用于早期神经修复的纳米药物的制作方法
【专利摘要】本
【发明内容】
描述了可以用于治疗受影响的患者的神经元损伤或神经元疾病的、疏水地修饰的纳米粒和聚合纳米结构，以及形成和使用所述纳米粒和纳米结构的方法。此外，所述纳米粒和纳米结构被设计为“双重作用”组合物，其用于通过修复受损伤的膜和抑制细胞内炎症来治疗神经元损伤和神经元疾病。
【专利说明】用于早期神经修复的纳米药物
[0001]相关申请的交叉引用
本申请在35 USC § 119(e)下要求2011年2月24日提交的美国临时申请序列号61/446，252的权益，其整个公开内容通过引用并入本文。
【技术领域】
[0002]本发明一般地涉及纳米药物领域。更具体地，本发明涉及疏水地修饰的纳米粒和聚合纳米结构以及形成和使用它们的方法。
[0003]背景和
【发明内容】
神经损伤和神经疾病是身体的虚弱的且复杂的表现。例如，脊髓损伤(SCI)会导致受影响的神经和内皮组织中的细胞膜的立即最初破裂，继之以广泛的继发性神经变性过程。大多数SCI病例涉及原发性损伤和随后的继发性损伤。在原发性损伤过程中，对脊髓的急性机械应激会破坏神经膜和造成向细胞中的Ca2+流入。后一种过程会触发一系列继发性的生物学事件(包括炎症、自由基释放和细胞凋亡)，这会进一步加重损伤。
[0004]在处于研究下的多种治疗中，一种关键方案是，在SCI的早期封闭受损伤的膜。迄今为止，已经将聚(乙二醇)(PEG)和普郎尼克P188用于膜修复。但是，这些试剂的有效性非常有限，部分地归因于它们在全身性施用以后的快速清除。例如，没有经过疏水修饰的PEG可以在神经损伤的治疗中产生可忽略的效力。
[0005] 申请人:已经证实了嵌段共聚物胶束作为纳米级膜修复剂在外伤性地损伤的脊髓中的功能(Shi等人(2010) Nature Nano technology 5:80-87，通过引用并入本文)。自组装的单甲氧基聚(乙二醇)-聚(D，L-乳酸)(mPEG-PDLLA) 二嵌段共聚物胶束(直径为60 nm)可以有效地修复由挤压损伤的轴突膜。静脉内地注射的mPEG-PDLLA胶束会恢复运动功能和减小SCI大鼠中的病灶的体积和炎症应答。在机理上，据信，具有受控的两亲性能的共聚物能够将疏水链插入受到机械破坏的、具有较低脂质堆积密度的膜中，但是在所述膜被封闭后会受到排斥。但是，自组装的胶束在体循环过程中的在体内的分解会允许两亲的单聚体(unimer)向损伤部位的有效递送。
[0006]设计出聚合物胶束来包封疏水抗炎药，这可有效地抑制由Ca2+流入诱导的细胞内损伤。如 申请人:的FRET研究所证实的，在全身性施用以后，胶束在血液循环过程中会降低它们的稳定性，特别当加载的药物被释放时(Chen等人(2008) Langmuir 24:5213-5217;Chen 等人(2008) Proc Natl AcacI Sci USA 105:6596-6601，二者通过引用并入本文)。单聚体和抗炎药都穿过受损的血液-脊髓屏障被递送至损伤部位。
[0007]此外，基于聚合物胶束的膜修复方法在临床应用中受到狭窄的治疗时间窗的挑战。例如，必须在继发性神经元损伤变得明显之前施用胶束。因而，非常期望用于治疗神经损伤和疾病的一种替代性治疗选择。
[0008]本公开内容证实，使用具有下述双重作用的治疗组合物，可以克服治疗神经损伤和疾病的问题:1)修复受损伤的膜，和2)抑制细胞内的炎症作用。与仅具有单一作用的治疗相比，所述的组合物可以协同地起作用以挽救更多的神经细胞免于损伤诱导的细胞死亡，并进一步延长干预的治疗窗。
[0009]本公开内容描述了可以用于治疗受影响的患者的神经损伤或神经疾病的、疏水地修饰的纳米粒和聚合纳米结构，以及形成和使用所述纳米粒和纳米结构的方法。
[0010]与本领域中已知的替代物相比，根据本公开内容的疏水地修饰的纳米粒和聚合纳米结构会提供几个优点。首先，本公开内容的纳米粒和纳米结构被设计为“双重作用”组合物，其通过修复受损伤的膜和抑制细胞内的炎症来治疗神经损伤和神经疾病。
[0011]其次，与本领域中已知的替代物相比，本公开内容的纳米粒和纳米结构具有改善的药代动力学参数。例如，所述纳米粒和纳米结构可以与向需要修复或治疗的部位的更靶向的递送相关联，且可以与在其它身体部位处的潜在有害的副作用和/或毒性的减少相关联。
[0012]第三，与在本领域中使用的其它PEG实施方案相比，本公开内容的纳米粒和纳米结构分别经过疏水修饰或包括疏水结构域。由于在全身性施用以后更慢的从身体的清除速率，疏水部分的包括会增强所述组合物的有效性。
[0013]第四，在本公开内容的纳米粒和纳米结构包括抗炎剂的实施方案中，可以将得到的组合物作为单一药剂施用给患者，无需分开施用纳米粒/纳米结构和抗炎剂。
[0014]最后，本公开内容的纳米粒和纳米结构可以具有提高的抗炎剂的加载效率，从而促进抗炎剂向需要修复或治疗的部位的更有效的且靶向的递送。
[0015]涵盖了下述编号的实施方案，且它们是非限制性的:
1.一种包含疏水地修饰的纳米粒的组合物，所述纳米粒包含多糖和药效团，其中所述多糖与所述药效团共价地结合。
[0016]2.条款I或条款2的组合物，其中所述多糖经由酰胺键与所述药效团共价地结
口 ο
[0017]3.条款I或条款2的组合物，其中所述多糖是壳聚糖。
[0018]4.条款I或条款2的组合物，其中所述多糖是壳聚糖衍生物。
[0019]5.条款I或条款2的组合物，其中所述多糖是乙二醇壳聚糖。
[0020]6.条款1-5中的任一项的组合物，其中所述药效团是脂肪酸。
[0021]7.条款1-5中的任一项的组合物，其中所述药效团是胆烷酸。
[0022]8.条款1-5中的任一项的组合物，其中所述药效团是阿魏酸。
[0023]9.条款1-5中的任一项的组合物，其中所述药效团是阿魏酸衍生物。
[0024]10.条款I的组合物，其中所述多糖是乙二醇壳聚糖，且所述药效团是阿魏酸。
[0025]11.条款10的组合物，其中所述纳米粒具有选自5: 1、11:1和21:1的每个乙二醇壳聚糖的阿魏酸取代度(阿魏酸:乙二醇壳聚糖链)。
[0026]12.条款10的组合物，其中所述纳米粒具有11:1的每个乙二醇壳聚糖的阿魏酸取代度(阿魏酸:乙二醇壳聚糖链)。
[0027]13.条款1-12中的任一项的组合物，所述组合物另外包含治疗有效量的抗炎剂。
[0028]14.条款13的组合物，其中所述抗炎剂是皮质类固醇。
[0029]15.条款14的组合物，其中所述皮质类固醇选自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲泼尼龙、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、氢化可的松和可的松。
[0030]16.条款14的组合物，其中所述皮质类固醇是甲泼尼龙。[0031]17.条款13的组合物，其中所述抗炎剂是姜黄素。
[0032]18.条款13的组合物，其中所述药效团是胆烷酸，且所述抗炎剂是甲泼尼龙。
[0033]19.条款13的组合物，其中所述药效团是阿魏酸，且所述抗炎剂是姜黄素。
[0034]20.条款1-19中的任一项的组合物，其中所述纳米粒的平均直径是约100至约500 纳米(nm)。
[0035]21.条款1-19中的任一项的组合物，其中所述纳米粒的平均直径是约200至约400 纳米(nm)。
[0036]22.条款1-19中的任一项的组合物，其中所述纳米粒的平均直径是约300纳米(nm) ο
[0037]23.条款1-19中的任一项的组合物，其中所述纳米粒的平均直径是约320纳米(nm) ο
[0038]24.条款1-19中的任一项的组合物，其中所述纳米粒的平均直径是约350纳米(nm) ο
[0039]25.条款1-24中的任一项的组合物，所述组合物用于治疗神经元损伤。
[0040]26.条款1-24中的任一项的组合物，所述组合物用于治疗脊髓损伤。
[0041]27.条款1-24中的任一项的组合物，所述组合物用于治疗外伤性脑损伤。
[0042]28.条款1-24中的`任一项的组合物，所述组合物用于接触受损伤的神经。
[0043]29.条款1-24中的任一项的组合物，所述组合物用于修复受损伤的神经。
[0044]30.条款1-24中的任一项的组合物，所述组合物用作神经保护剂。
[0045]31.条款1-30中的任一项的组合物，其中所述组合物与患者中的药代动力学参数的改善相关联。
[0046]32.条款1-30中的任一项的组合物，其中所述组合物与患者中的器官毒性减少相关联。
[0047]33.条款1-30中的任一项的组合物，其中所述组合物与患者中的肾损伤减少相关联。
[0048]34.一种包含聚合纳米结构的组合物,所述聚合纳米结构包含疏水芯、亲水壳和治疗有效量的抗炎剂。
[0049]35.条款34的组合物，其中所述纳米结构是胶束。
[0050]36.条款34或条款35的组合物，其中所述疏水芯承载抗炎剂。
[0051]37.条款34-36中的任一项的组合物，其中所述亲水壳包含单甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。
[0052]38.条款34-37中的任一项的组合物，其中所述疏水芯包含聚酯。
[0053]39.条款38的组合物，其中所述聚酯选自:聚ε -己内酯(PCL)、聚乳酸-乙醇酸(poly lactic-glycolytic acid, PLGA)、聚乳酸(PLA)和聚(D, L-乳酸)(PDLLA)。
[0054]40.条款38的组合物，其中所述聚酯是PLGA。
[0055]41.条款34-40中的任一项的组合物，其中所述抗炎剂是皮质类固醇。
[0056]42.条款41的组合物，其中所述皮质类固醇选自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲泼尼龙、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、氢化可的松和可的松。
[0057]43.条款41的组合物，其中所述皮质类固醇是甲泼尼龙。[0058]44.条款34-40中的任一项的组合物，其中所述抗炎剂是姜黄素。
[0059]45.条款34-44中的任一项的组合物，其中所述纳米结构的平均直径是约10至约200 纳米(nm)。
[0060]46.条款34-44中的任一项的组合物，其中所述纳米结构的平均直径是约50至约150 纳米(nm)。
[0061]47.条款34-44中的任一项的组合物，其中所述纳米结构的平均直径是约60纳米(nm) ο
[0062]48.条款34-44中的任一项的组合物，其中所述纳米结构的平均直径是约120纳米(nm)。
[0063]49.条款34-48中的任一项的组合物，所述组合物用于治疗神经元损伤。
[0064]50.条款34-48中的任一项的组合物，所述组合物用于治疗脊髓损伤。
[0065]51.条款34-48中的任一项的组合物，所述组合物用于治疗外伤性脑损伤。
[0066]52.条款34-48中的任一项的组合物，所述组合物用于接触受损伤的神经。
[0067]53.条款34-48中的任一项的组合物，所述组合物用于修复受损伤的神经。
[0068]54.条款34-48中的任一项的组合物，所述组合物用作神经保护剂。
[0069]55.条款34-54中的任一项的组合物，其中所述组合物与患者中的药代动力学参数的改善相关联。
[0070]56.条款34-54中的任一项的组合物，其中所述组合物与患者中的器官毒性减少相关联。
[0071]57.条款34-54中的任一项的组合物，其中所述组合物与患者中的肾损伤减少相关联。
[0072]58.一种组合物，其包含含有多糖的多糖纳米粒，其中所述多糖具有高分子量。
[0073]59.条款58的组合物，其中所述多糖是壳聚糖。
[0074]60.条款58的组合物，其中所述多糖是壳聚糖衍生物。
[0075]61.条款58的组合物，其中所述多糖是乙二醇壳聚糖。
[0076]62.条款58-61中的任一项的组合物，其中所述多糖的分子量是在约50 kDa至约250 kDa 之间。
[0077]63.条款58-61中的任一项的组合物，其中所述多糖的分子量是约100 kDa。
[0078]64.条款58-61中的任一项的组合物，其中所述多糖的分子量是约200 kDa。
[0079]65.条款58-64中的任一项的组合物，所述组合物另外包含治疗有效量的抗炎剂。
[0080]66.条款65的组合物 ，其中所述抗炎剂是皮质类固醇。
[0081]67.条款66的组合物，其中所述皮质类固醇选自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲泼尼龙、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、氢化可的松和可的松。
