽片段，此类片段在本文中被称为“小型wnt”。这些组合物和方法在下述方面特别有用：确定与Wnt受体的结合；抑制表达Wnt受体的细胞内的Wnt信号转导；将功能部分递送至表达Wnt受体的细胞；和用作制备Wnt-特异性抗体的免疫原。
【专利说明】WNT组合物及其使用方法
[0001]发明背景
[0002]Wnt蛋白构成了高度保守的分泌信号转导分子家族，其调控胚胎发生期间的细胞与细胞相互作用。fct基因和Wnt信号转导还与癌症相关。Wnt糖蛋白被认为在多种原初细胞类型中作为有活性的旁分泌或自分泌信号起作用。
[0003]Wnt生长因子家族包括小鼠和人中鉴定的多于19种基因。Wnt-I原癌基因（int_l)最初从乳腺肿瘤中鉴定到，该乳腺瘤由小鼠乳瘤病毒（MMTV)诱发，由于病毒DNA序列的插入引起（Nusse and Varmus (1982) Cell31:99-109)。Wnt蛋白的表达存在差异,但经常与发育过程相关，例如在胚胎和胎儿组织中。fct可能在局部细胞信号转导中起作用。生化研究表明，可以发现许多分泌fct蛋白与细胞表面或细胞外基质相关，而非在媒介中自由扩散。
[0004]对Wnt活动机制的深入了解来自多个系统：果蝇（Drosophila)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)遗传学；非洲爪蟾（Xenopus)胚胎的细胞培养和异位基因表达生物化学。已经突变了小鼠的许多fct基因，导致非常特定的发育缺陷。根据当前所了解，Wnt蛋白在细胞表面上结合到卷曲蛋白（Frizzled)家族受体、ROR家族受体和LRP5受体、LRP6受体和FRLl受体上。在典型Wnt/β连环蛋白信号转导通路中，Wnt结合到卷曲蛋白受体上导致β连环蛋白的细胞核定位，其接着与TCF络合以激活Wnt靶基因的转录。
[0005]Wnt基因的突变研究表明了 Wnt在生长调控和组织模式形成中的作用。在果蝇中，无翅基因（wg)编码Wnt基因，且wg突变改变了胚胎外胚层、神经发生和成虫盘增生的模式。在秀丽隐杆线虫中，lin-44编码Wnt，其为不对称细胞分化所必需。小鼠内的敲除突变显示fct为脑发育所必需，以及肾脏、尾芽和肢芽的胚胎原基增生所必需。乳腺内Wnt的过度表达可能导致乳腺增生症 和过早的齿槽发育。因此，fct信号转导涉及众多动物发育事件，包括干细胞增殖和神经嵴的特化。因此fct蛋白为用于扩展特定的细胞类型及治疗体内病症的潜在重要药剂。
[0006]数据表明在天然形式下，具有生物活性的Wnt需要在蛋白的保守半胱氨酸上进行棕榈酰化，参见，尤其是，Willert et al. (2003)Nature423:448-452 和 Nusse (2005)cell Research 15:28-32。此类脂质基团降低了 Wnt蛋白的水溶性。因此，迄今为止，用于分离生物有效浓度的有活性的天然和重组fct的方法，需要使用洗涤剂或脂质体（参见Willert et al.,同前，Zhao et al. (2009) Methods Enzymol. 465:331-347 和 Morrell etal. (2008) PLoS One 3(8) :e2930)o由于注射此类化学物到动物体内的问题，为了溶解Wnt而对此类化学试剂的需要限制了其药学应用。因此研制具有药学活性的水溶性wnt组合物引起人们很大的兴趣。
[0007]出版物
[0008]可溶性无翅基因蛋白的生物活性描述在van Leeuwen et al. (1994)Nature24:368(6469) :342-4中。采用可溶的、具有生物活性的脊椎动物Wnt蛋白的Wnt-卷曲蛋白相互作用的生物化学特征由Hsieh et al. (1999)Proc Natl Acad Sci USA96(7) :3546-51 描述。Bradley et al. (1995)Mol Cell Biol 15(8) :4616-22 描述了具有致有丝分裂活性的wnt蛋白的可溶性形式。Hoppler et al. (1996)Genes andDev. 10:2805-2817描述了显性失活的Wnt多肽，其为截短的Wnt (截短的Xwnt_8和截短的小鼠 Wnt-I)。Couso 和 Martinez-Arias (1994) Cell 79(2) :259-72 描述了 Dwnt-I 的突变等位基因，其编码具有大量羧基末端缺失的具有反效等位基因效应的分泌蛋白。其它显性失活的fct多肽和其使用方法描述在W02010/078458中。
[0009]Willert et al. (2003)Nature 423:448-452 描述了借助洗漆剂纯化 Wnt 蛋白的方法。Morrell et al. (2008)PLoS 0ne3 (8) : e2930描述了将Wnt蛋白构建到脂质体内，以及包裹在脂质体内的Wnt如何保持体内生物活性。专利公开包括美国专利号7，335，643和7，153，832和已公开的美国专利申请20080226707。
[0010]发明概述
[0011]提供了 Wnt组合物以及它们的使用方法。本发明的组合物包括具有期望的生物活性的wnt多肽片段,该片段在本文称为“小型wnt”。感兴趣的小型wnt多肽包括天然wnt蛋白和其衍生物的片段，例如，包括能提高目标性质的相对于天然序列的一个或多个氨基酸改变的类似物，所述性质例如溶解性、对目标受体的亲和力或特异性。所述片段，尤其是WntC末端的片段，可能是水溶性的。感兴趣的组合物包括，但不限于，配制于药学上可接受的赋形剂中的有效剂量的小型wnt多肽。组合物可以包括其它试剂，例如，佐剂等。小型wnt多肽可以通过合成方式产生，通过本领域已知的各种合适的重组方法等。
[0012]这些组合物和方法在抑制表达Wnt受体的细胞内的Wnt信号转导，例如，用于抑制异常的细胞增殖；将功能部分（functional moiety),如治疗或成像部分,递送至表达Wnt受体的细胞；以及用作制备fct特异性抗体的免疫原中特别有用。通常小型wnt能结合Wnt共受体对的一个而非两个。
[0013]在一些实施方案中，小型wnt为C末端（C-terminal)或“C末端（Cterm) ”小型wnt,其中C末端小型wnt为包含wnt多肽的羧基末端结构域或由wnt多肽的羧基末端结构域组成，且不包括氨基末端结构域的氨基酸残基的多肽。本文中以多个人fct蛋白为示例描述羧基末端结构域，例如，如图6中所示。还可以通过与本文中提供的序列比对而通过经验鉴定fct羧基末端结构域。在一个实例中，C末端小型wnt氨基酸序列通过保守残基与人Wntl的298-370位对齐，且缺少与人Wntl的1-257位残基对齐的氨基酸序列。C末端小型wnt通常为水溶性的。
[0014]在其它实施方案中，小型wnt为N末端（N-terminal)或“N末端（Nterm) ”小型wnt,其中N末端小型wnt为包含wnt多肽的氨基末端结构域或由wnt多肽的氨基末端结构域组成，且不包括羧基末端结构域的氨基酸残基的多肽。本文中以多个人fct蛋白为示例描述氨基末端结构域，例如，如图8中所示。还可以通过与本文中提供的序列比对而通过经验鉴定fct氨基末端结构域。在一个实例中，N末端小型wnt氨基酸序列通过保守的残基与人Wntl的34-247位对齐，且缺少与对应于人Wntl的288-370位残基的残基对齐的氨基酸序列。N末端小型wnt可以为水溶性的或者可以为脂溶性的。
[0015]在一些实施方案中，小型wnt多肽与功能部分融合或缀合，功能部分可以为治疗性部分，例如细胞毒性部分，或将细胞定向为ADCC或CDC指导的细胞死亡的部分。感兴趣的治疗性部分包括能改变细胞活性的部分。在一些实施方案中，功能部分为成像部分，例如，荧光团、发光体、放射性同位素等。在一些实施方案中，功能部分为低聚化部分，其能通过例如使用拉链或Fe多肽，或其它增强亲和力的化学或蛋白试剂而诱导小型wnt低聚化为同二聚物、同三聚物、同四聚物或更大的同聚物，或异二聚物，异三聚物、异四聚物或更大的异聚物。在一些实施方案中，功能部分为能延长小型wnt多肽的半衰期和/或增加小型wnt多肽的尺寸的蛋白或化学部分。
[0016]在本发明的一些方面，提供了将功能部分递送至细胞的方法，包括使包含感兴趣的功能部分的小型wnt与表达Wnt受体的目标细胞接触。在其它实施方案中，提供了抑制细胞内Wnt信号转导的方法。在此类方法中，使一定浓度的小型wnt多肽与表达Wnt的受体细胞接触，其中所述浓度的多肽可以有效抑制信号转导，例如，相比不存在小型wnt时的信号转导，将信号转导减少25%、50%、75%、90%、95%或者更多。此类信号转导抑制可以抑制靶细胞的增殖，或者可以干扰靶细胞内有活性的fct信号通路。
[0017]在本发明的方法中，如果Wnt受体为Fz蛋白、ROR蛋白或Ryk蛋白，小型wnt多肽通常为C末端小型wnt。如果Wnt受体为LRP5、LRP6或FRLl/crypto，小型wnt多肽通常为N末端小型wnt。在一些方法中，表达受体的细胞在体外接触。在其它实施方案中，表达受体的细胞在体内接触。如本领域所了解，目标细胞包括多种表达Wnt受体的细胞。
[0018]提供了制备Wnt特异性抗体的方法，该方法包括使用有效剂量的C末端或N末端小型wnt多肽免疫动物，任选地，使用佐剂配制所述小型wnt多肽。可以从血清获得多克隆抗体，或者可以将来源于动物的细胞用于制备单克隆抗体，作为用于产生重组制备的抗体等的多核苷酸来源。
[0019]提供了确定Wnt蛋白的同源受体的方法，该方法包括使对应于目标fct蛋白的小型wnt多肽与候选Wnt受体或其片段接触；以及确定所述小型wnt与所述候选受体的结合，其中特异性结合的存在表明所述Wnt蛋白为所述候选受体的配体。目标受体包括Fz蛋白、ROR蛋白或Ryk蛋白，其可以与C末端小型wnt接触；和LRP5、LRP6或FRLl/crypto，其可以与N末端小型wnt接触。可 使用多种结合测定,例如利用表达候选受体的细胞，但特别感兴趣的是能在溶液中进行的测定，例如，利用所述受体的可溶片段用于结合，包括但不限于Fz-CRD多肽和水溶性C末端小型wnt多肽之间的相互作用。
[0020]本发明的组合物和方法的优点是靶向特异性，其中小型wnt与其源自的天然wnt蛋白革巴向相同的细胞。例如，小型wnt选择性抑制能响应于Wnt母体蛋白的细胞内的Wnt信号转导。本领域已知的fct信号转导的抑制剂，例如，能结合特定Wnt受体的抗体，不会结合Wnt母体靶向的所有Wnt受体，而仅能结合它们对之具有特异性的Wnt受体。此外，水溶性形式的小型wnt的优点是不需要可能限制它们的治疗应用的配制添加剂。
【专利附图】

【附图说明】
[0021]结合附图可从下述详细描述最好地理解本发明。本专利或申请文件包含至少一张以彩色制作的绘图。本专利或专利申请公开的彩图复印件经要求将由官方提供并需要支付必要的费用。需要强调，根据惯例所述绘图的各种特征不按比例。相反，为清楚起见，所述各种特征的维度被随意放大或减小。说明书附图中包括以下附图。
[0022]图I.可溶性非洲爪蟾WntS ( "XwntS")的演化。图A (左侧）显示了在酵母表面表达的Wnt分子的示意图（cartoon)。Wnt分子携带引起该分子的水溶性的多个突变（星形）。连接到fct的C末端的为“Myc”标签，其在本该实验中用于使用Myc的抗体检测表达的Wnt。图A(右侧）中还显示了 Wnt受体卷曲蛋白（此种情况下为Fz5)的Wnt结合结构域的示意图。该结构域被称为“CRD”。所述CRD的示意图显示4个CRD分子，其排列结合到四价的链霉亲和素分子上(中央的十字形示意图)，其中所述链霉亲和分子连接到用于可视化的荧光染料。在图B中，显示了包含生物素的Fz5CRD，生物素被添加到其C末端，以便其能结合链霉亲和素。这显示在SDS-PAGE凝胶中，其中Fz5CRD向上“转移”结合到凝胶中的链霉亲和素上。这一 “转移”显示生物素存在于Fz5和Fz8CRD上。图C显示了细分为N末端(紫色底纹)小型fct、连接子(绿色底纹)和C末端小型Wnt (红色底纹)的全长非洲爪蟾fct8的序列。指示B7、A12、B2和A3的块状红色箭头表明小型wnt的不同序列边界。每个小型fct的实际边界是可变的(见图6)，且可以延伸多个残基到连接子中。
[0023]图2.各个A克隆的验证。对于每一个克隆,与Wnt C末端抗原表位结合的抗myc抗体显示在图1中，与酵母展示的XWnt8结合的Fz5和Fz8CRD显示在顶部FACS图中。在棕色块状箭头连接的下方伴随图中，显示当使用3C蛋白酶将Wnt从酵母上切掉时，丧失了抗Myc和Fz5/Fz8-CRD的结合。由于酵母展示的Wnt在Wnt和酵母间含有3C蛋白酶切割位点，因此与Myc和Fz-CRD结合的丧失表明与所展示的Wnt存在特异性相互作用，而不是以非特异性方式与酵母的相互作用。以这种方式，通过切割而丧失结合为非常严谨的结合特异性测试。㈧克隆wntA3的验证。使用了 AGA2-连接子-3C位点-GS-AWSAPDYCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLRVEEKKTEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVIEHFCAGSSGGEQKLISEEDLLEf*构建体。(B)克隆wntA12的验证。使用了 AGA2-连接子-3C位点-GS-AWSVNNFLEDSPDHCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLRVEEKKTEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVIKYFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI** 构建体。