[0082]68.条款66的组合物，其中所述皮质类固醇是甲泼尼龙。
[0083]69.条款65的组合物，其中所述抗炎剂是姜黄素。
[0084]70.条款58-69中的任一项的组合物，其中所述纳米粒的平均直径是约100至约500 纳米(nm)。
[0085]71.条款58-70中的任一项的组合物，所述组合物用于治疗神经元损伤。[0086]72.条款58-70中的任一项的组合物，所述组合物用于治疗脊髓损伤。
[0087]73.条款58-70中的任一项的组合物，所述组合物用于治疗外伤性脑损伤。
[0088]74.条款58-70中的任一项的组合物，所述组合物用于接触受损伤的神经。
[0089]75.条款58-70中的任一项的组合物，所述组合物用于修复受损伤的神经。
[0090]76.条款58-70中的任一项的组合物，所述组合物用作神经保护剂。
[0091]77.条款58-76中的任一项的组合物，其中所述组合物与患者中的药代动力学参数的改善相关联。
[0092]78.条款58-76中的任一项的组合物，其中所述组合物与患者中的器官毒性减少相关联。
[0093]79.条款58-76中的任一项的组合物，其中所述组合物与患者中的肾损伤减少相关联。
[0094]80.一种治疗患有神经元损伤的患者的方法，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的条款1-33中的任一项的疏水地修饰的纳米粒。
[0095]81.一种治疗患有神经元损伤的患者的方法，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的条款34-57中的任一项的聚合纳米结构。
[0096]82.一种治疗患有神经元损伤的患者的方法，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的条款58-79中的任一项的多糖纳米粒。
[0097]83.条款80-82中的任一项的方`法，其中所述神经元损伤是脊髓损伤。
[0098]84.条款80-82中的任一项的方法，其中所述神经元损伤是外伤性脑损伤。
[0099]85.条款80-82中的任一项的方法，其中所述方法用于接触受损伤的神经。
[0100]86.条款80-82中的任一项的方法，其中所述方法用于修复受损伤的神经。
[0101]87.条款80-86中的任一项的方法，其中所述施用在发生神经元损伤的48小时内进行。
[0102]88.条款80-86中的任一项的方法，其中所述施用在发生神经元损伤的24小时内进行。
[0103]89.条款80-86中的任一项的方法，其中所述施用在发生神经元损伤的约I小时至约12小时之间进行。
[0104]90.条款80-86中的任一项的方法，其中所述施用在发生神经元损伤的12小时内进行。
[0105]91.条款80-86中的任一项的方法，其中所述施用在发生神经元损伤的8小时内进行。
[0106]92.条款80-86中的任一项的方法，其中所述施用在发生神经元损伤的4小时内进行。
[0107]93.条款80-86中的任一项的方法，其中所述施用在发生神经元损伤的2小时内进行。
[0108]94.条款80-93中的任一项的方法，其中所述方法与患者中的药代动力学参数改
善相关联。
[0109]95.条款80-93中的任一项的方法，其中所述方法与患者中的器官毒性减小相关联。[0110]96.条款80-93中的任一项的方法，其中所述方法与患者中的肾损伤减小相关联。
[0111]97. 条款80-93中的任一项的方法，其中所述方法会减轻与肾损伤有关的症状。
[0112]98.条款80-93中的任一项的方法，其中所述施用是注射。
[0113]99.条款98的方法，其中所述注射选自:关节内注射、静脉内注射、肌肉内注射、真皮内注射、腹膜内注射和皮下注射。
[0114]100.条款99的方法，其中所述注射是静脉内注射。
[0115]101.条款80-100中的任一项的方法，其中所述施用作为单次剂量施用来执行。
[0116]102.条款80-100中的任一项的方法，其中所述施用作为多次剂量施用来执行。
[0117]103.一种治疗患有神经元疾病的患者的方法，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的条款1-33中的任一项的疏水地修饰的纳米粒。
[0118]104.一种治疗患有神经元疾病的患者的方法，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的条款34-57中的任一项的聚合纳米结构。
[0119]105.一种治疗患有神经元疾病的患者的方法，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的条款58-79中的任一项的多糖纳米粒。
[0120]106.条款103-105中的任一项的方法，其中所述神经元疾病是急性神经元疾病。
[0121]107.条款103-105中的任一项的方法，其中所述神经元疾病是慢性神经元疾病。
[0122]108.条款103-107中的任一项的方法，其中所述施用是注射。
[0123]109.条款108的方法，其中所述注射选自:关节内注射、静脉内注射、肌肉内注射、真皮内注射、腹膜内注射和皮下注射。
[0124]110.条款109的方法，其中所述注射是静脉内注射。
[0125]111.条款103-109中的任一项的方法，其中所述施用作为单次剂量施用来执行。
[0126]112.条款103-109中的任一项的方法，其中所述施用作为多次剂量施用来执行。
[0127]113.一种药物制剂，其包含条款1-33中的任一项的疏水地修饰的纳米粒。
[0128]114.一种药物制剂，其包含条款34-57中的任一项的聚合纳米结构。
[0129]115.一种药物制剂，其包含条款58-79中的任一项的多糖纳米粒。
[0130]116.条款113-115中的任一项的药物制剂，所述药物制剂另外包含药学上可接受的载体。
[0131]117.条款113-116中的任一项的药物制剂，所述药物制剂任选地包括一种或多种其它治疗成分。
[0132]118.条款113-117中的任一项的药物制剂，其中所述制剂是单一单位剂量。
[0133]119.条款113-118中的任一项的药物制剂的冻干粉剂或粉末。
[0134]120.通过将条款119的冻干粉剂或粉末溶解于水中所生成的水溶液。
【专利附图】
【附图说明】
[0135]图1显示了在静脉内注射I ml加载了 5 mg/ml姜黄素的、疏水地修饰的乙二醇壳聚糖(HGC)纳米粒以后,通过Basso Beattie Bresnahan (BBB)评分测得的SCI大鼠的运动功能的恢复。加载效率是10%，这对应于纳米粒溶液中的500 yg/ml姜黄素。在脊髓挫伤损伤后2小时，进行通过颈静脉的注射。[0136]图2显示了表明HGC纳米粒在血液中的半衰期的药代动力学。
[0137]图3显示了加载姜黄素的HGC纳米粒的示例性合成。(a)阿魏酸是姜黄素水解的一种产物。(b) GC和FA之间的缀合的合成路线图。(c)加载姜黄素的HGC纳米粒的示意图。(d)在没有(左)或有HGC(右)存在下姜黄素在PBS中的溶解度试验。
[0138]图4显示了光声膜穿孔(poration)模型。(a)装备。(b)用钙黄绿素AM (绿色)和碘化丙啶(红色)进行的膜完整性试验。辐照后，在激光斑点内的区域中的细胞受到损伤，被碘化丙啶标记，而在辐照区域之外的细胞仍然是健康的，被钙黄绿素标记。(C)显示了辐照之后细胞的膜起泡的局部放大图像。细胞核被碘化丙啶标记。条=10 Um0
[0139]图5显示了用于记录CAP的双鹿糖间隙记录室。
[0140]图6显示了脊髓损伤和修复的体内研究的流程图。
[0141]图7显示了具有取代度(DS) = 21的FA-GC纳米粒中的加载的姜黄素的沉淀(参见右图)。相比而言，具有DS = 11的FA-GC能够稳定地包封姜黄素(参见左图)。
[0142]图8显示了(a)用阿魏酸(FA)化学缀合的乙二醇壳聚糖，所述阿魏酸是姜黄素水解的一种产物；(b)通过透射电子显微术(TEM)测得的加载姜黄素的GC-FA纳米粒的平均直径；(c)通过动态光散射(DLS)测得的加载姜黄素的GC-FA纳米粒的平均直径；(d)得自姜黄素(左，绿色)和Cy5.5-标记的FA-GC (右，红色)的荧光信号的共同局部化；(e)存在于FA-GC中的姜黄素在I个月内的沉淀。
[0143]图9显示了在质谱图中通过它 们的离子化片段(对于姜黄素，m/z=149 ;对于华法林，m/z=161)对姜黄素和华法林的检测。
[0144]图10显示了(a)使用源自姜黄素和华法林的质量强度之间的比例的校正曲线测得的姜黄素的浓度；(b)受损伤的脊髓相对于正常脊髓的姜黄素浓度；(c)通过一室模型测得的血液保留时间；(d)在脊髓的损伤部位处观察到的信号。
[0145]图11表明，FA-GC纳米粒中的姜黄素大部分通过肾消除。
[0146]图12显示了未修饰的GC的半衰期。
[0147]图13显示了受损伤的脊髓相对于其它器官的荧光强度。
[0148]图14显示了(a)灰质内部的荧光信号，其非常易受挫伤损伤的影响(参见腔的形成)；(b)在后白质中的髓鞘表现出不规则的形态学；(c)中央管附近的髓鞘表现出不规则的形态学；(d)灰质的高放大率SRS图像表现出红细胞凝块；(e)在前白质中的髓鞘表现为高度卷曲。
[0149]图15显示了在与GC-FA纳米粒一起温育4小时以后，姜黄素进入细胞和GC-FA靶向细胞膜。
[0150]图16显示了(a) GC-FA的细胞膜附着和姜黄素的细胞内化的共焦成像；(b) 0.2mg/ml GC-FA/姜黄素处理会显著减少PI染色的细胞的数目；(c) GC-FA/姜黄素处理会使存活率从20%增加至95%，单独的GC-FA帮助挽救了 55%的细胞；(d)所有3种处理显著保护了谷氨酸损伤模型中的PC12细胞。
[0151]图17显示了治疗的大鼠的运动功能的恢复。
[0152]图18显示了 FA-GC治疗以后镁和BUN的水平的下降。
[0153]图19显示了通过GFAP和ED-1对星形胶质细胞和巨噬细胞/活化的小胶质细胞的鉴别。[0154]图20显示了(a)在盐水治疗的动物中由星形胶质细胞边界指示的腔面积；(b)活化的星形胶质细胞和活化的小胶质细胞:盐水治疗的动物的损伤的中心(epicenter)的GFAP荧光；(c)活化的星形胶质细胞和活化的小胶质细胞:盐水治疗的动物的损伤的中心的ED-1突光；(d)在纳米粒治疗的动物中由星形胶质细胞边界指示的腔面积；(e)活化的星形胶质细胞和活化的小胶质细胞:纳米粒治疗的动物的损伤的中心的GFAP荧光；(f)活化的星形胶质细胞和活化的小胶质细胞:纳米粒治疗的动物的损伤的中心的ED-1荧光；(m) FA-GC/姜黄素治疗的组的GFAP荧光相对于盐水治疗的组显著减小(187.38±46.37相对于339.37 土 49.47) ； (n) FA-GC/姜黄素治疗的组的ED-1荧光相对于盐水治疗的组显著减小(103.20 土 39.67相对于242.35 土 55.38) ； (ο)纳米粒治疗的组的腔面积(1.67±0.5 mm2)相对于盐水治疗的组(5.19±0.92 mm2)显著减小。
[0155] 图21显示了加载姜黄素的FA-GC纳米粒相对于盐水治疗的安全性分析。
【具体实施方式】
[0156]本文中使用的“疏水地修饰的纳米粒”是指已经用疏水部分修饰的纳米粒。本文中使用的“聚合纳米结构”是指包含一种或多种聚合物的纳米结构。纳米粒或纳米结构被本领域技术人员理解为表示，具有至少一种亚微米大小的尺寸的颗粒。
[0157]在下文中描述了本发明的不同实施方案。在本文描述的一个实施方案中，提供了一种疏水地修饰的纳米粒。所述疏水地修饰的纳米粒包含多糖和药效团，其中所述多糖与所述药效团共价地结合。
[0158]在另一个实施方案中，提供了一种聚合纳米结构。所述聚合纳米结构包含疏水芯、亲水壳和治疗有效量的抗炎剂。
[0159]在另一个实施方案中,提供了一种多糖纳米粒。所述多糖纳米粒包含多糖，其中所述多糖具有高分子量。
[0160]在其它实施方案中，提供了治疗患者的神经损伤的方法。在一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述疏水地修饰的纳米粒。在另一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述聚合纳米结构。在另一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述多糖纳米粒。