[0024]图3.各个B克隆的验证。对于每个克隆,与Wnt C末端抗原表位结合的抗myc抗体显示在图1中，与酵母展示的XWnt8结合的Fz5和Fz8CRD显示在顶部FACS图中。在棕色块状箭头连接的下方伴随图中，显示当使用3C蛋白酶将Wnt从酵母切掉时，丧失了抗-Myc和Fz5/Fz8-CRD的结合。由于酵母展示的Wnt在Wnt和酵母间含有3C蛋白酶切割位点，因此与Myc和Fz-CRD结合的丧失表明与所展示的Wnt存在特异性相互作用，而不是以非特异性方式与酵母的相互作用。以这种方式，通过切割丧失结合为非常严谨的结合特异性测试。(A)克隆 wnt B2 的验证。使用了 AGA2 -连接子-3C 位点-GS-NGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFKDNSSTIEGRYPYDVPDYALQASGGGGSVLEDLPDYCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLHVEEKKIEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVVKHFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI** 构建体。(B)克隆wnt B7的验证。使用了 AGA2-连接子-3C位点-GS-AWSVNNELIFLEDSPDYCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLRVEERKTEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVIKHFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI** 构建体。
[0025]图4.重组体的生产，来自杆状病毒感染的昆虫细胞的水溶性C末端小型Wnt8结构域，以及与Fz5CRD的相互作用的演示。在步骤I中，由昆虫细胞表达小型Xwnt8的B7边界形式，带有C末端六聚组氨酸标签(tag)(上方，最左边示意图)。在步骤2中，接着通过superdex-75凝胶过滤层析(以及伴随使用考马斯亮蓝染色的SDS-凝胶)纯化该蛋白，其中显示其从柱子中洗脱，在表示具有正确丽的适当折叠蛋白的位置为小型fct。在步骤3中，接着将该小型Wnt8添加到Fz5-CRD-Fc融合物中，在步骤4中，通过凝胶过滤再分析。通过SuperdeX75柱对所述混合物分级分离，然后进行非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳，证明了 C末端小型wnt8和Fz5CRD-Fc融合物存在于相同的级分(fraction)中，其中在缺少Fz5CRD-Fc时，C末端小型wnt8在更早的级分中洗脱。在步骤5中，Fz5CRD_Fc融合物与蛋白A的Fz免疫沉淀反应也使C末端小型wnt8蛋白沉淀。因此以两种方式证实了小型XWntS和Fz5-CRD间的特异性结合相互作用的形成:步骤4 -使用凝胶过滤共洗脱，和步骤
5-免疫共沉淀。
[0026]图5.通过表面等离子体共振(Biacore)测量mFZ8/5_CRD的小型XWnt8 (氨基酸残基248 - 338)的结合亲和力。Fz8-CRD或mFz5CRD通过C末端生物素连到包被了链霉亲和素的CM4Biacore芯片上。数据证明了纯化的昆虫表达的小型XWnt8C末端片段与Fz5 CRD和Fz8 CRD的直接相互作用。在图的底部，显示了原始的拟合曲线数据和结果。
[0027]图6.人Wnt的C末端结构域与来自非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)的Wnt8 (ΝΜ_001088168)和来自黑腹果妮(Drosophila melanogaster)的 Wnt5 ( “Drome”)的C末端结构域的比对。
[0028]图7.LRP6细胞外结构域和XWnt8的N末端小型Wnt及其突变体之间的相互作用。(a)XWnt8的野生型N末端小型wnt和LRP6之间的相互作用。(b)来源于易错酵母文库的XWnt8的N末端小型wnt的克隆和LRP6之间的相互作用。通过使用抗c_myc (直方图；c-myc抗体:1:250 一抗,1:100 二抗)的FACS分析克隆，以验证表面展示，并使用LRP6(E1E2)-Fc (点阵图；LRP6 (E1E2)-Fe:2μΜ, 1:25 二抗)以证明所述结构域结合 LRP6。直方图中设门的结构域(gated domain)中的峰值表明了 c_myc的阳性信号，因此表明N末端小型wnt-8的存在。点阵图的右下象限中的群体表明了 LRP6的阳性信号。注意所有(b)中的克隆与产生于野生型N末端小型wnt的(a)中的克隆都具有相当的FACS点。在一些克隆中，Cys55Ala或Serl87Ala突变在制备文库前合并到母体XWnt8 cDNA中，以确保所述多肽不会因棕榈酸脂质基团的添加而改变。此类突变位点是基于已发表的文献选择的，所述文献将Wnt3A中55和187的类似位置指定为棕榈酰化位点(见，例如，Willert etal.(2003)同上)。还提供了 XWntS N末端结构域的非突变野生型染色，其也证明了 Lrp6的大量结合。因此，这些数据证明了水溶性N末端小型Wnt结合LRP6。
[0029]图8.人Wnt的N末端结构域与非洲爪蟾Wnt8和黑腹果蝇Wnt5 ( “Drome” )的N末端结构域的比对。
[0030]发明详述
[0031]在描述本发明方法和组合物之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法或组合物，因为其当然可以发生变化。同样也应当理解本文中使用的术语目的仅仅是为了描述具体实施方案，且并非旨在限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求所定义。
[0032]如果提供了数值范围，除非上下文另有明确说明，应当理解，该范围的上限和下限之间，精确到下限的单位的十分之一的每个中间值也被具体地公开。在表述的值范围内任何表述的值或中间值间与该表述的范围内的任何其它表述的值或中间值之间的每个更小范围都包括在本发明中。此类更小范围的上限和下限可能独立地包括于或排除于该范围，且如果端值的两者之一、两者都不或两者包括在所述更小范围内，其每一个范围也包括在本发明中，这受到所表述的范围中的任何特定排除的阈值的限制。如果所表述的范围包括所述端值的一个或两个，排除那些包括在内的端值的两者之一或两者的范围也包括在本发明中。
[0033]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管可以将与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料用于本发明的实践或测试，现在描述一些可能和优选的方法和材料。将本文中提及的所有出版物通过引用并入本文中，以公开和描述与所述出版物引用的方法和/或材料有关的方法和/或材料。应当理解，本公开取代所并入的出版物的任何公开，出现矛盾除外。
[0034]必须注意，如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，单数形式"a/an"和"the〃包括复数对象。因此，例如，提及〃细胞〃包括多个这样的细胞，提及"所述肽"包括提及一个或多个肽及其等同物，例如，本领域技术人员所了解的多肽等。
[0035]提供本文中所讨论的出版物仅仅是因为它们的公开早于本申请的申请日。本文中没有任何可以被理解为承认本发明不具备作为在先发明而早于此类出版物的资格。此外，提供的出版物的日期可能与真实出版日期不同，这可能需要进行独立确证。
[0036]定义
[0037]提供了小型wnt组合物和它们的使用方法。此类组合物和方法在抑制表达fct受体的细胞内的fct信号转导，例如，用于抑制异常的细胞增殖；将治疗性部分递送至表达Wnt受体的细胞；将成像部分递送至表达Wnt受体的细胞；和用于制备fct特异性抗体中特别有用。通过阅读如下更完整描述的组合物和方法的细节，本发明的此类和其它目的、优势和特征将对本领域技术人员变得明显。
[0038]“Wnt蛋白”为高度保守的分泌信号转导分子家族的成员，在胚胎形成和成熟组织中都具有关键作用。术语"fct"或"Wnt基因产物"或"Wnt多肽"在本文中使用时包括天然序列fct多肽、Wnt多肽变体、Wnt多肽片段和嵌合Wnt多肽。“小型wnt多肽”为这样的多肽，其为全长fct蛋白的片段，保留了其所源自的全长Wnt蛋白特异性结合一种或多种Wnt受体的能力。所述小型wnt与Wnt受体的结合可能具有显性负效应,抑制从Wnt受体的信号转导。
[0039]术语"天然序列Wnt多肽"指的是包括在天然条件下发现的序列的Wnt多肽。例如，本申请中的目标人天然序列fct蛋白包括下述:Wnt-l (GenBank登录号NM_005430)；ffnt-2 (GenBank 登录号 NM_003391) ；ffnt-2B (ffnt-13) (GenBank 登录号 NM_004185 (同种型 I)，NM_024494.2 (同种型 2))，ffnt-3 (Ref Seq.:NM_030753)，Wnt3a (GenBank 登录号NM_033131)，ffnt-4 (GenBank 登录号 NM_030761)，ffnt-5A (GenBank 登录号 NM_003392)，ffnt-5B (GenBank 登录号 NM_032642)，ffnt-6 (GenBank 登录号 NM_006522)，ffnt-7A (GenBank登录号 NM_004625)，Wnt_7B (GenBank 登录号 NM_058238)，Wnt_8A (GenBank 登录号NM_058244), ffnt-8B (GenBank 登录号 NM_003393)，ffnt-9A (Wnt-14) (GenBank 登录号NM_003395), Wnt_9B (Wnt-15) (GenBank 登录号 NM_003396)，Wnt-1OA (GenBank 登录号NM_025216)，Wnt-1OB (GenBank 登录号 NM_003394)，Wnt-1I (GenBank 登录号 NM_004626)，Wnt-16 (GenBank登录号NM_016087))。尽管每个成员具有与所述家族具有不同程度的序列一致性，其都编码小的(即39-46kD)、酰化、棕榈酰化、分泌的糖蛋白，该糖蛋白包含23-24个保守半胱氨酸残基，其间隔高度保守(McMahon，A P et al., TrendsGenet.1992;8:236-242;Miller, J R.Genome Biol.2002; 3 (I):3001.1-3001.15)。本发明中的其它目标天然序列fct多肽包括来源于任何哺乳动物的上述多肽的直系同源物，包括家养的和农场的动物，以及动物园、实验室或宠物动物，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、大鼠、小鼠、蛙、斑马鱼、果蝇、蠕虫等。[0040]"天然序列"小型wnt多肽为Wnt多肽序列的氨基酸序列片段。此类天然序列多肽可以从产生内源性fct蛋白的细胞中分离，或者可以通过重组或合成方式产生。因此，天然序列小型wnt多肽可以具有,例如,天然存在的人Wnt多肽、鼠Wnt多肽或来自任何其它哺乳动物物种的多肽，或者来自非哺乳动物物种(例如，果蝇、秀丽隐杆线虫等)的多肽所包含的氨基酸序列。
[0041]"变体"小型wnt多肽是指如下所定义的生物活性多肽，其在所述片段长度上与天然fct序列具有小于100%的序列一致性。此类变体包括如下所述的多肽，其中一个或多个氨基酸残基被添加到所述天然序列N末端或C末端或所述天然序列内，缺失了约1-40个氨基酸残基，且任选地由一个或多个氨基酸残基取代，此类变体还包括上述多肽的衍生物，其中氨基酸残基受到共价修饰从而所得产物具有非天然存在的氨基酸。通常，生物学活性变体具有的氨基酸序列与天然序列多肽具有至少约75%的序列一致性、约80%的序列一致性、约85%的氨基酸序列一致性、约90%的氨基酸序列一致性，优选至少约95%，更优选至少约99%的序列一致性。可以利用本领域已知的许多方法开发此类变体多肽。
[0042]"嵌合"小型wnt多肽为这样的多肽，其包含与异源多肽融合或缀合的小型wnt多肽。所述嵌合小型wnt多肽通常与初始小型wnt多肽共有至少一种生物学性质。嵌合多肽的实例包括与一个或多个功能部分(如治疗性部分、成像部分、表位标签)融合的小型wnt多肽。通常，当功能部分为多肽部分时，该部分具有足够的残基来提供功能，例如，促进多聚化、促进细胞死亡、改变细胞功能、荧光信号、表位序列等，然而该部分应足够短，使得其不干扰小型wnt多肽的生物活性。用作表位的合适标签多肽通常具有至少六个氨基酸残基，且通常为约6-250个氨基酸残基。
[0043]“水溶性的”是指在不存在去垢剂的情况下可溶于水性缓冲液的组合物，通常在提供生物有效剂量的多肽的浓度下是可溶的。水溶性的组合物形成了具有特定活性的大体均一的组合物，该活性为纯化其所源自的起始材料活性的至少约5%，通常为所述起始材料活性的至少约10%、20%或30%，更通常为所述起始材料活性的约40%、50%或60%，且可以为约50%、约90%或更高。本发明的 小型wnt组合物通常形成浓度为至少25 μ M和更高的大体均一的溶液，例如，至少25 μ Μ、40 μ M或50 μ Μ，通常至少60 μ Μ、70 μ Μ,80 μ M或90 μ Μ，有时高达100μΜ、120μΜ或150μΜ。换句话说，本发明的小型wnt组合物通常形成浓度为约
0.lmg/ml、约0.5mg/ml,约lmg/ml或更高的大体均一的溶液。
[0044]在本文中使用“Wnt蛋白信号转导”或“Wnt信号转导”来指生物活性Wnt在细胞上发挥其作用以调节细胞活性的机制。fct蛋白通过结合Wnt受体调节细胞活性，Wnt受体包括来自卷曲蛋白(Fz)蛋白家族的蛋白、来自ROR蛋白家族的蛋白、来自LRP蛋白家族的蛋白LRP5、LRP6、FRLl/crypto蛋白和Derailed/Ryk蛋白。一旦受到Wnt结合而激活，Wnt受体将激活一个或多个细胞内的信号级联。信号级联包括:经典Wnt信号转导通路；Wnt/平面细胞极性(Wnt/PCP)通路；Wnt-钙(ffnt/Ca2+)通路(Giles, RH et al.(2003)BiochimBiophys Actal653, 1-24;Peifer, M.et al.(1994)Developmentl20:369-380;Papkoff, J.etal(1996)Mol.Cell Biol.16:2128-2134;Veeman, M.T.et al.(2003)Dev.Cell5:367-377)；和其它本领域所熟知的Wnt信号转导通路。例如，经典Wnt信号转导通路的激活导致细胞内蛋白连环蛋白的磷酸化作用的抑制，导致胞液内连环蛋白的积累以及其随后向细胞核的迁移，在核内其与转录因子(例如，TCF/LEF)相互作用来激活目标基因。激活Wnt/PCP通路会激活RhoA、C-Jun N末端激酶(JNK)和nemo样激酶(NLK)信号转导级联，以控制此类生物学过程，如组织极性和细胞运动。通过例如结合Wnt-4、ffnt-5A或Wnt-1l而活化Wnt/Ca2+引起钙离子的细胞内释放，从而激活钙敏感性酶，如蛋白激酶C(PKC)、钙-钙调蛋白依赖性激酶II (CamKII)或钙调磷酸酶(CaCN)。通过分析上述信号转导通路的活性，可以容易地确定Wnt组合物的生物活性。“生物活性小型wnt”为能特异性结合Wnt受体且在体外或体内(也就是给予动物，例如哺乳动物)提供给细胞时能调节fct信号转导的小型wnt组合物。小型wnt多肽常常为显性负性的或竞争性的wnt信号转导抑制剂。
[0045]术语"特异性结合"指的是发生在成对物质之间的结合，如酶/底物、受体/配体、抗体/抗原和凝集素/碳水化合物，其可能受到共价或非共价相互作用或者共价和非共价相互作用的组合的介导。当所述两种物质的相互作用产生非共价结合的复合物时，发生的结合通常为静电式、氢键式或亲脂性相互作用的结果。因此，"特异性结合"发生在成对物质之间，其中所述两者间存在能产生具有抗体/抗原或配体/受体相互作用特征的结合复合物的相互作用。通过在体内施用后在功能分析中确定活性水平(例如，减速骨增生、下调干细胞增殖等)，在非功能分析(例如免疫染色、ELISA、考马斯或银染色凝胶上的定量等)中定量小型wnt蛋白的量,和确定在体内生物活性小型wnt与总体小型wnt的比率,可以确定组合物内的小型wnt蛋白的生物活性。生物活性小型wnt组合物为能将Wnt蛋白活性调节至少约40%、约60%，更通常情况下约70%、75%或80%，经常约85%、90%或95%，有时多达100%(即完全终止Wnt信号转导)的组合物。
[0046]本文中可互换使用术语“Wnt拮抗剂”、“Wnt抑制剂”和“Wnt信号转导的抑制剂”来指拮抗、抑制或负面调节细胞活性的fct调节作用的试剂。同样地，本文中可互换使用短语“拮抗fct信号转导”和“抑制Wnt信号转导”来指拮抗、抑制或负面调节细胞活性的Wnt
调节作用。
[0047]本文中使用“Fz ” 、“Fz蛋白”和“Fz受体”来指所述卷曲蛋白受体家族的蛋白。此类蛋白为包含CRD结构域的七次跨膜蛋白(Ingham，P.W.(1996) TrendsGenet.12:382-384;Yang-Snyder, J.et al.(1996)Curr.Biol.6:1302-1306;Bhanot, P.etal.(1996)Nature382:225-230)。存在十个已知的Fz家族成员(Fzl到FzlO)，其每一个都可以作为Wnt的受体。Fz受体介导许多Wnt生物活性，包括但不限于突触形成的调节。
[0048]本文中使用“LRP”、“LRP蛋白”和“LRP受体”来指低密度脂蛋白受体相关蛋白家族的蛋白。此类受体为单次跨膜蛋白，在受体介导的内吞作用过程中结合并内化配体。LRP蛋白 LRP5 (GenBank 登录号 ΝΜ_002335.2)和 LRP6 (GenBank 登录号 ΝΜ_002336.2)包括在 Wnt受体复合物中。
[0049]Ryk(其果蝇同系物为Derailed)为生长因子受体蛋白酪氨酸激酶家族的非典型成员，其在激活和核苷酸结合结构域内的许多保守残基上与其它成员存在差异。Ryk的蛋白序列可以在GenBank登录号NM_001005861(同种型I)和NM_002958.3 (同种型2)找到。Ryk作为Wnt蛋白的受体起作用，通常作为Fzs的共受体，且介导Wnt生物学活性，如调节成骨细胞分化、细胞迁移、细胞命运决定、轴突导向和神经突增生，包括运动神经元目标选择和肌肉神经节点处的突出发生。通过损伤激活所述Wnt/Ryk通路抑制轴突再生。
[0050]本文中使用“ ROR”、“ ROR蛋白”和“ ROR”受体”来指受体酪氨酸激酶样孤」L受体家族的RORl和R0R2蛋白。RORl的蛋白序列可以在GenBank登录号NM_005012.2 (同种型I)和ΝΜ_001083592.1(同种型2)找到。ROR2的蛋白序列可以在GenBank登录号NM_004560.3找到。RORl和R0R2作为Wnt蛋白的受体起作用，通常作为Fzs的共受体。
[0051]本文中使用“EGF-CFC蛋白”和“EGF-CFC受体”来指由表皮生长因子(EGF)-crypto、FRL-U cryptic家族编码的蛋白。此类蛋白包括Cripto (也称为“CR-1 ”和“Tdgf I (畸形癌衍生的生长因子I) ”，GenBank登录号ΝΜ_003212.3 (同种型I)和ΝΜ_001174136.1(同种型 2))和 Cryptic (也称为 “CFC1 ”，GenBank 登录号 ΝΜ_032545.2)。EGF-CFC蛋白共享变体EGF样基序(motif)、保守的半胱氨酸富集结构域和C末端疏水区。此类蛋白为fct受体，且在脊椎动物胚胎发生和肿瘤生长期间的细胞间信号转导通路中起关键作用。
[0052]“包含”是指所叙述的要素为所述组合物/方法/试剂盒所必须的，但可能在所述权利要求范围内包括其它要素以形成该组合物/方法/试剂盒等。例如，包含小型wnt多肽的组合物为可能包括除小型wnt多肽外其它要素的组合物，例如，功能部分，如与所述小型wnt多肽结合(如共价结合)的多肽、小分子或核酸；本领域很容易理解的能提高所述小型wnt组合物的稳定性的试剂、能提高所述小型wnt组合物的溶解度的试剂、佐剂等,不包括任何用否定条件涵盖的要素。作为另外一个实例，包含对应于例如人fct的298-370残基或例如34-247残基的Wnt氨基酸序列的小型wnt多肽可以包含该序列之外的Wnt氨基酸序列，除了否定条件描述的任何序列。
[0053]“基本上由…组成(consisting essentially of) ”是指将描述的组合物或方法的范围限制到不实质上影响本发明基本的和新的特征的特定材料或步骤。例如，“基本上由公开序列组成”的小型wnt多肽具有所公开序列的氨基酸序列，并且基于其所源自的全长母体Wnt序列，在所述序列的边界加上或减去约5个氨基酸残基，例如，比所述边界氨基酸残基少约5个残基、4个残基、3个残基、2个残基或I个残基，或比所述边界氨基酸残基多约I个残基、2个残基、3个残基、4个残基或5个残基。
[0054]“由…组成(consisting of) ”是指排除权利要求中的组合物、方法或试剂盒中没有指定的任何要素、步骤或组分。例如，“由公开的序列组成”的小型wnt多肽仅由所述公开的氨基酸序列组成。
[0055]“功能部分”或“FM”是指将功能活性赋予组合物的多肽、小分子或核酸组成部分。功能部分的实例包括，但不限于，治疗性部分、结合部分和成像部分。
[0056]“治疗性部分”或“TM”是指将治疗活性赋予组合物的多肽、小分子或核酸组成部分。治疗性部分的实例包括细胞毒素，例如，小分子化合物、蛋白毒素和放射增敏部分，即放射性核素等，其固有地不利于细胞；改变细胞活性的试剂，例如，小分子、肽模拟物、细胞因子、趋化因子；和将细胞引导向ADCC或CDC依赖性死亡的部分，例如，免疫球蛋白的Fe组分。
[0057]“成像部分”或“IM”是指非细胞毒素类试剂，其可以用于定位细胞和任选地使细胞可视化，例如，由本发明的组合物靶向的细胞。
[0058]寡聚部分为通过例如使用拉链或Fe多肽、生物素和抗生物素蛋白/链霉亲和素、或其它本领域已知的亲和力促进化学或蛋白试剂来诱导小型wnt低聚化为同二聚物、同三聚物、同四聚物或更大同聚物，或异二聚物、异三聚物、异四聚物或更大异聚物的多肽、小分子或核酸组成部分。[0059]本文中可互换使用短语“Wnt介导的疾病状态”和“Wnt介导的病症”来描述特征为异常或不良的fct信号转导的疾病、病症或疾病状态。在一个具体方面，所述异常fct信号转导为怀疑患病的细胞或组织内的Wnt信号转导水平超过了类似的非患病细胞或组织内的fct信号转导水平。Wnt介导的病症的实例包括与异常的血管生成相关的病症，例如视网膜病，和与异常的增殖相关的病症，例如癌症。
[0060]本文中使用术语"治疗(treatment)"、"治疗(treating)"等通常指得到期望的药理学和/或生理学效应。所述效应在完全或部分预防疾病或其症状方面可为预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或由所述疾病引起的不利影响方面为治疗性的。本文中所使用的"治疗"包括哺乳动物内疾病的任何治疗，包括:(a)预防所述疾病在可能易患该疾病但还没有诊断为患有该病的个体内发生；(b)抑制所述疾病，即阻止其发展；或(C)减轻所述疾病，即导致所述疾病的减退。所述治疗剂可以在疾病或损伤开始之前、期间或之后施用。发病中疾病的治疗，其中所述治疗稳定或减少患者的不良临床症状，尤其让人感兴趣。这类治疗最好在受累组织的功能完全丧失之前进行。所述治疗最好在所述疾病的有症状阶段期间施用，且在一些情形下在所述疾病的有症状阶段后施用。
[0061]本文中可互换使用术语"个体(individual)"、"个体(subject)"、"宿主"和"患者"，且指的是需要诊断、处理或治疗的任何哺乳类个体，尤其是人。
[0062]分子和细胞生物化学中的常规方法可以在此类标准教材如分子克隆中找至丨J:A Laboratory Manual, 3rd Ed.(Sambrook et al., CSH Laboratory Press2001);Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed.(Ausubel et al.eds., Johnffiley&Sons 1999);Protein Methods(Bollag et al., John ffiley&Sons 1996);NonviralVectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds., Academic Press 1999) ;ViralVectors (Kaplift&Loewy eds., Academic Press 1995);Immunology Methods Manual(1.Lefkovits ed.,Academic Press 1997);和 Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology (Doyle&Griff iths, John ffiley&Sons 1998),其公开通过引用并入本文中。本公开中涉及到的 用于基因操作的试剂、克隆载体和试剂盒可以从商业供应商例如 BioRacU Stratagene> Invitrogen、Sigma-Aldrich 和 ClonTech 获得。
[0063]组合物
[0064]提供了小型wnt组合物和它们的使用方法。小型wnt组合物为包含小型wnt多肽的组合物。如上所述，小型wnt多肽是这样的多肽，其为全长Wnt蛋白的片段，并保留其所源自的全长fct蛋白特异性结合至少一种Wnt受体的能力。与可同时结合到两种不同共受体的全长fct蛋白不同，小型wnt通常仅能结合共受体中的一个。小型wnt多肽通常长度为至少约40个氨基酸，通常长度为至少约50个氨基酸，且长度不大于约120个氨基酸，通常长度不大于约100个氨基酸，且在一些实施方案中，长度为约80至约100个氨基酸。
[0065]在一些实施方案中，所述小型wnt多肽为C末端小型wnt多肽，本文中也称为“C末端(C-terminal)小型wnt”或“C末端(Cterm)小型wnt”。C末端小型wnt为这样的多肽组成部分，其来源于即包括来自能结合Fz、R0R和/或Ryk Wnt受体的Wnt蛋白C末端结构域的序列。在一些实施方案中，所述C末端小型wnt为水溶性的。