[0161]在其它实施方案中，提供了治疗患者的神经疾病的方法。在一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述疏水地修饰的纳米粒。在另一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述聚合纳米结构。在另一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述多糖纳米粒。
[0162]在其它实施方案中，提供了药物制剂。在一个示例性的实施方案中，所述药物制剂包含所述疏水地修饰的纳米粒。在另一个示例性的实施方案中，所述药物制剂包含所述聚合纳米结构。在另一个示例性的实施方案中，所述药物制剂包含所述多糖纳米粒。
[0163]在本文描述的不同的实施方案中，本文描述的疏水地修饰的纳米粒的多糖组分可以与药效团共价地结合。在一个实施方案中，所述多糖经由酰胺键与药效团结合。
[0164]在本文描述的某些实施方案中，本文描述的疏水地修饰的纳米粒的多糖组分是壳聚糖。在本文描述的其它实施方案中，本文描述的疏水地修饰的纳米粒的多糖组分是壳聚糖衍生物。本文中使用的术语“壳聚糖衍生物”表示天然多糖壳聚糖的修饰形式。在本文描述的一个实施方案中，本文描述的疏水地修饰的纳米粒的多糖组分是乙二醇壳聚糖。
[0165]在本文描述的其它实施方案中，本文描述的疏水地修饰的纳米粒的多糖组分是脂肪酸。本文中使用的术语“脂肪酸”是指具有长脂族尾巴的羧酸，且可以是饱和的或不饱和的。脂肪酸的例子是本领域众所周知的，例如从甘油三酯或磷脂衍生出的那些。
[0166]在本文描述的不同的实施方案中，本文描述的疏水地修饰的纳米粒的药效团组分是胆烷酸。在本文描述的某些实施方案中，本文描述的疏水地修饰的纳米粒的药效团组分是胆烷酸衍生物。在本文描述的其它实施方案中，本文描述的疏水地修饰的纳米粒的药效团组分是阿魏酸。在本文描述的某些实施方案中，本文描述的疏水地修饰的纳米粒的药效团组分是阿魏酸衍生物。
[0167]在本文描述的某些实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒的多糖组分是乙二醇壳聚糖，且所述疏水地修饰的纳米粒的药效团组分是阿魏酸。在其它实施方案中，所述纳米粒具有测得的取代度，本领域技术人员将取代度理解为表示每个壳聚糖链的阿魏酸的数目。在某些实施方案中，所述纳米粒具有选自5: 1、11:1和21:1的每个乙二醇壳聚糖的阿魏酸取代度(阿魏酸:乙二醇壳聚糖链)。在一个实施方案中，所述纳米粒具有11:1的每个乙二醇壳聚糖的阿魏酸取代度(阿魏酸:乙二醇壳聚糖链)。
[0168]在本文描述的其它示例性的实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒进一步包含治疗有效量的抗炎剂。本文中使用的术语“治疗有效量”表示给动物提供期望的益处的量，且包括治疗性和预防性施用。该量将随动物不同而变化，且取决于许多因素，包括动物的总体身体状况和要治疗的病症的根本原因。本文中使用的术语“抗炎剂”表示减轻患者的炎症和/或减轻与炎症有关的疼痛或肿胀的任意化合物。
[0169]在某些实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒的抗炎剂组分是皮质类固醇。在其它实施方案中，所述皮质类固 醇选自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲泼尼龙、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、氢化可的松和可的松。在一个实施方案中，所述皮质类固醇是甲泼尼龙。在某些实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒的抗炎剂组分是姜黄素。
[0170]可以特异性地修饰所述疏水地修饰的纳米粒的多糖组分的疏水性，以优化抗炎剂的加载效率和细胞内递送以及疏水单聚体向受损伤的膜的插入。加载效率的优化可以导致抗炎剂向体内的需要部位处的更有效递送。此外，加载效率的优化可以导致抗炎剂向体内的需要部位处的靶向递送，且可以避免对体内的其它部位的有害的副作用或不希望的毒性。
[0171]在本文描述的不同的示例性的实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒的药效团组分是胆烷酸，且所述疏水地修饰的纳米粒的抗炎剂组分是甲泼尼龙。在本文描述的其它示例性的实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒的药效团组分是阿魏酸，且所述疏水地修饰的纳米粒的抗炎剂组分是姜黄素。
[0172]在一个示例性的方面，所述药效团连接至一部分的所述多糖的胺基。在一个实施方案中，所述阿魏酸结合至一部分的乙二醇壳聚糖的胺基。在一个实施方案中，所述阿魏酸结合至约1%到约30%、约1%到约20%、约5%到约30%、约5%到约20%、约5%到约15%或约8%到约15%、约8%到约12%的乙二醇壳聚糖胺。[0173]在本文描述的不同的实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒在溶液中可以具有下述平均直径:约10 nm至约950 nm、约10 nm至约700 nm、约100 nm至约950 nm、约100nm 至约 500 nm、约 100 nm 至约 400 nm、约 200 nm 至约 400 nm、约 250 nm 至约 350 nm、或约300 nm至约400 nm。也涵盖其中没有包括术语“约”的这些不同的纳米粒尺寸范围。在一个实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以具有约200纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以具有约250纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以具有约300纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以具有约320纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以具有约350纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以具有约400纳米的平均直径。
[0174]在本文描述的不同的实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以用于治疗神经损伤。在本文描述的其它实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以用于治疗脊髓损伤。在本文描述的其它实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以用于治疗外伤性脑损伤。在本文描述的其它实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以用于接触受损伤的神经。在本文描述的其它实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以用于修复受损伤的神经。在本文描述的其它实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以用作神经保护剂。
[0175] 在本文描述的某些实施方案中，所述疏水地修饰的纳米粒可以与患者中的药代动力学参数的改善相关联。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者对所述聚合纳米结构的吸收。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的分布。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的递送。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的消除。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中器官毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾损伤的减小。
[0176]在另一个实施方案中，提供了一种聚合纳米结构。所述聚合纳米结构包含疏水芯、亲水壳和治疗有效量的抗炎剂。
[0177]在本文描述的不同的实施方案中，本文描述的聚合纳米结构是胶束。本文中使用的术语“胶束”是指两亲分子在水中的聚集体，其中非极性部分是在内部，且极性部分是在外表面处。
[0178]在本文描述的某些示例性的实施方案中，本文描述的聚合纳米结构承载抗炎剂。本文中使用的术语“承载”包括连接、附着、结合、缀合等，包括部分地至完全地包封。在一个实施方案中，所述抗炎剂被承载在所述聚合纳米结构的疏水结构域中。
[0179]在某些实施方案中，所述聚合纳米结构的亲水壳组分包含单甲氧基聚(乙二醇)(mPEG) ο在一个示例性的方面，所述mPEG的分子量是约1000 Da至5000 Da、约1500 Da至约 4000 Da、约 2000 Da 至约 5000 Da、约 2000 Da 至约 3000 Da、或约 1500 Da 至约 2500Da。也涵盖其中没有包括术语“约”的这些mPEG尺寸范围。
[0180]在某些实施方案中，所述聚合纳米结构的疏水芯组分包含聚酯。在其它实施方案中，所述聚酯选自--聚ε-己内酯(PCL)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)和聚(D，L-乳酸)(PDLLA)。在一个实施方案中，所述聚酯是PLGA。在一个示例性的方面，所述PCL、PLGA、PLA 或 PDLLA 具有约 2000 Da 至约 20，000 Da、约 4000 Da 至约 20，000 Da、约2000 Da 至约 16，000 Da、约 4000 Da 至约 16，000 Da、约 8000 Da 至约 16，000 Da、或约 4000Da至约8000 Da的分子量。也涵盖其中没有包括术语“约”的这些尺寸范围。涵盖了上述的mPEG的分子量和PCL、PLGA, PLA或TOLLA的分子量的任意组合。
[0181]在某些实施方案中，所述聚合纳米结构的抗炎剂组分是皮质类固醇。在其它实施方案中，所述皮质类固醇选自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲泼尼龙、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、氢化可的松和可的松。在一个实施方案中，所述皮质类固醇是甲泼尼龙。在某些实施方案中，所述聚合纳米结构的抗炎剂组分是姜黄素。
[0182]在本文描述的不同的实施方案中，所述聚合纳米结构在溶液中可以具有下述平均直径:约10 nm至约950 nm、约10 nm至约700 nm、约10 nm至约200 nm、约50 nm至约150nm、约 100 nm 至约 950 nm、约 100 nm 至约 500 nm、约 100 nm 至约 400 nm、约 200 nm 至约400 nm、约250 nm至约350 nm、或约300 nm至约400 nm。也涵盖其中没有包括术语“约”的这些不同的纳米结构尺寸范围。在一个实施方案中，所述聚合纳米结构可以具有约200纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述聚合纳米结构可以具有约150纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述聚合纳米结构可以具有约120纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述聚合纳米结构可以具有约100纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述聚合纳米结构可以具有约60纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述聚合纳米结构可以具有约50纳米的平均直径。
[0183]在本文描述的不同的实施方案中，所述聚合纳米结构可以用于治疗神经损伤。在本文描述的其它实施方案中，所述聚合纳米结构可以用于治疗脊髓损伤。在本文描述的其它实施方案中，所述聚合纳米结构可以用于治疗外伤性脑损伤。在本文描述的其它实施方案中，所述聚合纳米结构可以用于接触受损伤的神经。在本文描述的其它实施方案中，所述聚合纳米结构可以用于修复受损伤的神经。在本文描述的其它实施方案中，所述聚合纳米结构可以用作神经保护剂。