[0066]C末端小型wnt包含wnt多肽的羧基末端结构域或由wnt多肽的羧基末端结构域组成，且不包括氨基末端结构域的氨基酸残基。在本文中以多个人fct蛋白为示例描述羧基末端结构域，例如，如图6中所示，且可以基本上由所描述结构域中所示的所有氨基酸残基组成，或者可以在所描述结构域的氨基或羧基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基。还可能通过与本文中提供的序列比对而通过经验鉴定C末端小型wnt。在一个实例中，C末端小型wnt氨基酸序列通过保守残基与人Wntl的298-370位对齐，且缺少与人Wntl的残基1-257对齐的氨基酸序列，或者可能如上所述进行截短。在一些实施方案中，C末端小型wnt为如上所定义的变体或类似物。在一些实施方案中，变异或突变改变对其同源受体的亲和力，溶解度，和/或对其同源受体的特异性。
[0067]在一些实施方案中，所述小型wnt多肽为N末端小型wnt多肽，本文中也称为“N末端(N-terminal)小型wnt”或“N末端(Nterm)小型wnt”。N末端小型wnt为这样的多肽组成部分，其来源于即由来自能结合LRP5、LRP6和/或crypto的Wnt蛋白N末端结构域的序列组成。在一些实施方案中，所述N末端小型wnt为水溶性的；在其它实施方案中，所述N末端小型wnt为脂溶性的。
[0068]在一些实施方案中，N末端小型wnt多肽为这样的多肽，其包含wnt多肽的氨基末端结构域或由wnt多肽的氨基末端结构域组成，且不包括羧基末端结构域的氨基酸残基。在本文中以多个人Wnt蛋白为示例描述所述氨基末端结构域，例如，如图8中所示，且可基本上由所描述结构域中所示的所有氨基酸残基组成，或者可在所描述结构域的氨基或羧基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基。还可能通过与本文中提供的序列比对而通过经验鉴定N末端小型wnt。在一个实例中,N末端小型wnt氨基酸序列通过保守残基与人fctl的34-247位对齐，且缺少与对应于人Wntl的残基288-370的残基对齐的氨基酸序列，或者可如上述进行截短。N末端小型wnt可为水溶性的或者可为脂溶性的。在一些实施方案中，C末端小型wnt为如上述的变体或类似物。在一些实施方案中，变异或突变改变对其同源受体的亲和力，溶解度，和/或对其同源受体的特异性。在一些这类实施方案中，在与人fctl的残基93和/或224对齐的残基处进行氨基酸取代，以使对应于人fctl的残基Cys55和/或Ser187的残 基为丙氨酸。
[0069]对应于来自任何生物物种(例如，小鼠、大鼠、猫、鸡、果蝇、蛙、斑马鱼、狗、蠕虫等)的Wnt蛋白的C末端小型wnt多肽和N末端小型wnt多肽可用于本申请的组合物中。可以通过使用比对软件(例如NCBI BLAST、ClustalW或本领域所熟知的其它软件)进行目标同源物或直系同源物与如图6和8中所提供的Wnt序列的比对，容易地确定此类小型wnt的多肽序列。包含小型wnt多肽的组合物可包括不同的要素，除了本文中特别表述为排除在所描述的小型wnt多肽外的要素，例如所述小型wnt可与外源性多肽融合。可能选择产生所述融合的位点以优化所述多肽的生物活性、分泌或结合特征。通过常规实验确定最佳位点。
[0070]例如，包含小型wnt多肽的组合物任选地包括与所述小型wnt多肽融合的多肽以进一步增加它们的溶解度。所述结构域可以通过限定的蛋白酶切割位点(例如，由TEV蛋白酶切割的TEV序列)连接到所述多肽。所述连接子还可以包括一个或多个柔性序列(flexible sequence),例如，I至10个甘氨酸残基。在一些实施方案中，所述融合蛋白的切割在维持所述产物溶解度的缓冲液中进行，例如，在0.5至2M尿素存在下进行，在增加溶解度的多肽和/或多核苷酸的存在下进行，以及其他条件。目标结构域包括内吞体裂解结构域，例如，流感HA结构域；和其它有助于产生的多肽，例如，IF2结构域、GST结构域、GRPE结构域等。
[0071]作为另一个实例,包含小型wnt多肽的组合物可以任选地包括对所述小型wnt多肽的修饰以增加稳定性。例如，所述多肽可以为聚乙二醇化的，其中聚乙烯氧基提供在血流中增长的存在时间。所述多肽可以与另一多肽融合以增加在体内的稳定性。通常这类融合伴侣为稳定的血浆蛋白，其可以例如当存在于融合物时，尤其是稳定的血浆蛋白为免疫球蛋白恒定结构域时，能延长所述多肽的体内血浆半衰期。在大部分情形下，当所述稳定的血浆蛋白通常发现为多聚体形式，例如，免疫球蛋白或脂蛋白，其中相同的或不同的多肽链通常为二硫化物和/或非共价地结合以形成组装的多链多肽时，本文中包含所述多肽的融合物也作为具有与所述稳定血浆蛋白前体基本上相同的结构的多聚体加以生产和使用。这些多聚体相对于它们包含的多肽药剂是同质的，或者它们可以包括多个多肽药剂。
[0072]稳定的血浆蛋白在它们的天然环境中通常展现在循环中延长的半衰期，即大于约20小时。合适的稳定血浆蛋白的实例为免疫球蛋白、白蛋白、脂蛋白、载脂蛋白和转铁蛋白。所述多肽药剂通常融合到所述血浆蛋白，例如，位于所述血浆蛋白或其片段的N末端的IgG，其能赋予所述多肽延长的半衰期。对所述多肽的血浆半衰期大于约100%的增加是令人满意的。通常，所述多肽以C末端融合到免疫球蛋白恒定区的N末端末端取代其可变区，然而N末端融合也可能具有作用。通常，这类融合至少保留免疫球蛋白重链恒定区的功能活性铰链、CH2和CH3结构域，其中的重链可以包括IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD，通常为IgG类蛋白中一种或组合。融合也产生于恒定区Fe部分的C末端，或者直接融合到所述重链的CHl的N末端或轻链的相应区域。这通常通过构建合适的DNA序列并在重组细胞培养内表达该DNA序列来完成。或者，可以根据已知方法合成所述多肽。
[0073]在一些实施方案中，对所述小型wnt进行修饰而不改变其序列。不改变一级序列的感兴趣的修饰包括多肽的化学衍生法,例如,酰化、乙酰化、羧化、酰胺化等。还包括糖基化修饰，例如，通过在多肽合成和加工期间或在进一步加工步骤中修改多肽的糖基化方式产生的修饰；例如，通过将所述多肽暴露于影响糖基化的酶，例如哺乳动物糖基化或去糖基化酶产生的修饰。还包括具有磷酸化氨基酸残基(例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸)的序列。
[0074]用于本申请的组合物和方法的小型wnt多肽可以使用普通分子生物学技术和合成化学进行修饰，以增加它们对蛋白水解降解的抗性或者优化溶解性能或者使它们更适合作为治疗剂。这类多肽的类似物包括含有非天然存在的L-氨基酸的残基的多肽，例如，D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。D-氨基酸可以取代部分或所有的氨基酸残基。
[0075]所述小型wnt多肽可以使用本领域所了解的常规方法通过体外合成制备。有各种商业合成装置可供使用，例如，Applied Biosystems, Inc., Beckman等的自动合成仪。通过使用合成仪，可以用非天然的氨基酸取代天然存在的氨基酸。具体序列和制备方法将根据方便、经济、所需纯度等确定。若需要，可以在合成期间或表达期间将不同的基团引入到所述肽中，其允许连接到其它分子或连接到表面。因此可以使用半胱氨酸来制备用于连接到金属离子复合物的硫醚、组氨酸，用于形成酰胺或酯类的羧基、用于形成酰胺的氨基等。
[0076]或者，所述小型wnt多肽可以使用本领域已知多种系统的任何一种，在含有细胞或无细胞的多肽合成系统内通过重组体DNA技术来制备。采用标准的连接技术构建包含以上所列组分的一种或多种的合适载体。将分离的质粒或DNA片段以期望的方式切割、剪切和重新连接以产生所需的质粒。对于用以确定所构建质粒内的正确序列的分析，使用所述连接混合物来转化宿主细胞，如合适通过氨苄青霉素或四环素抗性来选择成功的转化株。制备了来自所述转化株的质粒，通过限制性内切酶消化进行分析和/或进行测序。
[0077]本文中用于在载体内克隆或表达DNA的合适宿主细胞为原核生物、酵母或高等真核细胞，包括但不限于植物、哺乳动物、昆虫等细胞。用于这一目的的合适原核生物包括真细菌,例如，革兰氏阴性或革兰氏阳性生物,例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae),如埃希氏杆菌属(Escherichia),例如，大肠杆菌(E.coli),肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella),例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium),沙雷氏菌属(Serratia),例如,黏质沙雷菌(Serratia marcescans)和志贺菌属(Shigella),以及芽孢杆菌属(Bacilli),例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis),假单胞菌属(Pseudomonas),例如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa),和链霉菌属(Streptomyces)。此类实例为说明性的而非限制性的。
[0078]除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母为合适的表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是较低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、种和株通常可以获得且可用于本文中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)宿主如乳酸克鲁维酵母(K.1actis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)等；毕赤酵母(Pichia pastoris);假丝酵母(Candida);粗糖脉抱菌(Neurospora crassa);许旺酵母属(Schwanniomyces)如施旺酵母(Schwanniomyces occidentalis);和丝状真菌如青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主如构巢曲霉(A.nidulan)和黑曲霉(A.niger)。
[0079]合适的宿主细胞也可 能来源于多细胞生物体。此类宿主细胞具有复杂的加工和糖基化活性。原则上，任何较高等的真核细胞培养物都是可行的，无论来自脊椎动物或无脊椎动物培养物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的来自宿主，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蚬(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)的受纳昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株可以公开获得，例如，苜猜银纹夜蛾(Autographa California)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm_5株，且在本文中可以将此类病毒用作本发明的病毒，尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
[0080]可以将棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物用作宿主。通常，通过与细菌根癌农根菌(Agrobacterium tumefaciens)的某菌株一起培养转染植物细胞。在所述植物细胞培养物的这类培养期间，DNA编码序列被转移到所述植物细胞宿主中，以致其受到转染，且在适当的条件下将表达该DNA。此外，可以使用与植物细胞相匹配的调节和信号序列，例如胭脂碱合酶启动子和多腺苷酸化信号序列。
[0081]通过重组体合成制备的所述小型wnt多肽通常依照重组体合成的常规方法进行分离和纯化。裂解产物可以使用HPLC、排阻色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法或其它纯化技术来纯化表达宿主和裂解产物制备。在极大程度上，相对于所述产物的制备及其纯化方法相关的污染物，使用的组合物将包括期望产品的至少20wt%，更通常至少约75wt%，优选至少约95wt%，且对于治疗用途通常至少约99.5wt%。通常，该百分比基于总蛋白。
[0082]本发明的小型wnt多肽在结合同源的Wnt受体方面通常具有生物活性。在这种情况下，所述小型wnt特异性地结合Wnt受体,并在接触到表达所述受体的细胞时抑制Wnt信号转导，通常结合一个而非两个或fct共受体对。可以通过以下方式确定组合物内小型wnt多肽的生物活性:确定在功能分析(例如β_连环蛋白的去稳定化、干细胞生长的抑制等)中fct活性被所述小型wnt抑制的量，通过非功能分析(例如免疫染色、ELISA、考马斯或银染的凝胶定量等)定量存在的小型wnt多肽的量，和确定生物活性小型wnt与总小型wnt的t匕。用于小型wnt多肽特异性活性的示例性分析包括使细胞与包含Wnt的组合物(例如来自表达Wnt蛋白的细胞培养基)接触，并维持一段足够稳定β_连环蛋白的时间，通常至少约I小时。然后将小型wnt组合物提供给所述细胞，并孵育该细胞，通常至少约I小时，以允许所述小型wnt多肽完全取代所述Wnt蛋白。然后将所述细胞裂解，通过SDS PAGE解析细胞裂解物，接着将其转移到硝酸纤维素上并使用β_连环蛋白的特异性抗体探测。其它的分析包括非洲爪蟾动物cap分析中靶基因的C57MG转化和诱导。相对于不存在小型wnt存在时的信号转导，有效剂量或浓度的小型wnt多肽将信号转导(例如由细胞核β_连环蛋白的存在证实)减少25%、50%、75%、90%、95%或更多。