[0184]在本文描述的某些实施方案中，所述聚合纳米结构可以与患者中的药代动力学参数的改善相关联。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者对所述聚合纳米结构的吸收。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的分布。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的递送。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的消除。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中器官毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾损伤的减小。
[0185]在另一个实施方案中，提供了一种多糖纳米粒。所述多糖纳米粒包含多糖，其中所述多糖具有高分子量。
[0186]在本文描述的不同的实施方案中，所述多糖具有高分子量。例如，所述多糖的分子量可以是在约50 kDa至约250 kDa之间。在某些实施方案中，所述多糖的分子量是约50kDa。在其它实施方案中，所述多糖的分子量是约75 kDa。在其它实施方案中，所述多糖的分子量是约100 kDa。在某些实施方案中，所述多糖的分子量是约125 kDa。在其它实施方案中，所述多糖的分子量是约150 kDa。在其它实施方案中，所述多糖的分子量是约200kDa。在某些实施方案中，所述多糖的分子量是约250 kDa。
[0187]在本文描述的某些实施方案中，本文描述的多糖纳米粒的多糖组分是壳聚糖。在本文描述的其它实施方案中，本文描述的多糖纳米粒的多糖组分是壳聚糖衍生物。在本文描述的一个实施方案中，本文描述的多糖纳米粒的多糖组分是乙二醇壳聚糖。在本文描述的其它实施方案中，本文描述的多糖纳米粒的多糖组分是脂肪酸。
[0188]在本文描述的其它示例性的实施方案中,所述多糖纳米粒进一步包含治疗有效量的抗炎剂。在某些实施方案中，所述多糖纳米粒的抗炎剂组分是皮质类固醇。在其它实施方案中，所述皮质类固醇选自:倍他米松、地塞米松、氟米松、甲泼尼龙、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、曲安西龙、氢化可的松和可的松。在一个实施方案中，所述皮质类固醇是甲泼尼龙。在某些实施方案中，所述多糖纳米粒的抗炎剂组分是姜黄素。
[0189]在本文描述的不同的实施方案中，所述多糖纳米粒在溶液中可以具有下述平均直径:约 10 nm 至约 950 nm、约 10 nm 至约 700 nm、约 100 nm 至约 950 nm、约 100 nm 至约 500nm、约 100 nm 至约 400 nm、约 200 nm 至约 400 nm、约 250 nm 至约 350 nm、或约 300 nm 至
约400 nm。也涵盖其中没有包括术语“约”的这些不同的纳米粒尺寸范围。在一个实施方案中，所述多糖纳米粒可以具有约200纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述多糖纳米粒可以具有约250纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述多糖纳米粒可以具有约300纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述多糖纳米粒可以具有约320纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述多糖纳米粒可以具有约350纳米的平均直径。在一个实施方案中，所述多糖纳米粒可以具有约400纳米的平均直径。
[0190]在本文描述的 不同的实施方案中，所述多糖纳米粒可以用于治疗神经损伤。在本文描述的其它实施方案中，所述多糖纳米粒可以用于治疗脊髓损伤。在本文描述的其它实施方案中，所述多糖纳米粒可以用于治疗外伤性脑损伤。在本文描述的其它实施方案中，所述多糖纳米粒可以用于接触受损伤的神经。在本文描述的其它实施方案中，所述多糖纳米粒可以用于修复受损伤的神经。在本文描述的其它实施方案中，所述多糖纳米粒可以用作神经保护剂。
[0191]在本文描述的某些实施方案中，所述多糖纳米粒可以与患者中的药代动力学参数的改善相关联。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者对所述聚合纳米结构的吸收。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的分布。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的递送。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的消除。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中器官毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾损伤的减小。
[0192]在不同的实施方案中，提供了治疗患者的神经损伤的方法。在一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述疏水地修饰的纳米粒。在另一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述聚合纳米结构。在另一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述多糖纳米粒。前面描述的疏水地修饰的纳米粒、聚合纳米结构和多糖纳米粒的实施方案可适用于本文中描述的方法。[0193]在某些实施方案中，要通过所述方法治疗的神经损伤是脊髓损伤。在其它实施方案中，要通过所述方法治疗的神经损伤是外伤性脑损伤。在其它实施方案中，要通过所述方法治疗的神经损伤是受损伤的神经的修复。
[0194]在某些实施方案中，根据所述方法的施用在发生神经损伤的48小时内执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用在发生神经损伤的24小时内执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用在发生神经损伤的约I小时至约12小时之间执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用在发生神经损伤的12小时内执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用在发生神经损伤的8小时内执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用在发生神经损伤的6小时内执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用在发生神经损伤的4小时内执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用在发生神经损伤的2小时内执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用在发生神经损伤的1小时内执行。
[0195]在本文描述的某些实施方案中，所述方法可以与患者中的药代动力学参数的改善相关联。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者对所述聚合纳米结构的吸收。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的分布。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的递送。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的消除。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中器官毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾损伤的减小。
[0196]在不同的实施方案中，根据所述方法的施用是注射。在某些实施方案中，所述注射选自:关节内注射、静脉内注射、肌肉内注射、真皮内注射、腹膜内注射和皮下注射。在一个实施方案中，所述注射是静脉内注射。
[0197]在其它不同的实施方案中，根据所述方法的施用作为单次剂量施用来执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用作为多次剂量施用来执行。
[0198]在不同的实施方案中，提供了治疗患者的神经疾病的方法。在一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述疏水地修饰的纳米粒。在另一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述聚合纳米结构。在另一个示例性的实施方案中，所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的所述多糖纳米粒。前面描述的疏水地修饰的纳米粒、聚合纳米结构和多糖纳米粒的实施方案可适用于本文中描述的方法。
[0199]在某些实施方案中，要通过所述方法治疗的神经疾病是急性神经疾病。在其它实施方案中，要通过所述方法治疗的神经损伤是慢性神经疾病。
[0200]在本文描述的某些实施方案中，所述方法可以与患者中的药代动力学参数的改善相关联。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者对所述聚合纳米结构的吸收。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的分布。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的递送。在一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是所述聚合纳米结构在患者中的消除。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中器官毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾毒性的减小。在另一个实施方案中，所述改善的药代动力学参数是患者中肾损伤的减小。
[0201]在不同的实施方案中，根据所述方法的施用是注射。在某些实施方案中，所述注射选自:关节内注射、静脉内注射、肌肉内注射、真皮内注射、腹膜内注射和皮下注射。在一个实施方案中，所述注射是静脉内注射。
[0202]在其它不同的实施方案中，根据所述方法的施用作为单次剂量施用来执行。在其它实施方案中，根据所述方法的施用作为多次剂量施用来执行。
[0203]在不同的实施方案中，提供了药物制剂。在一个示例性的实施方案中，所述药物制剂包含所述疏水地修饰的纳米粒。在另一个示例性的实施方案中，所述药物制剂包含所述聚合纳米结构。在另一个示例性的实施方案中，所述药物制剂包含所述多糖纳米粒。
[0204]在某些实施方案中，本文描述的药物制剂进一步包含药学上可接受的载体。在某些实施方案中，本文描述的药物制剂进一步包含药学上可接受的稀释剂。可以选择在含有纳米粒或纳米结构的组合物中使用的稀释剂或载体成分，使得它们不会减少所述纳米粒或纳米结构的期望效果。合适剂型的例子包括纳米粒或纳米结构的水溶液，例如，在等渗盐水、5%葡萄糖或其它众所周知的药学上可接受的液体载体(诸如醇类、二醇类、酯类和酰胺类)中的溶液。
[0205]“载体”在本文中用于描述制剂中除了活性组分(一种或多种)以外的任何成分。药学上可接受的载体部分地取决于要施用的特定组合物以及用于施用所述组合物的特定方法(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1985 年第 17 版))。载体的选择在较大程度上取决于诸如下述因素:特定给药模式、载体对溶解度和稳定性的影响和剂型的性质。在一个示例性的方面，所述载体是液体载体。
[0206]本文中使用的术语“药学上可接受的”包括“兽医学上可接受的”，且因而独立地包括人和动物应用。例如，在本文中提及的“患者”可以是人患者或兽医学患者，诸如驯化的动物(例如，宠物)。