[0083]小型wnt的结合活性的一个方面为确定小型wnt所源自的全长Wnt蛋白的受体特异性的能力。通常，此类方法中使用的小型wnt与相应的全长Wnt蛋白具有高序列一致性，其中所述小型wnt通常与相应的全长Wnt蛋白在至少50、60、70、80、90个或更多个连续氨基酸的区段上相同。确定fct-Fz相互作用的主要阻碍在于不能表达Wnt以测量它们与卷曲蛋白受体的结合。例如，见 Kikuchi A, Yamet al.(2007)Cell Signal 19:659-71;Loganand Nusse (2004) Annu Rev Cell Dev Biol20:781-810;和 Wang et al.(2005)Mol CellBiol 25:5022-30。采用容易重组表达且能结合所述Fz-CRD的小型Wnt，现在使用所述小型Wnt作为结合剂可能以直接的方式匹配Fz受体与Wnt。以这种方式破解Wnt-Fz相互作用对发育生物学和再生生物学以及药物设计是变革性的。
[0084]在用于确定Wnt蛋白的同源受体的方法中，将候选Wnt受体或其片段与对应于目标全长fct蛋白的小型wnt多肽接触,所述全长Wnt蛋白可以为天然Wnt蛋白；并确定所述小型wnt与所述候选受体的结合，其中特异性结合的存在表明所述全长Wnt蛋白为所述候选受体的配体。目标受体包括可以使用C末端小型wnt接触的Fz蛋白、ROR蛋白或Ryk蛋白；和可以使用N末端小型wnt接触的LRP5、LRP6或FRLl/crypto。可使用多种结合测定，例如利用表达所述候选受体的细胞，但特别让人感兴趣的为能在溶液中进行的测定，例如利用所述受体的可溶性片段用于结合，其包括但不限于Fz-CRD多肽和水溶性C末端小型wnt间的相互作用。
[0085]在一些实施方案中，将本发明的小型wnt多肽与各种功能部分缀合，例如多肽、药物、放射性核苷酸或毒素。换句话说，本申请的组合物包括与所述小型wnt多肽缀合的功能部分。见,例如，PCT 公开 WO 92/08495 ；W0 91/14438 ；W0 89/12624 ;美国专利 5，314，995 ;和 EP 396,387。
[0086]可以与小型wnt多肽缀合的功能部分的一个实例为治疗性部分。治疗性部分包括但不限于，促进细胞死亡的部分和改变细胞活性的部分。[0087]促进细胞死亡的部分的实例包括细胞毒性剂，即细胞毒素，例如，抑制细胞生长或杀细胞的小分子、多肽药剂或放射性金属离子。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞不利的任何药剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、二羟蒽醌、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘诺尔和嘌呤霉素以及其类似物或同系物。细胞毒性剂还包括具有细胞毒素生物活性的蛋白、肽类或多肽，例如，毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素和白喉毒素。细胞毒性剂还包括放射性金属离子，即放射性核素，例如α -放射体，如铋-213、镭-226、铅-212、锕-225和砹-211，和β -放射体，例如碘化物-131、钇-90、铼-188、镥-177、铜-67和铜-64，以及用于使放射性金属离子(例如131In、131L、131Y、131Ho、131Sm)缀合到多肽或那些先前列出的任何多肽的大环螯合剂。可以通过连接子分子将大环螯合剂结合到所述抗体上，例如，如 Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res.4(10):2483-90;Petersonet al., 1999, Biocon jug.Chem.10 (4): 553-7 和 Zimmerman et al., 1999, Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中所描述，此类文献的每篇都通过引用全部并入本文中。
[0088]促进细胞死亡的部分还包括将细胞引向抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)或补体依赖性细胞毒性(CDC，又称补体介导的细胞裂解或CMC)的部分，例如免疫球蛋白的Fe组分。见，例如，Raghavan etal., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220;Ghetie et al., 2000, Annu Rev Tmmunol18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Tmmunol 19:275-290)。为了评价目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定。这类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤细胞(NK)细胞。可选地或另外地，可以在在体内评价目标分子的ADCC活性，例如在动物模型如Clynes et al.PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中公开的模型中评价。所有的Fe Y Rs结合Fe上的相同区域，在所述C Y 2结构域的N末端和前面的铰链处，该区域可以用作本发明目的的功能部分。在Fe上重叠但分开的位点充当补体蛋白Clq的界面。以Fc/Fc YR结合介导ADCC和ADCP相同的方式，Fc/Clq结合调节补体依赖性细胞毒性(OTC)。Fe上Cy2和Cy3结构域间的位点 介导与新生受体FcRn的相互作用，其中FcRn的结合从核内体回收内吞体到血流。
[0089]如本文中所使用，Fe融合物和本领域中使用的术语"免疫粘附素"、"Ig融合物"、"Ig 嵌合体"以及"受体球蛋白"(Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol14:52-60;Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Tmmunol9:195-200)是同义的。例如，Fe 融合物将免疫球蛋白的Fe区域与C末端或N末端小型wnt组合。见例如美国专利5，766，883和5，876，969，这两篇文献都通过引用特别地包括在本文中。
[0090]在促进细胞死亡的治疗性部分之外的治疗性部分包括改变细胞活性的药剂。此类治疗药剂包括但不限于，细胞因子、趋化因子、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、
6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟二氧嘧啶氨烯咪胺)、烷基化药剂(例如，二氯甲基二乙胺、噻替派苯丁酸氮芥、马法兰、卡莫司汀(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式-二氯二胺钼(II) (DDP)顺钼)、蒽环类药物(例如，道诺霉素(以前称为道诺霉素和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素(以前称为放线菌素)、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))，和抗有丝分裂药剂(例如，长春新碱和长春花碱)。[0091]适合于与本申请所述小型wnt缀合的其它功能部分包括成像部分。如上所述，成像部分为非细胞毒性剂，其可以用于定位细胞和任选地可视化细胞，例如由本申请的组合物所靶向的细胞。例如，可以使用荧光染料作为成像部分。在另一个实例中，非细胞毒性的放射性试剂还可以为成像部分。成像部分可能需要添加用于检测的底物，例如辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。或者，成像部分可以不需要添加用于检测底物而提供可检测的信号，例如突光团或发色团染料，如Alexa Fluor 488?或Alexa Fluor647'或者包括荧光团或发色团的蛋白，例如GFP、RFP、dsRED、phiYFP等及其突变体。
[0092]能产生两个或更多个小型wnt的多聚体的功能部分是感兴趣的，例如，如本领域所了解，包括具有高亲和力的结合对，如生物素和抗生物素蛋白/链霉亲和素，肽序列，如拉链结构域等。
[0093]用于将功能部分与多肽缀合的技术为本领域所熟知，见，例如，Amon etal., " Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy " , in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld etal.(eds.), pp.243-56 (Alan R.Liss, Inc.1985) ; Hellstrom et al., " AntibodiesFor Drug Delivery " , in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinsonet al.(eds.), pp.623-53 (MarceI Dekker, Inc.1987) ;Thorpe, " AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review " , in MonoclonalAntibodies ' 84:Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.(eds.), pp.475-506(1985) ;" Analysis, Results, And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy " , in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.), pp.303-16(AcademicPressl985), and Thorpe et al., " The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates" , Tmmunol.Rev.62:119-58 (1982)。
[0094]功能部分通常通过共价相互作用结合到本申请的组合物的小型wnt多肽。在一些实施方案中，可以使用连接子 ，其中所述连接子可以为能用于将所述小型wnt多肽连接到所述功能部分的任何部分。在一些实施方案中，所述连接子为可切割连接子。可切割连接子的使用使得连接到小型wnt多肽的部分一旦被细胞吸收并运送到细胞体，能够从所述小型wnt多肽上释放出来。所述可切割连接子可以被化学试剂切割、被酶切割，由于pH改变被切割，或通过暴露到能量下被切割。可能使用的能量形式的实例包括光、微波、超声和射频。
[0095]在一些应用中，释放所述功能部分可能是可取的，尤其是当所述部分为治疗性部分时，一旦该化合物进入细胞，就会导致所述部分的释放。因此，在一个变形实施方案中，连接子L为可切割连接子。这使得所述部分M—旦位于细胞内时从所述化合物上释放。这在一些情况下可能是可取的，例如，所述功能部分当从所述小型wnt多肽上分离时，为具有较大的治疗效果的治疗性部分。例如，所述治疗性部分当从所述小型wnt多肽上分离时，可能具有更强的被细胞内细胞组分吸附的能力。因此，可能需要或合理的做法是使所述治疗性部分与所述小型wnt多肽分离，以使所述治疗性部分可以进入细胞内室。
[0096]方法
[0097]在本发明的方法中，例如通过使细胞与有效量的组合物接触，将有效量包含小型wnt的组合物提供给细胞，以达到期望的效果，例如，用以抑制fct信号转导、抑制增殖或异常的血管形成、递送治疗或成像部分、产生抗体等。
[0098]在本发明的一些方法中，提供有效量的所述组合物来抑制细胞内的Wnt信号转导。从生物化学角度说，有效量或有效剂量的fct抑制剂为，相对于不存在所述小型wnt时的信号转导，能将细胞内Wnt信号转导减少或减弱至少约30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%的抑制剂的量。换句话说，相对于在没有与有效量/剂量小型wnt组合物接触的细胞中观察到的Wnt信号响应强度，与有效量或有效剂量小型wnt组合物接触的细胞的Wnt信号转导的响应为约70%或更少、约60%或更少、约50%或更少、约40%或更少、约30%或更少、约20%或更少、约10%或更少、约5%或更少，或为约0%，即可忽略不计。Wnt对细胞活性的调节量(即，细胞对Wnt信号转导的响应)可以通过为fct生物学领域的普通技术人员所了解的许多方法进行确定。例如，可以测量细胞内磷酸化β -连环蛋白的量；可以测量细胞内胞质β -连环蛋白的量；或可以测量通常由Wnt信号转导激活的转录因子的活性量，例如TCF/LEF，例如通过测量作为TCF/LEF的转录靶标的基因的RNA或蛋白水平，或通过使用包含可操作地连接到报道蛋白(如荧光素酶(TOPFlash)、EGFP (TOP-EGFP)等)的TCF结合位点(TOP)的核酸载体转染/感染细胞，并定性或定量地测量所产生的报道蛋白的量。以这种方式，可以确定试剂的拮抗效应。
[0099]以临床的角度来说，有效剂量的小型wnt组合物为如下剂量，当施用该剂量合适的时间段，通常至少约一周，且可能为约两周或更长时间，直到约4周、8周或更长的时期周期，将会表现出与不期望的fct信号转导相关的症状的改变。例如，有效剂量为如下剂量，当给予该剂量合适的时间段，通常至少约一周，且可能为约两周或更长时间，直到约4周、8周或更长的时间周期，将会减缓或者甚至停止癌症患者内的肿瘤生长或糖尿病视网膜病变患者的眼内新血管化。在一些实施方案中，有效剂量可能不仅减缓或停止疾病状态的进展，还可能诱导所述疾病状态的逆转。本领域技术人员应当理解，可能施用起始剂量持续这样的时间段，随后施用维持剂量，其在一些情况下为减小的剂量。
[0100]在一些实施方案中， 提供有效量的本申请组合物来将功能部分递送至细胞，例如，治疗性部分或成像部分。在这类实施方案中，有效量为所述功能部分获得治疗或成像功效
的所需量。
[0101]例如，在一些实施方案中，所述功能部分为细胞毒性治疗性部分。有效量的包括细胞毒性部分的组合物为足以选择性地促进被所述细胞毒性部分融合到的小型Wnt组合物所靶向的细胞内的细胞死亡的量。在某些情况下，有效量的功能部分是公知的，例如放射性核素的递送通常在10_30cGy/h的范围，方案取决于所述放射性同位素的半衰期。在另外的情况下，本领域普通技术人员使用本领域已知的用于分析细胞死亡的任何方便的方法(例如TUNEL染色、膜联蛋白染色、碘化丙啶摄取等)可以容易地确定所述有效量。本领域技术人员应当理解，可以施用初始剂量持续这样的时间段，接着施用维持剂量，其在一些情况下为减少的剂量。
[0102]作为另外一个实例，在一些实施方案中，所述功能部分为将细胞引向ADCC或CDC的治疗性部分。有效量的包括将细胞引向ADCC或CDC的部分的组合物为足以选择性促进所述细胞毒性部分融合到的小型wnt组合物所靶向的细胞内的ADCC或CDC的量。本领域普通技术人员可以使用本领域已知的任何用于分析ADCC和CDC的方便方法容易地确定所述有效量。
[0103]作为另外一个实例，在一些实施方案中，所述功能部分为成像部分。有效量的包含成像部分的组合物为足以选择性地标记细胞毒性部分融合到的小型wnt组合物所靶向的细胞的量。本领域一般技术人员可以使用可视化成像部分的领域已知的任何方便的方法(例如显微镜检查，如荧光显微镜或光学显微镜)容易地确定所述有效量。
[0104]所要施用的小型wnt组合物的有效量或有效剂量的计算在本领域一般技术人员能力范围内，且对本领域技术人员是常规的。显而易见的是，所要施用的最终量取决于给药途径且取决于所要治疗的病症或疾病状态的性质。
[0105]适合用于本申请方法的细胞为包含一种或多种Wnt受体的细胞。如上所述，Wnt受体包括Fz蛋白、ROR蛋白、Ryk、LRP5、LRP6和EGF-CFC蛋白。在一些实施方案中，所述细胞为表达包含CRD结构域或WIF结构域的Wnt受体的细胞。在此类实施方案中，用于所述方法的组合物包括为C末端小型wnt的小型wnt多肽。包含CRD结构域的Wnt受体的实例包括Fz蛋白和ROR跨膜激酶。包含WIF结构域的Wnt受体的实例包括Derailed/Ryk。在一些实施方案中，所述细胞为表达fct受体LRP5、LRP6或crypto的细胞。在此类实施方案中，用于所述方法的组合物包括N末端小型wnt的小型wnt多肽。
[0106]用于接触的细胞可能位于体外，即，在培养物中，或者它们可以位于体内，即，在个体体内。细胞可能来自/位于任何生物体，但优选来自哺乳类，包括人、家养和农场动物，以及动物园、实验室或宠物动物如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、大鼠、小鼠、青蛙、斑马鱼、果蝇、蠕虫等。优选地，所述哺乳类为人。细胞可以来自任何组织。细胞可以是冷冻的，或者它们可以为新鲜的。它们可以为原代细胞，或者可以为细胞系。更通常地，它们为体内的原代细胞。
[0107]尤其感兴趣的细胞为能响应于Wnt信号转导且与不良或其它异常细胞增殖(例如肿瘤发生、血管生成等)相关的细胞，尤其是因为它们可能与下述fct介导的疾病状态相关。作为实例，感兴趣的细胞包 括内皮细胞，其衬于血管的内表面的细胞，且当受到异常激活时，其可能与异常的血管生成相关。作为另外一个实例，感兴趣的细胞包括癌细胞，例如肿瘤细胞，如癌症干细胞，其为一种具有与正常干细胞相关的特性的癌细胞类型，即具体癌症样品中存在的能产生所有细胞类型的能力，且其与异常细胞增殖相关。
[0108]可以通过许多本领域熟知方法中的任何方法，使包含小型wnt多肽的组合物接触体外的细胞。例如，可以将所述组合物提供给培养细胞的培养基中的细胞。在本领域熟知的促进核酸摄取的条件下(例如电穿孔、氯化钙转染和脂质转染)，可以将编码所述小型wnt多肽的核酸提供给所述细胞或提提给在载体上与所述细胞共同培养的细胞。或者，可以通过病毒将编码所述fct抑制剂的核酸提供给细胞或提供给与所述细胞共同培养的细胞，即，使包含编码所述小型wnt多肽的核酸的病毒颗粒接触所述细胞。逆转录病毒，例如，慢病毒，尤其适合于本发明的方法，因为它们可以用于转染非分裂细胞(见，例如，Uchida etal.(1998)P.N.A.S.95(20): 11939-44)。通常使用的逆转录病毒载体为“缺陷型的”，即不能产生有效感染所需的病毒蛋白。当然，载体的复制需要在包装细胞系内生长。
[0109]同样地，可以通过所述领域内许多熟知的将多肽或核酸施用于个体的方法中的任何方法，使所述小型wnt组合物接触体内的细胞。可以将所述小型wnt组合物并入到多种制剂内，其中在一些实施方案且尤其是C末端小型wnt的实施方案中，所述制剂可在没有去垢剂、脂质体等存在下配制，如对于全长fct蛋白的配制中所描述。更具体而言，可以通过与恰当的药学可接受载体或稀释剂组合，将本发明的组合物配制成药物组合物，且可以将其配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。同样地，可以以不同的方式施用所述小型wnt组合物，包括经口给药、颊的给药、直肠给药、肠胃外给药、腹膜内给药、皮肤内给药、经皮给药、气管内给药等。通过使用局部施用、内部施用，或者使用用于在植入位点处保留活性剂量的植入物，活性剂在给药后可以为全身的或者可以为局部的。所述活性剂可以配制用于即时活性或者可以配制用于持续释放。
[0110]对于一些病症，尤其是中枢神经系统(CNS)病症，可能需要将药剂配制成能穿过血脑屏障(BBB)。一种穿过血脑屏障(BBB)给药的策略需要通过渗透性手段例如甘露醇或白细胞三烯，或利用生物化学方式通过使用作用于血管的物质(例如缓激肽)破坏BBB。对脑肿瘤使用BBB对目标特异性开放的药剂的可能性也是一种选择。当所述组合物通过血管注射施用时，BBB破坏药剂可以与本发明的治疗组合物共同施用。其它穿过BBB的策略可能需要使用内生运输系统，包括caveoil-Ι介导的转包吞作用、载体_介导的转运蛋白如葡萄糖和氨基酸载体、受体介导的胰岛素或转铁蛋白的转包吞作用和主动外向转运蛋白例如P-糖蛋白。主动运输部分还可能结合到用于本发明的治疗化合物上，以促进运输部分穿过血管的内壁。或者，BBB后的治疗药剂的给药可以通过局部给药，例如通过囊内，如通过奥马耶贮器(Ommaya reservoir)给药(见例如US专利编号5、222、982和5385582，本文中通过引用进行了包括)；通过快速注射，如通过注射器，如玻璃体内或颅内注射给药；通过持续输注，如通过管腔，如传送给药(见例如美国申请20070254842，其通过引用并入本文中);或通过植入药剂可逆地附着于其上的装置(见例如US申请编号20080081064和20090196903，将其通过引用并入本文)。
[0111]治疗用途。如上提及，本发明的小型wnt组合物在抑制对Wnt信号转导有响应的细胞内fct信号转导中具有作用。本领域一般技术人员可以通过本领域和本文前面表述的已知的方法，容易地确定细胞对fct的响应。具有生物活性的小型wnt组合物会抑制(即对抗或压制)细胞内的fct信号转 导。换句话说，具有生物活性的小型wnt组合物为Wnt信号转导的显性负性调节剂。
[0112]Wnt信号转导的显性负性调节剂(如本发明的小型wnt组合物)在治疗患有Wnt介导的疾病病症(如与异常细胞增殖或异常血管生成相关的病症，包括不同的与fct相关的癌症)的哺乳动物，例如人患者中具有作用。患有以此类病症为特征的疾病的患者，通过本申请要求保护的未决发明的治疗方案，将会受益匪浅。
[0113]术语"癌症"是指哺乳动物中的生理学病症，即通常以非调节的细胞生长/增殖为特征。癌症的实例包括，但不限于:恶性上皮肿瘤、淋巴癌、胚细胞癌和血癌。癌症的更具体的实例包括，但不限于:结肠直肠癌、慢性粒细胞白血病(CLL)、肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠直肠癌、小肠类癌、膀胱癌、胃癌、胰癌、肝癌(肝细胞癌)、肝胚细胞癌、食道癌、肺腺癌、间皮瘤、滑膜肉瘤、骨肉瘤、头和颈鳞状细胞癌、青少年鼻咽血管纤维瘤、脂肪肉瘤、甲状腺癌、黑素瘤、基底细胞癌(BCC)、成神经管细胞瘤和硬纤维瘤。用于通过所述方法治疗的尤其让人感兴趣的癌症包括神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌和胃癌。[0114]包含抑制肿瘤生长的小型wnt多肽的组合物为导致体外癌细胞增殖速率可测量的降低或者体内肿瘤生长抑制的组合物。例如，相比于合适的对照，优选的生长抑制fct拮抗剂会将肿瘤生长抑制至少约5%、至少约10%、至少约20%，优选约20%至约50%，且甚至更优选地，大于50%(例如，约50%至约100%)，其中对照通常为不使用测试的Wnt拮抗剂分子处理的癌细胞。如果以约I μ g/kg至约100mg/kg体重施用Wnt拮抗剂，在距离初次施用约5天至3个月内，优选在约5至30天内，导致肿瘤大小或细胞增殖的减少,该Wnt拮抗剂为体内生长抑制性的。
[0115]另外一个实例，本发明的组合物和方法在抑制CNS细胞内的异常的血管生成中具有作用。术语“血管生成”用于描述新血管从先已存在的血管中生长或萌发的生物学过程。在胚胎发生期间和在成熟生物体内，血管生成在脉管系统的加工中都起着至关重要的作用，例如，在伤口愈合中。然而，存在着许多由持续的非调控的或非恰当调控的血管生成引起的疾病状态。在此类疾病状态中，该异常的血管生成可能引起特定的疾病或者加剧已经存在的病理状态。例如，眼内的脉络膜新生血管(CNV)和随后的视网膜病被认为是失明的最常见原因，且成为许多眼病，最显而易见的为糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性(AMD、ARMD)，尤其是湿性/渗出性年龄相关性黄斑变性的病理基础。Wnt信号转导在发育期间参与促进CNS和视网膜内的血管生成。因此，Wnt抑制剂在治疗(即阻止所述CNS的疾病病症的)发展或进程中具有作用，其中异常的血管生成为影响因素。
[0116]抑制CNS内异常血管生成的小型wnt组合物或抑制CNS内新血管形成的wnt组合物导致对新脉络系统发育的可测量的抑制，例如培养物内的内皮细胞的管腔形成或者个体内的血管形成。相比适合的对照，优选的fct拮抗剂将新脉络系统发育速率抑制至少约10%、至少约20%，优选约20%至约50%，且甚至更优选地，大于50% (例如，约50%至约100%)，其中对照通常为不使用测试的fct拮抗剂分子处理的细胞。如果在距离初次施用所述fct抑制剂约5天至6个月内，优选在约5天至约2个月内，以约I μ g/kg至约100mg/kg体重施用Wnt拮抗剂导致心血管系统发育的减缓或停止，所述Wnt拮抗剂为体内抑制性的。心血管系统发育可以通过许多本领域熟知的和对普通技术人员显而易见的方法进行观察。例如，脉络膜新生血管的抑制可以容易地通过眼底照相直接观察，或通过分析视敏度测试的得分提高来间接观察。
[0117]此外，其它病症与异常Wnt信号转导相关，包括但不限于骨质疏松症、骨关节炎、多囊性肾病、糖尿病、精神分裂症、血管疾病、心脏疾病、非致瘤增殖性疾病和神经退行性疾病如阿尔滋海默氏病。
[0118]作为抑制Wnt信号转导的替换方案或附加方案，小型wnt组合物可以用于递送此前描述的治疗性部分以治疗前面提及的任何疾病。例如，小型wnt组合物可用于将细胞毒性部分递送至致瘤细胞，或用Fe部分标记致瘤细胞,所述Fe部分将细胞引导向ADCC或CDC介导的细胞死亡。另外一个实例，小型wnt组合物可用于将促进突触形成的细胞因子递送至处于神经退行状态的神经细胞，或者促进CNS损伤位点的轴突增生。所述小型wnt组合物的这些和其它治疗应用可以容易地为一般技术人员所了解。
[0119]为了包含到药剂中，小型wnt多肽可以使用普遍接受的制备方法获得。作为一般建议，非肠道的一次剂量施用的总药学有效量的fct抑制剂化合物在可以通过剂量响应曲线测量的范围内。[0120]根据期望的剂型，药物组合物可以包括，药学可接受的、无毒性稀释剂载体，其定义为通常用来配制用于动物或人施用的药物组合物的介质。所选择的稀释剂不影响所述组合物的生物活性。此类稀释剂的实例为蒸馏水、缓冲水、生理盐水、PBS、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank' s溶液。此外，所述药物组合物或制剂可以包含其它载体、佐剂，或无毒性的、非治疗的、无致免疫性的稳定剂、赋形剂等。所述组合物还可以包含其它物质来使生理条件接近，如pH调整和缓冲剂、毒性调整剂、湿润剂和洗涤剂。