[0207]在某些实施方案中，本文描述的药物制剂任选地包括一种或多种其它治疗成分。本文中使用的术语“活性成分”或“治疗成分”表示治疗活性化合物、及其任何前药、以及所述化合物和所述前药的药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物。可以将其它活性成分与所述的纳米粒或纳米结构相组合，且可以单独施用或在同一药物制剂中施用。本领域技术人员基于使用描述的纳米粒或纳米结构的治疗，可以容易地确定要施用的其它活性成分的量。
[0208]在某些实施方案中，本文描述的药物制剂是单一单位剂量。本文中使用的术语“单位剂量”是包含预定量的所述的纳米粒或纳米结构的组合物的个别量。所述的纳米粒或纳米结构的量通常等于要施用给动物的所述纳米粒或纳米结构的剂量或这样的剂量的方便的分数(例如，这样的剂量的1/2或1/3)。
[0209]药学上可接受的盐和用于制备药学上可接受的盐的普通方法是本领域已知的，且被包括在本文描述的组合物的定义内。参见，例如，P.Stahl,等人，Handbook ofPharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, (VCHA/ffiley-VCH, 2002);S.M.Berge,等人,“Pharmaceutical Salts, ”Journal of Pharmaceutical Sciences,第66卷，第I期，1977年I月。
[0210]可以将本文描述的组合物和它们的盐配制为用于全身性施用的药物组合物。用于人类和非人哺乳动物的这样的药物组合物和制备它们的方法是本领域已知的。参见，例如，remington: The Science and practice of pharmacy, (1995) A.Gennaro,等人编，第19版，Mack Publishing C0.。在包含纳米粒或纳米结构的药物制剂中可以包括其它活性成分或其盐。
[0211 ] 在一个示例性的实施方案中，与疏水地修饰的纳米粒一起用于胃肠外施用的药物制剂包含:a)疏水地修饰的纳米粒；b)药学上可接受的pH缓冲剂，以提供在约pH 4.5至约pH 9范围内的pH ；c)离子强度调节剂，其在约O至约300毫摩尔的浓度范围内；和d)水溶性的粘度调节剂，其在总制剂重量的约0.25%到约10%的浓度范围内，或者提供了 a)、b)、c)和d)的任意组合。
[0212]在一个示例性的实施方案中，与聚合纳米结构一起用于胃肠外施用的药物制剂包含:a)聚合纳米结构；b)药学上可接受的pH缓冲剂，以提供在约pH 4.5至约pH 9范围内的pH;c)离子强度调节剂，其在约O至约300毫摩尔的浓度范围内；和d)水溶性的粘度调节剂，其在总制剂重量的约0.25%到约10%的浓度范围内，或者提供了 a)、b)、c)和d)的任意组合。
[0213]在一个示例性的实施方案中，与多糖纳米粒一起用于胃肠外施用的药物制剂包含:a)多糖纳米粒；b)药学上可接受的pH缓冲剂，以提供在约pH 4.5至约pH 9范围内的pH ；c)离子强度调节剂，其在约O至约300毫摩尔的浓度范围内；和d)水溶性的粘度调节剂，其在总制剂重量的约0.25%到约10%的浓度范围内，或者提供了 a)、b)、c)和d)的任意组合。
[0214]在不同的示例性的实施方案中，用于本文描述的组合物和方法中的pH缓冲剂是技术人员已知的那些试剂，且包括,例如，乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲齐?、以及盐酸、氢氧化钠、氧`化镁、磷酸一钾、碳酸氢盐、氨、碳酸、盐酸、柠檬酸钠、柠檬酸、乙酸、磷酸氢二钠、硼砂、硼酸、氢氧化钠、二乙基巴比妥酸和蛋白，以及各种生物学缓冲剂，例如，TAPS、N，N-二(羟乙基)甘氨酸、Tris、三(羟甲基)甲基甘氨酸、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲基胂酸盐或MES。
[0215]在另一个示例性的实施方案中，所述离子强度调节剂包括本领域中已知的那些试剂，例如，甘油、丙二醇、甘露醇、葡萄糖、右旋糖、山梨醇、氯化钠、氯化钾和其它电解质。
[0216]有用的粘度调节剂包括、但不限于:离子型和非离子型水溶性聚合物；交联的丙烯酸聚合物诸如“卡波姆”家族的聚合物，例如，可在Carbopol?商标下商业得到的羧基聚亚烷基(carboxypolyalkylenes);亲水聚合物诸如聚氧化乙烯、聚氧乙烯_聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维质聚合物和纤维质聚合物衍生物诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、和醚化的纤维素；树胶诸如黄蓍胶和黄原胶；海藻酸钠；明胶、透明质酸及其盐、壳聚糖、胶凝糖或它们的任意组合。通常，使用非酸性的粘度增强剂，诸如中性或碱性试剂，以便促进实现所述制剂的期望的pH。
[0217]在一个示例性的方面，可以将胃肠外制剂适当地配制为无菌的非水性溶液或干燥形式，所述干燥形式将与合适的媒介物(诸如无菌的无热原的水)结合使用。使用本领域技术人员众所周知的标准制药技术，可以容易地在无菌条件下(例如，通过低压冻干法)制备胃肠外制剂。[0218]通过常规低压冻干法，根据本发明的水性制剂可以用于生产冻干粉剂或粉剂。通过将冻干粉剂溶解于水或其它水溶液中，再次获得根据本发明的制剂。也被称作冷冻干燥的术语“低压冻干法”是用于呈递蛋白质的通常使用的技术，其用于从感兴趣的蛋白质制剂中除去水。低压冻干法是这样的方法:通过该方法，首先冷冻待干燥的物质，然后通过在真空环境中升华除去冰或冷冻溶剂。可在预低压冻干的制剂中包含赋形剂，以增强在冷冻干燥过程中的稳定性和/或改善低压冻干的产品在贮存后的稳定性。例如，参见Pikal，Μ.Biopharm.3(9)26-30 (1990)和 Arakawa 等人.Pharm.Res.8(3):285-291 (1991)。
[0219]在一个实施方案中，通过使用适当的制剂技术，诸如掺入溶解度增强剂，可以增加在胃肠外制剂的制备中使用的纳米粒或纳米结构的溶解度。
[0220]在不同的实施方案中，可以将用于胃肠外施用的制剂配制为立即释放和/或改良释放(modified release)。改良释放制剂包括延迟的、持续的、脉冲的、受控的、祀向的和程序化的释放制剂。因而，可以将纳米粒或纳米结构配制为固体、半固体或触变液体，用于作为植入贮库来施用，从而提供活性化合物的改良释放。
[0221]可以将所述制剂呈现在单位剂量或多次剂量密封容器(诸如安瓿和管形瓶)中。还可以将所述制剂呈现在注射器(诸如预装注射器)中。
[0222]在不同的实施方案中，所述纳米粒或纳米结构的剂量可以随患者状况和神经损伤或神经疾病的严重程度而显著变化。要施用给患者的有效量是基于体表面积、患者重量或质量、以及医师对患者状况的评估。
[0223]通过标准方法，例如通过在实验动物模型中或在临床试验中的人类中建立剂量-响应曲线，可以确定纳米粒或纳米结构的合适剂量。示例性地，纳米粒或纳米结构的合适剂量(在单次快速推注中施用或随时间施用)包括:约I pg/kg至约lOPg/kg、约I pg/kg 至约 lKg/kg、约 100 pg/kg 至约 500 ng/kg、约 I pg/kg 至约 I ng/kg、约 I pg/kg 至约500 pg/kg、约 100 pg/kg 至约 500 ng/kg、约 100 pg/kg 至约 100 ng/kg、约 I ng/kg 至约10 mg/kg、约 I ng/kg 至 I mg/kg、约 I ng/kg 至约 lKg/kg、约 I ng/kg 至约 500 ng/kg、约100 ng/kg 至约 500Pg/kg、约 100 ng/kg 至约 100Pg/kg、约 I μ g/kg 至约 500 μ g/kg、或约I μ g/kg至约100 μ g/kg。在这些实施方案中的每一个中,剂量/kg表示每千克患者或动物质量或体重的剂量。
[0224]实施例1
姜黄素会减轻神经元细胞损伤和有效地促进SCI大鼠的功能恢复体外研究表明，姜黄素可在H2O2诱导的PC12细胞损伤模型中有效地减轻细胞凋亡。在外伤性脊髓损伤(SCI)以后2小时，将加载姜黄素的、疏水地修饰的乙二醇壳聚糖(HGC)纳米粒施用给一组5只Long Evans大鼠。如Basso Beattie Bresnahan (BBB)运动分级评分增加至第14天的13.8平均值所证实的，所有大鼠表现出显著的功能恢复。在用盐水治疗的对照组中，在第14天的平均BBB评分为6.4 (参见图1)。
[0225]在一个单独实验中，HGC纳米粒具有12小时的血液半衰期时间(参见图2)。HGC纳米粒的增加的循环时间会确保载体和药物向损伤部位的递送。这些数据显示了鼓舞人心的证据:通过使用包封了姜黄素的两亲聚合物的自组装纳米结构，实现了延长的治疗时间窗。
[0226]实施例2聚合物纳米结构的制备和表征
延长胶束治疗的治疗时间窗的一种有效方式是，将抗炎剂包封进胶束的疏水芯中，从而将靶向原发性和继发性损伤。平行地，一项单独的研究证实，具有不同疏水链的mPEG-聚酯胶束会在复合动作电位的恢复中表现出不同的效率，这指示两亲性质在膜修复中的关键作用。因而，基于两种因素来设计胶束的疏水芯:抗炎剂的加载效率和膜修复效力。
[0227]大多数已经被应用于SCI治疗的抗炎药是类固醇和衍生物诸如糖皮质激素(glucocoticoid)、甲泼尼龙、琥拍酸钠和纳洛酮。但是，已经证实高剂量类固醇会增加SCI患者的伤口感染、肺炎、脓毒症和因呼吸系并发症而死亡的风险。非留体类抗炎药通常是酶特异性的或免疫选择性的，这需要选择性的酶和免疫途径的基础发现。
[0228]姜黄素(分离自作为传统的食品成分的姜黄QCurcuina Awga)的姜黄根)具有独特的性能。在药理学研究中，姜黄根表现出抗肿瘤、抗炎和抗传染活性，且具有低毒性。具体地，已经证实，姜黄素会抑制肿瘤坏死因子(TNF)，减量调节白介素(IL)-l、IL-6、IL-8和趋化因子，增加细胞内的谷胱甘肽的表达，抑制脂质过氧化作用，和通过它的结合铁的能力而起抗氧化剂作用。姜黄素已经被应用于疾病诸如阿尔茨海默氏病、帕金森病、癌症和其它疾病。姜黄素的临床应用面临的一个重大挑战是它的快速的全身消除。因而，需要向靶组织递送姜黄素的稳定载体。
[0229]使用透析方法制备不同分子量的mPEG-聚酯，并将姜黄素装载进胶束的疏水芯中。表征了姜黄素的加载效率和姜黄素-胶束复合物在血清中的稳定性。与嵌段共聚物的应用平行地，合成了具有被阿魏酸(FA)修饰的侧链的乙二醇壳聚糖。由于延长的血液停留半衰期，乙二醇壳聚糖纳米粒已经被广泛地用作抗癌药物的载体。因为FA是姜黄素水解的一种产物，预期所述修饰不仅会引入两亲性，而且会根据相似相溶定律增强姜黄素的加载效率。与mPEG-PDLLA相比，壳聚糖的胺基会帮助将所述聚合物附着于带负电荷的细胞膜，这会促进疏水侧链向脂质膜中的插入以及姜黄素的细胞摄取。
[0230]A.自组装的mPEG-聚酯胶束的制备和姜黄素的加载
通过开环聚合(Liggins等人(2002) Adv Drug Deliv Rev 54:191-202,通过引用并入本文)，合成T mPEG-PCL (聚ε -己内酯)、mPEG_PLGA (聚乳酸-乙醇酸)和mPEG-PLA (聚乳酸)。PLA、PCL、PLGA的分子量为4000，PEG的分子量为2000，与在初步研究中使用的mPEG-PDLLA的分子量相同。
[0231]为了试验随着亲水亲脂平衡值而变化的膜修复效率，通过D，L-丙交酯的开环聚合，合成了具有不同I3DLLA分子量(4000、8000、16000 Da)的mPEG (2000)-PDLLA共聚物。使用不同的D，L乳酸与甲氧基PEG进料比来制备具有不同的D，L乳酸聚合程度的mPEG-PDLLA共聚物。在所有情况下，通过膜透析来制备胶束。通过监测被捕集在胶束疏水芯中的芘的荧光行为，测量CMC (Schild等人(1991) Langmuir 7:665-671,通过引用并入本文)。通过动态光散射，确定胶束的直径。使用在IH NMR谱中的质子峰强度，测量疏水块的数量平均分子量，在运行于500 MHz的Varian Unity Inova 500NB谱仪(Palo Alto, CA)上记录所述IH NMR谱。
[0232]通过疏水相互作用，将姜黄素加载进mPEG-PDLLA胶束的芯中。将溶解在丙酮或二甲亚砜(DMSO)中的mPEG-PDLLA共聚物和姜黄素放入多孔透析管(Spectra/Pro)中，随后针对4 L蒸馏水在25°C透析超过24 h。改变聚合物与药物的进料比，以发现最大药物加载含量和最佳加载效率。将得到的溶液在-80°C冰柜中冷冻，并使用冷冻干燥器FD-5N(EYELA, Tokyo,日本)干燥。在施用当天，通过使用声处理将冻干粉末溶解在PBS溶液中，制备新鲜的加载姜黄素的胶束溶液。