[0121]所述组合物还可以包含多种稳定剂中的任何一种，例如，抗氧化剂。当所述药物组合物包含多肽时，该多肽可以与不同的熟知化合物进行络合，该化合物提高所述多肽的体内溶解性或者促进其药理学性质(例如，增加所述多肽的半衰期、减少其毒性、增加溶解性或吸收)。此类修饰剂或络合剂的实例包括硫酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐。组合物的多肽还可以与提高它们的体内属性的分子络合。此类分子包括，例如，糖类、多胺、氨基酸、其它多肽、离子(例如，钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、锰离子)和脂类。
[0122]关于适合于不同施用类型的剂型的进一步指导可以在Remington ' sPharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company,Philadelphia,Pa., 17thed.(1985)中找到。至于给药方法的简述，见，Langer, Science249:1527-1533 (1990)。
[0123]所述药物组合物可施用于预防性和/或治疗性治疗。活性成分的毒性和治疗功效可以根据标准的制药过程在细胞培养物和/或实验动物中进行确定，包括，例如，确定LD50 (群体的50%致死剂量)和ED5tl (群体的50%治疗有效剂量)。毒性效应和治疗效应之间的剂量比为治疗指数，且其可以表示为比值LD5(i/ED5(i。优选展现大的治疗指数的化合物。
[0124]从细胞培养和/或动物研究中获得的数据可以用于为人制定剂量范围。有效成分的剂量通常在一系列包括低毒性的ED5tl的循环浓度范围内。所述剂量可以在该范围内变化，其取决于采用的剂型和所用的施用途径。
[0125]用于配制所述药物组合物的组分优选具有高纯度且大体上没有潜在有害的污染物(例如，至少为国家食品(NF)级，通常至少为分析级，且更通常至少为药物级)。此外，用于体内使用的组合物通常为无菌的。考虑到给定的化合物必须在使用之前合成，产生的产品通常基本上不具有任何潜在的毒性剂，尤其是任何内毒素，其在合成或纯化过程中可能存在。用于肠胃外施用的组合物也是无菌的、基本等渗的，且在GMP条件下制得。
[0126]本发明的方法还在联合疗法中具有作用。例如，许多药剂可用于治疗异常的血管生成，例如血管抑素、内皮抑素、VEGF抑制剂等。同样地，许多药剂可用于治疗癌症，例如化疗剂、放射疗法等。联合使用本发明的小型wnt和这些其它药剂可能具有优势，即其中个体药物的所需剂量较低，且不同药物的效果互为补充。
[0127]成像部分的递送。如上文所提到，本发明的小型wnt组合物还可用于将成像部分递送至表达fct受体的细胞。例如，出于研究目的，例如，可以将与荧光部分缀合的小型wnt组合物用于标记和追踪体外和体内的细胞。
[0128]抗体牛成。本发明的小型wnt组合物还可以用于生成抗体。抗体可以通过本领域已知的任何合适的方法生成。本发明的抗体可以为多克隆或单克隆抗体。它们可以为单价的、二价的或多价的。它们可以为片段，例如F(ab)片段。制备抗体的方法为熟练技术人员所了角军(Harlow, et al.,抗体:a Laboratory Manual, (Cold spring Harbor LaboratoryPress, 2nd ed.(1988),其通过引用全部并入本文中)。[0129]在生成本发明的抗体中，将包含小型wnt多肽的所述组合物配制为用于注射，例如与佐剂注射，且将生成的免疫原用于免疫动物。可以将免疫原组合物的小型wnt多肽，有益处时，制成在其中所述小型wnt多肽被附加到融合片段上的融合蛋白。例如，通过使得所述融合蛋白通过亲和色谱法分离和纯化，所述融合片段往往有助于蛋白纯化。融合蛋白可以通过培养使用融合核酸序列转染的重组细胞制得，其中所述融合核酸序列编码包括连接至所述蛋白羧基和/或氨基末端的融合片段的蛋白。融合片段可以包括，但不限于，免疫球蛋白Fe区域、谷胱甘肽-S-转移酶、β -半乳糖苷酶、能结合二价金属离子的多组氨酸片段和麦芽糖结合蛋白。
[0130]为了制备多克隆抗体，可以将如上所述的免疫原施用于不同的宿主动物，包括但不限于，兔、小鼠、大鼠等，以诱导生产包含对所述抗原具有特异性的多克隆抗体的血清。所属免疫原的施用可能需要一次或多次免疫剂的注射，且如果需要，包括佐剂的注射。根据宿主物种，可以使用不同的佐剂用于增加免疫反应，其包括但不限于，Freundi s(完整和不完整的)、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、多聚阴离子、肽、乳化油、钥孔虫戚血兰素、二硝基酚和潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。可能采用的佐剂的其它实例包括MPL-TDM佐剂(单磷酰脂A、合成海藻糖双紫堇灵霉菌酸酯(dicorynomycolate))。免疫方案为本领域所熟知且可以通过引起所选动物宿主内免疫反应的任何方法进行。佐剂也为本领域所熟知。
[0131]通常，通过多次皮下或腹腔注射，或肌内注射或通过IV将免疫原(有或没有佐剂)注射到哺乳类体内。免疫原可以包含有IL13多肽、融合蛋白或其变体。根据多肽的性质(即百分比疏水性、百分比亲水性、稳定性、净电荷、等电点等)，将免疫原结合到已知在被免疫的哺乳类体内产生免疫原性的蛋白上可能是有用的。这类结合包括通过将活性化学功能基团衍生到免疫原和将要结合的免疫原性蛋白上以形成共价键的化学结合，或者通过基于融合蛋白的方法学，或熟练技术人员了解的其它方法进行的结合。此类免疫原性蛋白的实例包括，但不限于，钥孔戚血蓝蛋白、卵白蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂和混杂的辅助T多肽。可以采用不同的佐剂来增加如上所述的免疫反应。
[0132]可以使用杂交瘤技术，例如如下描述的杂交瘤技术来制备单克隆抗体:Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)和美国专利 4，376，110，Harlow, etal., Antibodies:A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press,2.sup.nd ed.(1988)，HammerIing, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cel IHybridomas (Elsevier, N.Y., (1981)),或技术人员已知的其它方法。可以被用于制备单克隆抗体的方法的其它实例包括，但不限于，人B细胞杂交瘤技术(Kosboret al., 1983, Immunology Today4: 72 ；Cole et al., 1983, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:2026-2030),和 EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy, Alan R.Liss, Inc., pp.77-96)。此类抗体可以为任何的免疫球蛋白类,包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和任何其亚类。制备本发明的mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。
[0133]本领域存在许多用于制备单克隆抗体的方法，因此，本发明不限于它们在杂交瘤中的唯一生产。例如，单克隆抗体可以通过重组体DNA方法制备，如美国专利4，816，567中描述的方法。由此而论，术语"单克隆抗体"指的是来源于真核、噬菌体或原核单一克隆的抗体。使用常规工艺(例如，通过使用能特异性结合到编码鼠类抗体的重链和轻链或者来自人的、人化的或其它来源的这类链的基因上的寡核苷酸探针)，可以容易地对编码本发明的单克隆抗体的DNA进行分离和测序。本发明的杂交瘤细胞充当这类DNA的优选来源。一旦得到分离，所述DNA可以被放入到表达载体中，表达载体随后被转化到不另外制备免疫球蛋白的宿主细胞，例如NSO细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以得到重组宿主细胞内的单克隆抗体的合成。还可以，例如，通过用编码人重链和轻链恒定区的序列取代同源的鼠类序列(美国专利4，816，567;Morrison et al.，同前)，或者通过将编码非免疫球蛋白多肽的所有或部分序列共价结合到免疫球蛋白编码序列上，对所述DNA进行修饰。这类非免疫球蛋白多肽可以取代本发明抗体的恒定区，或者可以取代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区，以制备嵌合的二价抗体。
[0134]抗体可以为单价的抗体。制备单价抗体的方法为本领域所熟知。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰的重链的重组表达。通常在Fe结构域中的任何位点处截断重链，以阻止重链交叉连接。或者，使用另一氨基酸残基来取代相关的半胱氨酸残基或者将其删除以阻止交叉连接。
[0135]识别特定的抗原表位的抗体片段可以通过已知的技术产生。例如，使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab' )2片段)的酶，可以通过对免疫球蛋白分子进行蛋白水解来制备本发明的Fab和F(ab' )2片段。F(ab' )2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CHl结构域。
[0136]对于一些用途，包括人体内的抗体利用和体外的检测方法，可能更优选的是使用嵌合的、人化的或人的抗体。嵌合抗体为这样的分子，其中抗体的不同部分来源于不同的动物物种，如具有来源于鼠类单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。制备嵌合抗体的方法为本领域所了解。参见例如，Morrison, Science 229:1202(1985) ;0iet al.,BioTechniques 4:214(1986) ;Gi11ies et al., (1989)J.Tmmunol.Methods125:191-202;美国专利5, 807, 715;4, 816, 567;和4，816397，将其通过引用全部并入本文中。
[0137]人化抗体为非人物种内产生的抗体分子，其结合具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的框架(FR)区的期望的抗原。通常，人框架区内的框架残基被来自CDR供体抗体的相应的残基取代，以改变，优选地增加，抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法识别，例如，通过对CDR和框架残基相互作用的建模来识别对抗原结合和序列比较重要的框架残基，以识别特定位置的异常框架残基。(参见，例如，Queen et al.,美国专利5，585，089;Riechmann etal.，Nature332:323 (1988)，其通过引用全部并入本文中)。可以使用本领域已知的多种技术人化抗体，包括，例如，CDR-移植(EP 239, 400;PCT publication WO 91/09967;U.S.Pat.Nos.5, 225, 539; 5, 530, 101 和 5,585,089)，键饰(veneering)或重塑(resurfacing)(EP 592,106;EP 519,596;Padlan, Molecular Immunology28 (4/5):489-498(1991) ;Studnicka et al., Protein Engineering 7 (6):805-814 (1994);Roguska et al., PNAS91:969-973(1994)),以及链重组(chain shuffling)(美国专利 5，565，332)。
[0138]完全的人抗体尤其适合病人的治疗处理。人抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括上述的使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示法。另参见，U.S.Pat.Nos.4，444，887 和 4，716，111 以及 PCT 公开 WO 98/46645、WO 98/50433、WO98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735 和 WO 91/10741 ;其每一个都通过引用全部并入本文中。Cole et al.和Boerder et al.的技术,也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Riss, (1985)和Boerner et al., J.1mmunol., 147 (I):86-95, (1991)) ? 人抗体还可以使用转基因小鼠制备，该转基因小鼠不能表达功能性内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因。