[0233]B.加载姜黄素的胶束的表征 1.胶束大小和稳定性
胶束大小是与在血流中的溶解效率和活性相关的重要参数。通过透射电子显微术(TEM; Philips CM 10, 80kV)，测量处于干燥状态的颗粒的大小(Lee等人(2007)Biomacromolecules 8:202-208，通过引用并入本文)。通过动态光散射(DLS,与PD2000DLS检测器连接的PDLLS/Batch DLS仪器，Precision Detectors)，测量空胶束或加载姜黄素的胶束在水性条件中的大小。通过大小在水性水和血清中随着时间的变化，确定这些胶束的稳定性。通过ZetaPALS (Brookhaven Instruments),测量表明聚合物胶束的净电荷的ζ电位。[0234]2.药物加载量和效力
为了定量姜黄素在胶束载体中的增加的溶解度，测量了药物加载量和效力。将药物加载量定义为加载的药物与胶束的重量比。药物加载效率是掺入胶束中的药物相对于在胶束化中使用的药物的初始量的百分比。简而言之，将I mg冷冻干燥的加载姜黄素的胶束溶解在ImL DMSO中，使得胶束解离并释放出姜黄素。使用紫外光谱测定法(Spectra Max M5,Molecular Devices)通过分光光度计法在427 nm测量姜黄素的荧光。基于含有预定量的姜黄素的标准样品集合，计算药物加载量和加载效力。
[0235]3.药物释放
静脉内注射后，姜黄素被释放进血液中，其中亲脂组分(例如白蛋白)充当漏槽条件(sink condition)。为了测量姜黄素的释放动力学，将2 mg/ml加载姜黄素的胶束分散在勒紧的透析袋中，并置于装有40 mL PBS (pH 7.4，含有15%血清)的玻璃瓶中。在研究过程中，在维持于37°C的恒温水槽中摇动所述玻璃瓶。在预定的时间间隔采集大约1.0 mL释放介质，并补充相同体积的PBS/血清。通过分光光度计法在DMSO中测量释放的姜黄素的累积量，并使用姜黄素在DMSO中的标准曲线计算释放的姜黄素的浓度。可以一式三份地进行所有实验。
[0236]实施例3
HGC纳米粒的制各和表征 A.加载姜黄素的HGC纳米粒的制备
为了合成具有不同分子量和疏水性的疏水地修饰的乙二醇壳聚糖(HGC)纳米粒，使用酸性降解方法制备具有不同分子量(250、100和50 kDa)的乙二醇壳聚糖(GC)。然后，通过缀合阿魏酸(FA)，疏水地修饰GC，所述阿魏酸是姜黄素水解的一种产物(参见图3a)。通过控制FA与GC的缀合程度，可以调控疏水性。详细地讲，将50 mg GC (分子量为50、100或250 kDa)溶解在15 ml去离子水中，然后用甲醇(15 ml)稀释，并与FA (3.5、7.0和10.5mg,这对应于GC中10、20和30 mol%的伯胺)混合。通过加入比FA 1.5倍摩尔过量的EDC/NHS,开始FA中的羧基与GC中的胺基的缀合。将得到的溶液在室温轻轻涡旋24小时，针对过量的水/甲醇(1:4体积比)透析(分子截止值=12 kDa) 72小时，随后针对去离子水透析，并将产物低压冻干，得到HGC (参见图3b)。[0237]使用溶剂蒸发方法将姜黄素包封进HGC纳米粒中。将HGC和姜黄素都溶解在由水和甲醇(1:1体积比)制成的共溶剂中。随着甲醇的蒸发，水溶液中的HGC会疏水地自组装进由亲水壳和疏水芯组成的纳米粒中(参见图3c)。详细地讲，将HGC (5 mg)溶解在去离子水(2.5 ml)中，并与在甲醇(2.5 ml)中的姜黄素溶液(1.25 mg, 20重量％)混合。使用旋转蒸发器，除去混合物溶液中的甲醇。初步数据表明，FA-缀合的乙二醇壳聚糖有效地增加姜黄素在PBS溶液中的溶解度(参见图3d)。对于包封在HGC纳米粒中的姜黄素而言，在I个月内没有观察到沉淀。
[0238]B.加载姜黄素的HGC纳米粒的表征
通过凝胶渗透色谱法(GPC)，测量酸降解的GC的分子量。通过胶体滴定(Kwon等人(2003) Langmuir 19:10188-10193，通过引用并入本文)和 FA 在 DMSO 中在 250-350 nm的紫外吸光度，确定FA与GC的缀合程度。使用与前述相同的方法，检验姜黄素在HGC中的加载量和加载效力。使用前述的方法，进行加载姜黄素的HGC纳米粒的生理化学性能的测量和姜黄素释放试验。另外，使用X-射线衍射来确定在纳米粒内的姜黄素的结晶程度。
[0239]制备了两类两亲聚合物:不同分子量的PEG-聚酯和FA-修饰的乙二醇壳聚糖。将表现出不同疏水性且能够加载姜黄素的聚合纳米结构的集合准备好用于细胞试验、离体试验和体内试验。在下述部分中，将使用“聚合纳米结构”表示PEG-聚酯胶束和/或FA-修饰的HGC纳米粒。除了 DLS测量以外，使用F0rster共振能量转移(FRET)光谱法来监测胶束在血清中的稳定性。如以前所述，将FRET对DiIC18(3)和DiOC18(3)加载进胶束中(Chen等人(2008) Proc Natl AcacI Sci USA 105:6596-6601，通过引用并入本文)。通过监测 FRET效率，实时监测芯加载的探针向周围介质中的释放。
[0240]实施例4
使用光声膜穿孔模型确定聚合纳米结构的细胞挽救效率` 筛选在实施例2和3中制备的胶束和HGC纳米粒，以鉴别能够在延长的时间窗中挽救受损伤细胞的纳米结构，和更好地理解疏水性如何影响聚合物-膜相互作用。使用光声膜穿孔模型来模仿外伤性细胞损伤。通过将细胞对不同分子量的荧光标记的葡聚糖的摄取成像，定量膜密封效率。通过细胞凋亡和坏死测定、以及炎症标志物，测定细胞。
[0241]A.光声膜穿孔模型
已经建立了涉及祀向细胞表面的金纳米棒(gold nanorods)的飞秒(fs)激光福照的膜穿孔模型(Tong等人(2007) Adv Mater 19:3136-3141，通过引用并入本文)。在该模型中，用带正电荷的肽(八精氨酸，R8)缀合纳米棒表面，用于将所述纳米棒连接至带负电荷的细胞表面。因为尺寸效应，即，这些纳米棒的流体动力学直径是约100 nm，所述纳米棒在进入细胞之前在细胞表面上停留至少I小时。纳米棒的激光辐照会通过等离子体吸收和光能向纳米棒中的声子能的弛豫而产生光热效应。纳米棒的热膨胀会产生损害细胞膜的完整性的爆炸声波(或机械波)。质膜的穿孔会导致Ca2+向细胞中的流入和随后钙蛋白酶的活化，所述钙蛋白酶会降解细胞骨架和造成质膜的起泡。可以用碘化丙啶(一种坏死标志物)标记受损伤的细胞(参见图4)。该方法高度模仿外伤损伤以后的神经元细胞膜的损伤。在没有激光辐照下，我们以前已经证实，R8-缀合的纳米棒(R8-NR)没有对细胞造成毒性。
[0242]为了使用该模型筛选膜修复剂，在胶原包被的96-孔板中生长PC12细胞(关于模仿神经元细胞)，并与R8-NR (0.D.1, 10μ1) —起温育I小时。在激光辐照之前，通过双光子发光(TPL)成像，证实R8-NR在细胞表面上的结合。在用PBS洗涤以后，使用具有130 fs脉冲宽度和80 MHz重复率的fs T1:蓝宝石激光器(MaiTai HP, Spectra-Physics)，通过激光辐照诱导膜穿孔。将激光器调至R8-NR的等离子体共振峰的波长。通过定量具有不同分子量(例如4 KDaUO KDa,70 KDa)的葡聚糖-FITC的细胞摄取，试验孔在质膜上的形成和孔径。在辐照之前，加入葡聚糖-FITC。对于每种类型的葡聚糖-FITC，优化辐照条件(激光能量、福照时间)以诱导至少80%的细胞为可透过的。在Weldon School of BiomedicalEngineering中，使用Olympus FV1000共焦显微镜观察细胞。
[0243]B.试验方法
1.细胞生存力
使用标准的细胞凋亡试剂盒(Invitrogen)确定细胞死亡，所述试剂盒包括AlexaFluor 680膜联蛋白V (用于指示早期细胞凋亡)和碘化丙啶(用于标记坏死)。如以前所述，在处理后，将共5PL Alexa Fluor 680膜联蛋白V和WL碘化丙啶(lOOPg/mL)加给细胞或者不经处理作为对照(Tong等人(2009) Nanomedicine 4:265-276,通过引用并入本文)。还独立地进行MTT测定以定量细胞死亡。在激光辐照和处理以后，将IOPL MTT溶液(5 mg/mL，在PBS中)加入96孔板的每个孔中，并在37°C温育3小时。除去培养基以后，将200KL DMSO加入每个孔中，并使用分光光度计(SpectraMAX 190, Molecular DevicesCorp., CA)在570 nm读出光密度。在光声穿孔后24小时，评估细胞生存力。
[0244]2.细胞膜完整性
通过加入葡聚糖-罗丹明(在辐照前)和葡聚糖-cy5.5 (在辐照后的不同时间点)，试验细胞质膜的密封。一旦细胞膜被修复，葡聚糖_cy5.5的摄取被停止。通过(Nrho阳性-Ncy5.5阳性)/Nrho阳性,计算细胞挽救的百分比,其中N是被罗丹明或cy5.5标记的细胞的数目。用共焦显微镜拍摄图像，并通过ImageJ软件计数细胞的数目。
[0245]3.细胞内炎症
使用细胞内活性氧簇(ROS)作为炎症的标志物。处理后24小时，将羧基-H2DCFDA(Invitrogen)( 一种ROS指示剂)加给细胞，并温育30分钟。用共焦显微镜拍摄图像。对比处理组和对照组之间的强度，以表征ROS的量。
[0246]4.实验设计
为了确定细胞挽救效率，将PC12细胞分成4组:组I含有没有经过光声穿孔的细胞，组2含有在光声穿孔以后用加载姜黄素的聚合纳米结构处理过的细胞，组3含有在光声穿孔以后用不含姜黄素的聚合纳米结构处理过的细胞，组4含有仅经过光声穿孔处理的细胞。为了检验聚合纳米结构在穿孔和施用之间的不同延迟时间时的有效性，分别在组2和组3中在光声穿孔后15分钟、I小时、2小时和6小时，将纳米结构加入细胞培养溶液中。使用双因素方差分析(Two-way ANOVA)试验来统计对比不同处理的效率。
[0247]鉴别出有效的纳米 结构，并进一步检验剂量响应，以提供用于离体和体内研究的给药方案的参考。如以前的研究所示(Shi等人(2010))，当施用给脊髓组织时，低至3.3μΜ的mPEG-PDLLA共聚物是有效的，因此，在光声穿孔以后，将具有0.33μΜ、3.3μΜ、33μΜ和330μΜ的单聚体(unimer)浓度的聚合纳米结构应用于在96-孔板中培养的细胞。
[0248]在本文中认为膜密封取决于所述聚合物的两亲性质。可以鉴别出许多能够密封受损伤的膜并且还经由加载的姜黄素而抑制细胞内炎症的聚合纳米结构。最佳纳米结构应当具有良好的细胞挽救效力，具有至少2小时的延迟时间。因为电荷和大小都会影响分子在组织环境中的扩散，将在实施例5中试验具有不同大小和电荷性能的、在细胞水平有效的纳米结构。
[0249]膜穿孔的一种替代方法是使用可在Purdue University Bindley BioscienceCenter得到的、激光实现的分析和加工(LEAP)仪器。
[0250]实施例5
用纳米级修复剂处理过的离体脊髓的功能和形态应答的确定在实施例4中的细胞研究提供了快速筛选大量候选纳米结构的方法。在本实施例中确定了对这些纳米结构的组织水平功能和形态应答。脊髓组织是更紧凑的，且与细胞培养条件相比可能不会被聚合纳米结构容易地达到。功能测量会为进一步的体内研究提供重要的选择标准。作为例子，将分离自成年豚鼠的脊髓压伤，用在实施例4中选择的、加载了姜黄素的候选纳米结构处理，并通过电生理学测量和形态学研究进行评估。
[0251]A.用双蔗糖间隙记录室记录CAP
按照在(Wang等人(2005) Biophys J 89:581-591,通过引用并入本文)中描述的操作，进行脊髓白质的分离。
[0252]使用双蔗糖间隙记录室，记录CAP (参见图5)。将分离的豚鼠脊髓白质的4.0 cm长条支持在中央隔室中，并连续灌注在37°C维持在水浴中的充氧的Krebs氏溶液(约2.0ml/min)。使脊髓条的游离端穿过蔗糖间隙通道至装有等渗(120 mM)氯化钾的侧隔室。使用塑料盖玻片碎片和少量硅脂(用于将所述盖玻片附着于通道壁并在组织周围密封)，将所述白质条密封在蔗糖间隙通道的任一侧上。使等渗蔗糖溶液(230 mM)以1.0 ml/min的速率连续跑过间隙通道。通过位于侧室 和中央浴槽内的银/氯化银丝电极，在白质条的相对末端处刺激轴突，并记录CAP。调节刺激(呈0.1 ms持续时间的双极矩形脉冲的形式)至最小振幅，其会产生每种样品的完全动作电位。
[0253]B.压伤和处理
通过将脊髓不断置于5-30秒挤压而产生压伤，使用改进的镊子处理隔离物，直到CAP下降至O mV (Luo等人(2002) J Neurochem 83:471-480,通过引用并入本文)。对于胶束的局部施用，在损伤以后，立即将脊髓白质条保持于以2.0 ml/min的速度灌注的Krebs氏溶液中。然后停止灌注，并在压伤后15分钟、I小时、2小时和4小时，以通过实施例4确定的期望浓度，将聚合纳米结构轻轻加入中央隔室内的Krebs氏溶液中。在处理10分钟以后，用Krebs氏溶液彻底冲洗脊髓条。贯穿整个实验，所有溶液都富含95% 02/5% C02。
[0254]C.用于监测Ca2+向轴突中的进入的多模态NLO成像
已经开发了多模态NLO显微镜，其在同一个平台上组合了 CARS和TPEF (Chen等人(2009) Opt Express 17:1282-1290,通过引用并入本文)。使用髓鞘的CARS成像来定义轴突内空间。为了监测钙向轴突中的进入，将脊髓样品在不含Ca2+的Krebs氏溶液中预温育 30 min,随后在含有 40 μ M Oregon Green 488 BAPTA-2 AM (Sigma)的不含 Ca2+ 的Krebs氏溶液中温育2小时。此后，将健康脊髓对照组在含有Ca2+的正常的充氧的Krebs氏溶液中温育I小时；对损伤脊髓的对照组进行挤压，然后在含有Ca2+的正常的充氧的Krebs氏溶液中温育I小时；对纳米结构治疗组进行挤压，然后以在Aim 2中鉴别出的浓度，在补充了聚合纳米结构的充氧的Krebs氏溶液中温育I小时。通过2个520/40带通过滤器(Ealing Catalog Inc.),传送Oregon Green的TPEF信号，并通过外部光电倍增管(H7422-40, Hamamatsu)进行检测。使用 FluoView 软件(Olympus,日本东京)合并 TPEF和CARS图像，并定量轴突内的TPEF强度。
[0255]D.抗炎应答的测量
通过匀浆化的脊髓组织中的IL-1和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3水平的蛋白质印迹法，试验了姜黄素的抗炎作用。通过测量脂质过氧化作用的程度和受损伤组织内的谷胱甘肽的含量，确定了姜黄素在减少氧化应激中的作用。
[0256] E.实验设计
使用得自成年雌性豚鼠(350-500 g体重)的脊髓腹侧白质。将脊髓分成3组，分别用加载姜黄素的mPEG-聚酯胶束、加载姜黄素的HGC和盐水处理。试验了 mPEG-聚酯胶束和HGC0在SCI后15分钟、I小时、2小时和4小时，施用胶束和HGC。这些时间点会产生每种纳米结构的时间依赖性的曲线。对于CAP测量而言，使用10条各自具有4.5 cm长度的脊髓来试验每种施用。将Ι-cm区段的脊髓用于成像实验和抗炎应答的测量(η = 5/试验)。
[0257]还可以使用3种具有不同分子量的分子测定质膜损伤:溴化乙锭(ΕΒ， 400Da)，辣根过氧化物酶(HRP，MW 44kDa，VI型)和乳酸脱氢酶(LDH，MW 140kDa)。将EB和HRP加入溶液中，并监测EB和HRP通过脊髓组织的膜裂口的摄取。定量EB阳性细胞和HRP标记的轴突的数目。LDH通常被限制在细胞内，因为它不能穿过完整膜。因此，该酶向细胞外空间的渗漏会指示膜破裂。为了检测LDH释放，在每次处理结束时收集浸泡脊髓组织的溶液。快速地将脊髓组织匀浆化，并通过乳酸脱氢酶试验试剂盒(Sigma，MO)评估残余的组织LDH。
[0258]实施例5在组织水平确定了所述聚合纳米结构的膜密封效应和抗炎效应。最佳纳米结构或纳米粒应具有良好的促进CAP恢复的效力，具有至少2小时的延迟时间，且可以用于实施例6中。
[0259]实施例6
使用挫伤SCI模型确定由加载姜黄素的共聚物胶束和HGC纳米粒介导的解剖学恢复和功能恢复
先前的研究表明了 mPEG-PDLLA胶束在比PEG低IO5量级的浓度在恢复受损伤的脊髓白质组织的CAP中的有效性。此外，已经证实，静脉内施用的mPEG-PDLLA胶束能够显著改善挤压脊髓损伤的Long-Evans大鼠模型的运动功能(参见图1)。
[0260]为了确定由mPEG-聚酯纳米结构和/或HGC纳米粒介导的SCI后的解剖学恢复和功能恢复，可以在临床上有关的成年大鼠挫伤损伤模型中通过尾静脉施用聚合纳米结构，并可以通过使用生理学、行为学和形态学评估的组合来检验所述结果。在图6中解释了体内研究的流程图，下面详述了方法。
[0261]A.体内脊髓损伤模型
计算机控制的撞击挫伤被SCI研究团体广泛地使用。简而言之，使用多中心动物脊髓损伤研究(Multicenter Animal Spinal Cord Injury Study,MASCIS)脊髓撞击器,通过 10g棒从12.5 mm高度的落重法，可以诱导中等挫伤损伤。详细的操作描述于(Cao等人(2005)Experimental Neurology 191: S3-S16 ;和 Titsworth 等人(2009) Glia 57:1521-1537, 二者通过引用并入本文)。[0262]B.生物利用度测定
通过尾静脉或颈静脉注射，可以递送聚合纳米结构或HGC纳米粒。认为加载姜黄素的纳米结构或纳米粒会穿透损伤的血液-脊髓屏障(BSCB)和以高浓度积累在损伤部位处。为了促进穿透，如果必要的话，可以鞘内地或通过直接注射进脊髓实质中来递送纳米结构或纳米粒。
[0263]自发荧光姜黄素和cy5.5标记的共聚物可以用于生物利用度研究。可以在注射纳米结构以后24小时，提取包括脊髓在内的器官，并在具有50 μ m空间分辨率的CaliperIVIS Lumina II上进行检查。使用共焦显微镜，可以观察载体和姜黄素在细胞水平的生物分布。
[0264]对于生物利用度测定，还可以使用同位素标记的姜黄素作为外标，使用质谱法来确定姜黄素(MW 368)在每个提取的器官中的浓度。
[0265]C.行为试验
丧失的运动功能的有效恢复可以是本实施例在实验性的SCI中的主要目的。可以进行下述试验以评估SCI结果的不同方面。
[0266]D.运动评分
普及的和标准化的运动评级量表是在MASCIS中使用的BBB运动评级量表(Basso等人(1995) Journal of Neurotrauma 12:1-21)。使用标准的BBB范例，首先将动物预训练以移动进开放场中，所述开放场由直径为大约90 cm的、壁高7-10 cm的塑料池组成。2位独立的检查人员研究每个试验受试者的运动能力大约4分钟，然后使用21-点量表对受试者运动评级。在SCI和聚合纳米结构处理以后，随后可以在早至处理后I天开始试验动物，每周重复试验,例行地延长至处理后 8周。
[0267]E.TreadScan 步态分析
TreadScan系统会测量被迫运动，其满足了对动物的步态分析的需求。步态分析会实现在SCI中发生的许多病理生理状况的高度灵敏的、非侵袭性的检测和评价。TreadScan系统会使用高速数字照相机拍摄在透明的带式跑台上跑动的动物的视频。TreadScan系统可以可靠地分析视频，并确定各种特征参数，包括站姿时间、摇摆时间、总行进时间、步长、脚接触面积大小、身体-脚间隔距离、脚间隔距离、跑动速度、步频、脚偶合量度(foot coup lingmeasures)和坐骨神经功能指数有关的量度(诸如脚印相对于身体的放置旋转角和足印宽度)。TreadScan会将这些参数的详细结果输入Microsoft Excel文件中，并给出统计结果以满足研究需求。
[0268]F.通过电生理学监测神经元活性
可以使用躯体感觉诱发电位(SSEP) (Kearse等人(1993) Journal of ClinicalAnesthesia 5:392-398; Hurlbert 等人(1993) J Neurotrauma 10:181-200, 二者通过引用并入本文)来评价通过SCI的电生理学传导的损失和恢复。可以在椎板切除术之前在挤压后立即进行电生理学测量，并在恢复期中每周进行。SSEP代表穿过上升长段感觉柱的多突触传入传导，且可以通过挤压刺激位点和记录位点之间的脊髓而立即消除。产生神经冲动的上升冲击的后肢胫神经刺激可以记录在脑的对侧感觉皮层处。每个完整的电记录可以包含200个刺激的单独串(〈2 mA方波，200 μ s持续时间:在3 Hz)，所述刺激由来自放置在头盖骨上的真皮下针式电极的Neuropak 8刺激器/记录器(Nihon Kohden Inc.,日本东京)提供(由胫神经的两侧同时刺激诱发)。
[0269]G.形态学评估
使用组织学的形态学评估可以提供轴突、蛋白和神经胶质细胞活性的形态学改变和恢复的可见证据，这有助于深入研究SCI发病机制和修复机制。使用免疫组织化学，可以研究星形胶质细胞和免疫细胞的活性。这些测定的细节描述于初步研究(Shi等人(2010))中。另外，可以进行髓磷脂损失和轴突内血影蛋白破坏的形态学试验，以独立地评价恢复。通过受损伤的组织中的IL-1和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的蛋白质印迹法，可以检验姜黄素的抗炎效应。
[0270]H.毒性评估
为了检验纳米结构或纳米粒的安全性，可以在施用之前和之后测量血压和心电图，随后每隔日监测动物体重。对于完全血细胞计数(CBC)，可以在施用后每4周从颈静脉收集Iml血液。在运动功能恢复研究结束时，可以进行全部肉眼能看到的尸体剖检。可以记录肝、脾和肾、以及任何显著改变大小的器官的重量。在10%中性缓冲福尔马林中固定组织，常规地加工进石蜡中，并可以用苏木精和曙红将5- ym切片染色。可以由不知情的大鼠兽医病理学家通过光学显微术检查肝、脾、肾、心脏、肺、胰腺、膀胱、脑和脊髓。可以在损伤后第一周的每天和此后每周I次地收集尿样品，用于分析pH、葡萄糖、蛋白。
[0271]1.实验设计
可以使用Long-Evans大鼠来检验在损伤后的不同延迟时间静脉内地注射的纳米结构或纳米粒的有效性。可以使用共计7组大鼠来覆盖3个延迟时间(2、8和24小时)和I个对照(在2小时的盐水注射) 。这些时间点可以基于原发性损伤的时程进行选择。可以使用在组织-水平研究过程中鉴别为有效的剂量。为了监测运动功能恢复，可以由2位对治疗不知情的独立观察人员记录BBB评分(n=15/组)。对于生物利用度测定，可以在3个延迟时间(2、8和24小时)施用Cy5.5-标记的纳米结构或纳米粒(n=5/组)。可以评估用于治疗的剂量的聚合纳米结构的急性和慢性毒性(n=10/组)。对于免疫分析，可以在治疗后2周处死动物(n=5/组)。对于IL-1和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的蛋白质印迹测定，可以在治疗后7天处死动物(n=5/组)。
[0272]本实施例可以鉴别当在SCI后数小时施用时有效地恢复SCI大鼠的纳米结构或纳米粒。可以建立剂量响应曲线，以确定纳米结构或纳米粒的最佳浓度。所述剂量可以用于随后的治疗时间窗的确定，这对于治疗效力的临床前试验而言是重要的。
[0273]实施例7
FA-GC/姜黄素纳米粒的合成和表征 A.方法
据信，疏水地修饰的乙二醇壳聚糖(HGC)纳米粒的药代动力学取决于所述聚合物的疏水性。试验了 3种不同的阿魏酸(FA)与乙二醇壳聚糖(GC)的摩尔比(即，45、90和180)。在所有情况下，在10 mMHEPES缓冲液(pH 7.2) /DMSO共溶剂中，在有EDAC和NHS存在下，将FA与GC偶联。将得到的溶液在室温搅拌I天，针对过量的水/甲醇(lv:4v)透析(分子截止值=12 kDa) 3天，随后针对蒸馏水透析，并将产品低压冻干，以得到FA-GC缀合物。通过FA在DMSO中在316 nm的紫外吸光度，确定取代度，其被定义为每I个乙二醇壳聚糖链的FA的数目。得到了具有3种不同取代度(每个GC链5、11和21个FA)的FA-GC缀合物。
[0274]姜黄素加载是基于姜黄素与FA的疏水相互作用。通过溶剂蒸发方法，将姜黄素包封进FA-GC纳米粒中。简而言之，将FA-GC缀合物和姜黄素(20重量％)溶解在由水和甲醇(1:1体积比)制成的共溶剂中。在真空下在55°C蒸发甲醇以后，水溶液中的FA-GC自组装成纳米粒。
[0275]通过姜黄素在DMSO中在430 nm的紫外吸光度，确定姜黄素在所述纳米粒中的加载含量。在更高的FA取代度，证实了更大的姜黄素加载效率(参见表1)。
[0276]表1.随着FA取代度而变化的姜黄素加载效率..—11............................................................................................................................................................................................................................................4.34
GC-FA (IIS=S)14.26
GC-FA(DS=Il)15.54
C€-FA(i>S=2UΠ.?,?