[0139]可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白免疫印迹或其它的免疫化学技术测试候选小型wnt抗体以确认它们对目标Wnt的亲和力和特异性。进行用于表征个别抗体的测定包括，但不限于(I)抑制癌症干细胞的fct-自分泌增殖；以及(2)抑制Wnt诱导的TCF-LEF诱导的基因表达。
[0140]还可以依据本发明抗体的交叉反应性来描述或详细说明它们。本发明还包括结合小型wnt多肽的抗体，其与人Wnt具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%和至少50%的一致性(如使用本领域已知的方法和本文中描述的方法计算的)。因此，本发明的抗体结合到天然的母体Wnt蛋白的Wnt结构域上，小型wnt来源于该蛋白并抑制通常被该Wnt结合的受体复合物的激活。
[0141]优选的结合亲和力包括平衡解离常数或KD为10_8至10_15M的亲和力。本发明还提供了竞争性抑制抗体结合到本发明的抗原表位上的的抗体，其中所述抗原表位为通过本领域任何已知的方法，例如本文中描述的免疫测定，确定的决定竞争性结合的抗原表位。在优选的实施方案中，所述抗体竞争性抑制到所述抗原表位的结合的至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。
实施例
[0142]提供下述实施例是为 了给本领域普通技术人员提供如何制作和利用本发明的完整公开和描述，且并不试图限制本发明发明人所认为的发明范围，也不试图表示以下的实验为所完成实验的所有或仅有的实验。已经作出了努力以确保采用的数字的精确度(例如量、温度等)，但应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度数，并且压强位于或接近大气压。
[0143]我们试图通过使用体外演化方法鉴定保留生物活性的水溶性形式的Wnt或Wnt片段。考虑到野生型fct造成的困难在于，它们被修饰有能极大地减小它们的溶解性和被重组表达的能力的脂质基团，我们推断保留受体结合活性的水溶性fct或Wnt片段，将会对用于设计拮抗剂或激动剂型fct药物的Wnt研究的每一层面:生物化学层面、功能层面和翻译层面都具有改革意义。
[0144]为达到这一目的，采用了体外演化来揭示以下Wnt形式:a)具有结合受体卷曲蛋白活性的，和b)水溶性的。使用了酵母表面展示从fct变体中筛选符合这些标准的形式。由于酵母不具有将所述脂质基团结合到fct上所必需的酶，酵母表面展示系统独特地适合该目的:因为其在筛选中由酵母表达，任何鉴定为具有对Fz的结合亲和力的突变型Wnt —定缺少脂质基团并且因此为水溶性的。作为构想的验证，非洲爪蟾XWntS的野生型序列表达后，在酵母上没有观察到到Fz-CRD构建体的结合。
[0145]为了鉴别能被酵母表达并正确结合到Fz-CRD上的突变体或变体形式的XWnt8，使用在每个基因中引入3-4个碱基改变的易错PCR生成了突变型XWnt8基因的大文库。接着将这些变体融合酵母Aga2蛋白，并将融合构建体转化到酵母中。使用Fz-CRD(在此情形下Fz5-CRD)组合物筛选Wnt变体(~50，000拷贝每酵母)的文库，其中所述Fz-CRD被结合到链霉亲和素上以形成strep-Fz-CRD “四聚物”(图1)。结合到链霉亲和素提高了所述Fz-CRD的亲和力或多聚性，因此增强了该试剂的敏感性。例如，如图1b所示，由于链霉亲和素的添加促使所述CRDs (现在被链霉亲和素结合，见“ + ”泳道)以高得多的分子量运行，Fz5和Fz8CRD被完全生物素化。因此str印-Fz-CRD “四聚物”为用于酵母文库挑选的非常有效的试剂。
[0146]基于后面图中显示的实验，该图中基因的颜色编码和名称以及N末端结构域、连接子和C末端结构域在制图后完成。在挑选实验之前，不知道Wnt基因被细分为这些区域，并且仅仅考虑到体外演变实验的结果，即这些边界可以在fct基因上划出。图1C中的基因上的红色箭头指定了截短了的小型fct C末端片段的几个边界，以显示小型Wnt包括的全长基因的比例。
[0147]从XWnt8易错文库中挑选Fz5和Fz8_CRD四聚物几轮后，分离出了看来具有特异性和反应性的单个酵母克隆。单个酵母克隆对Fz-CRD四聚物的特异性通过FACS分析进行了确认。简略地说，每种融合构建体被设计为包含在酵母和XWntS之间的连接子中的蛋白酶位点和在酵母上的XWnt8末端的C末端Myc标签。在蛋白酶不存在和存在下，通过使用Fz-CRD四聚物或Myc特异性抗体沾染所述酵母，有力地确定了事实上所述四聚物是否特定性地与Wnt反应，或者是否该反应仅仅为非特定性结合到酵母上。如图2和图3中所示，当添加蛋白酶时所述Fz-CRD四聚物的FACS沾染被丢失，表明酵母克隆对所述Fz-CRD的反应，确实是由该酵母克隆展示的fct变体引起，且并非为所述Fz-CRD对所述酵母的非特定性结合。类似地，在蛋白酶存在下，Myc反应性被丢失。因此确认在鉴定的酵母克隆和FzCRD之间发生了特异性结合相互作用。
[0148]展示对Fz-CRD的特 异性结合活性的表达XWntS变体的酵母克隆，以可溶性重组体形式表达(图4)。举个例说，XWntS变体B7在昆虫细胞中表达，并通过凝胶过滤得到纯化，这表明其为在无清洁剂下折叠良好的水溶性蛋白。(图4，顶端)。添加到这一纯化的B7变体的Fz5-CRD与作为复合物的B7变体通过凝胶过滤共洗脱，证明Fz5_CRD “拉低”或特定性地结合到该重组的水溶性XWnt8变体上。因此，Xffnt8变体B7为水溶性的，且为Wnt的受体结合形式。
[0149]如上所述的其它XWnt8变体的分析揭示，所有可溶的和结合到Fz-CRD上的变体都为全长XWnt8的小的、截短了的形式。这些序列仅包含Wnt的C末端~100个氨基酸左右，因此，其被称为“小型fct”。尽管只要包含有主要的区域(图1中粉红色)，小型Wnt的准确边界可以不同(如图1)，这些小型wnt仍然保留Fz结合活性。因为在物种间的所有fct中该区域为高度保守的，小型fct代表了所有物种间Wnt的保守Fz结合片段。
[0150]为了精确定量小型wnt变体对Fz-CRD的结合亲和力，进行了表面等离子体共振(SPR)测定。从杆状病毒中表达并纯化小型XWnt8。将生物素化的Fz5-和Fz8-CRD结合到被杆状病毒表达的小型XwntS淹没的SPR芯片上。为了生成符合数学模型的结合曲线，将几种小型Wnt浓度注射到芯片上，并以反应单位(RU)记录结合的程度。从该数据中我们能够拟合结合曲线并计算~1-2微摩尔的亲和常数(KD)。因此，在纯化系统中该实验证明，在缺少清洁剂的水缓冲液中，小型XWnt8结合到具有生理亲和力的Fz-CRD上。
[0151]发现的小型XWnt8与其它Wnt的相关性非常明显。图6显示了整体人Wnt与包含Wnt的小型Wnt区域的XWnt8的序列比对，所述小型Wnt区域约为Wnt的最后110个残基。所述序列是高度保守的，表明所有哺乳类、脊椎动物和无脊椎动物fct的Fz结合结构域都位于如此描述的C末端小型Wnt结构域中。该结构域不包含任何的脂质结合位点且为水溶性的，因此其提供了完美的平台，可以通过该平台来制备调节fct信号转导的Wnt多肽。
[0152]已经了解通过Fz受体的大多数Wnt信号转导需要Wnt结合到Fz和共受体上，例如LRP5/6。然而，还不知道该共受体相互作用必需的Wnt结构域。基于我们的发现即小型Wnt C末端结构域结合到Fz上，我们推断N末端结构域(如图1所示)结合到Lrp6上。为了确定fct的N末端结构域是否与Lrp6存在相互作用，进行上述使用酵母展示的类似实验。首先，显示表达野生型XWnt8 N末端结构域的酵母克隆与Myc抗体存在沾染,证明N末端小型fct在酵母表面上表达(图7a，左侧图)。接着展示了酵母上LRP6到野生型XWntS的结合，清楚地证明小型Wnt的N末端结构域为Lrp6结合结构域(图7a,右侧图)。
[0153]我们接着制备了 XWnt8 N末端结构域的易错文库,并使用LRP6以与所述C末端小型wnt类似的方式挑选文库。图7b显示了一系列的来自该易错文库的酵母克隆，其与myc抗体以及与Lrp6受体特异性沾染。这些克隆的几个克隆比野生型N末端结构域的沾染要强得多，因此可能更加稳定或者具有更高的结合亲和力。因此，图7提供了制备出具有生物活性的小型N末端Wnt的证据。在图8中，我们显示了人Wnt的N末端区结构域也是非常保守的，也显示了这些形式的fct也使用N末端结构域来结合到Lrp6上。因此，虽然我们的研究使用非洲爪蟾fct8，该结论可以外推至展现强的序列保守性的其它物种。
[0154]整体来说，这些实验证明，Wnt被分为N末端Lrp5/6结合结构域和水溶性的C末端小型Wnt Fz结合结构域。每一个结构域都可以被用作制备Lrp5/6或Fz结合分子的平台，其中Lrp5/6或Fz结合分子用作诊断剂或作为调节Wnt信号转导的治疗剂。
[0155]前述仅仅阐述了本发明的原理。应当理解本领域技术人员可以设计不同的安排，这些安排在本文中尽管没有被明确描述或显示，但体现了本发明的原理且包括在其实质和范围中。此外，本文中叙述的所有实例和条件语言主要是为了帮助读者理解本发明的原理，并且本发明
【发明者】贡献的构想是为了促进本领域，且应当理解为不受限于此类具体叙述的实例和条件。此外，本文中叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有表述，都试图包括其结构和功能等效物。此外，此类等效物试图包括现有已知的等效物和未来开发的等效物，即开发的执行相同功能的任何成分，而不考虑其结构。因此，本发明的范围，不试图受限于本文中显示和描述的示例性实施方案。当然，本发明的范围和实质由所附权利要求呈现。
【权利要求】
1.组合物，包含小型wnt多肽,其中所述小型wnt多肽为C末端小型wnt或N末端小型writ。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述小型wnt多肽为C末端小型wnt,其能结合Fz蛋白、ROR蛋白或Ryk蛋白，且不结合相应的Wnt共受体。
3.权利要求2所述的组合物，其中所述C末端小型wnt为由图6中所示的C末端小型wnt氨基酸序列组成的多肽或其变体。
4.权利要求2所述的组合物，其中所述C末端小型wnt通过保守残基与人Wntl的298-370位对齐，且缺少与人Wntl的1_257位残基对齐的氨基酸序列，或其变体。
5.权利要求1所述的组合物，其中： 所述小型wnt多肽为N末端小型wnt,其能结合LRP5、LRP6或FRLl/crypto蛋白，且不结合相应的fct共受体。
6.权利要求5所述的组合物，其中所述N末端小型wnt为由图8中所示的Wnt氨基酸序列组成的多肽或其变体。
7.权利要求5所述的组合物，其中所述N末端小型wnt通过保守残基与人Wntl的34-247位对齐，且缺少与对应于人Wntl的288-370位残基的残基对齐的氨基酸序列，或其变体。
8.如权利要求2-7中任一项所述的组合物，其中所述变体为截短形式。
9.如权利要求2-7中任一项所述的组合物，其中所述变体包括一个或多个氨基酸缺失或取代。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述小型wnt多肽为水溶性的。
11.如权利要求ι-?ο中任一项所述的组合物，还包含融合的或缀合的功能部分。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述功能部分为治疗性部分或成像部分。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中使用佐剂配制所述组合物。
14.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制用于药物给药。
15.抑制细胞内fct信号转导的方法，包括： 使有效量的权利要求1-14中任一项所述的组合物与表达Wnt受体的细胞接触，其中Wnt信号转导受到抑制。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞的增殖受到抑制。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞为癌细胞。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞在体外。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞在体内。
20.将功能部分递送至细胞的方法，所述方法包括： 使权利要求11或12中所述的组合物与表达Wnt受体的细胞接触。
21.确定Wnt蛋白的同源受体的方法，所述方法包括： 使对应于目标Wnt蛋白的小型wnt多肽与候选Wnt受体或其片段接触； 确定所述小型wnt多肽与所述候选受体的结合； 其中特异性结合的存在表明所述Wnt蛋白为所述候选受体的配体。
【文档编号】A61K38/00GK103501799SQ201280014977
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年1月26日 优先权日:2011年1月28日
【发明者】柯南·克里斯托弗·加西亚, 阿荣·莱文 申请人:莱兰斯坦福初级大学评议会