DS:取代度，由每个GC链的FA单元的数目指示 。
[0277]对于具有取代度(DS) = 21的FA-GC纳米粒，加载的姜黄素在PBS中温育I天以后沉淀(参见图7)。相比而言，具有DS = 11的FA-GC能够稳定地包封姜黄素。
[0278]为了将Cy5.5标记至FA-GC聚合物，将I重量％的Cy5.5的羟基琥珀酰亚胺酯溶解在DMSO中，并与FA-GC溶液混合。使该反应在室温在暗处进行6小时。通过针对蒸馏水透析(分子量=12 kDa)，历时2天的时段除去副产物和未反应的Cy5.5分子，并将得到的产物低压冻干。如通过在DMSO中在690 nm的吸光度所确定的，在FA-GC中的Cy5.5的量被证实为0.7重量％。使用与上述相同的方法，将姜黄素加载至FA-GC (_Cy5.5)。
[0279]对于生物分布试验，将纳米粒施用给脊髓挫伤以后的Long-Evans大鼠。在注射后I小时，收获包括受损伤的脊髓的组织样本，并均质化。将华法林(0.5 ppm)加入得到的溶液以后，用丙酮提取所述组织中的姜黄素。为了定量组织中的姜黄素的浓度，进行纸喷雾MS0
[0280]使用探针型超声波仪，通过声处理，在PBS缓冲液(pH 7.4)中形成加载姜黄素的FA-GC 纳米粒。使用动态光散射(DLS, 90Plus, Brookhaven Instruments C0., NY)在633 nm和25°C确定纳米粒尺寸和多分散性(μ 2/ 2)。使用透射电子显微术(TEM，CM 200电子显微镜，Philips)，观察蒸馏水(I mg/ml)中的纳米粒的形态学。使用ζ电位分析仪(ZetaPlus, Brookhaven Instruments C0., NY),确定蒸懼水中的表面电荷。
[0281]用配有氩(488 nm)和HeNe (633 nm)激光器和60X/L 2 NA水物镜的FVlOOO共焦系统(Olympus, Tokyo,日本)，得到共焦突光图像。分别用488 nm和633 mm激发获得姜黄素和FA-GC (_Cy5.5)图像。
[0282]对于稳定性试验，将姜黄素和纳米粒分散在PBS (pH 7.4)中，并在室温温育。监测溶液I个月。
[0283]B.结果
用阿魏酸(FA)化学缀合乙二醇壳聚糖(GC，250 kDa)，以使姜黄素加载效率最大化，所述阿魏酸是姜黄素水解的一种产物(参见图8(a))。通过优化FA缀合度，实现了15.54重量％姜黄素的包封效率(参见表1)。通过透射电子显微术(TEM)和动态光散射(DLS)，确定加载姜黄素的GC-FA纳米粒的平均直径(参见图8(b))为320 nm (参见图8(c))。多分散性值(0.207)指示纳米粒的狭窄尺寸分布。测量ζ电位为19.5 mV，这指示纳米粒的带正电荷的表面。得自姜黄素(参见图8(d)，左，绿色)和Cy5.5-标记的FA-GC(参见图8(d)，右，红色)的荧光信号的共同局部化证实了姜黄素向纳米粒中的包封。在I个月中没有观察到存在于FA-GC中的姜黄素的沉淀(参见图8(e)和图7)。
[0284]实施例8
FA-GC/姜黄素的药代动力学和生物分布 A.方法
在挫伤损伤后2小时，通过大鼠的颈静脉(n=3)，静脉内地注射包含姜黄素(5 mg/1ml，在盐水中)或姜黄素(0.77 mg/1 ml，在含有0.l(v/v)%吐温20的盐水中)的Cy5.5-标记的FA-GC纳米粒。在确定的时间，从颈静脉抽取血液样品(100 μ I)。将所述血液(50μ I)与5 μ I Κ3 EDTA (作为抗凝剂)和华法林(20 ng/4 μ I, 0.5 ppm，作为质谱法分析的内标)一起混合。为了提取姜黄素，将丙酮(150 μ I)加入该溶液中，并涡旋10分钟。将得到的溶液离心(rpm 5000, 10 min)，并在质谱法分析之前在_20°C储存上清液。为了得到用于定量分析的校正曲线，制备了不同浓度(0-50 ppm)的在大鼠血液中的姜黄素，然后通过上述相同方法提取姜黄素。
[0285]对于姜黄素的生物分布试验，在脊髓挫伤以后2小时，将具有药代动力学研究的相同剂量的纳米粒或姜黄素/吐温20施用给Long-Evans大鼠(n=3)。在注射后I小时,收获包括受损伤的脊髓的组织样本，并使用磨床将所述组织匀浆化。向组织溶液(50 μ I)中加入华法林(20 ng/4 μ I, 0.5 ppm)以后,通过加入丙酮(150 μ?)来提取姜黄素。
[0286]为了确定姜黄素的药代动力学和生物分布，采用了纸喷雾质谱法。使用TSQQuantum、LTQ离子讲和ExactiveOrbitrap质谱仪,进行纸喷雾质谱法分析。
[0287]使用抗凝血剂华法林，在确定的时间点收集血液样品。加入华法林(0.5 ppm)以后，通过与丙酮一起混合以解离姜黄素-白蛋白复合物，提取血液中的姜黄素。将得到的溶液加载在色谱用纸上。向血液斑点滴加10μ1甲醇以后，通过施加DC电压来顺序地离子化血液中的组分。
[0288]通过基于荧光的分析，确定FA-GC的药代动力学和生物分布。将在姜黄素的药代动力学研究中收集的血液样品(50 μ I)的一半用于检测大鼠(η=3)的血液中的Cy5.5。在损伤后2小时，将作为对照组的GC(-Cy5.5) (5 mg/1 ml，在盐水中)静脉内地施用给大鼠(n=3)，然后通过上述的相同方法抽取血液。在给大鼠注射加载姜黄素的FA-GC(_Cy5.5)后I天，通过经穿心灌注盐水，处死大鼠，然后收获组织。通过在675 nm激发和在695 nm发射的突光光谱仪(SpectraMax M5, Molecular Devices, CA)以及在640 nm激发和在695-770nm发射的IVIS Lumina (Caliper Life Sciences, Inc., MA)，测量和观察血液和组织样品中标记至FA-GC聚合物上的Cy5.5的突光强度。使用Living Imaging Software (CaliperLife Sciences, Inc., MA),进行FA-GC聚合物的生物分布的定量分析。
[0289]B.结果
在注射Cy5.5-标记的FA-GC纳米粒以后， 通过它们在质谱图中的离子化片段(对于姜黄素，m/z=149 ;对于华法林，m/z=161)(参见图9)，检测姜黄素和华法林。使用从姜黄素和华法林的质量强度之间的比例衍生出的校正曲线(参见图10(a)，插图)，得到姜黄素的浓度。为了确定我们的制剂是否会延长姜黄素的血液保留时间，我们对比了 GC-FA组和对照组之间的姜黄素的血浆浓度，在所述对照组中，使用吐温20表面活性剂作为姜黄素的增溶剂。使用一室模型，分别测得吐温20组和FA-GC组的血液中的姜黄素的半衰期为6分钟和36分钟。
[0290]还通过质谱法研究了姜黄素的生物分布。经确定，FA-GC纳米粒中的姜黄素主要通过肾消除(参见图11)。重要的是，FA-GC组证实，受损伤的脊髓中的姜黄素浓度是正常脊髓的6.6倍(参见图10 (b))。相比而言，在吐温20组的正常脊髓和受损伤的脊髓之间没有发现差异(参见图10(b))。
[0291]在GC聚合物的血液保留时间的确定中，通过一室模型确定，FA-GC表现出长血液保留时间，具有20小时的半衰期(参见图10(c))。与此相比，未修饰的GC表现出6小时的半衰期(参见图12)。
[0292]对于生物分布评估，在注射后I天收获主要器官，并通过IVIS仪器定量Cy5.5荧光的量。除了肾以外，在受损伤的脊髓处的荧光强度显著高于其它器官(参见图13)。此外，仅在脊髓的损伤部位处观察到强信号(参见图10(d))。这些数据共同地证实，用FA对GC的疏水修饰允许延长所述聚合物的循环和增加聚合物和姜黄素向损伤部位的递送。
[0293]进一步使用多模态非线性光学显微镜在单细胞水平确定FA-GC的分布，所述显微镜允许膜的受激拉曼散射(SRS)成像(绿色)和Cy5.5-标记的FA-GC的双光子激发荧光(TPEF)成像(红色)。在受损伤的白质和受损伤的灰质中发现了所述聚合物。重要的是，在非常易受挫伤损伤影响的灰质内发现了强荧光信号，其由腔的形成来指示(参见图14(a))。灰质的闻放大率SRS图像显不出红细胞的凝块(参见图14 (d),白色箭头)。如白质中的髓鞘表现出高度卷曲(参见图14(e))，而后白质中和中央管附近的髓鞘表现出不规则的形态学(参见图14(b)和14(c))。这些结果一起提示FA-GC纳米粒对受损伤的脊髓的革巴向。
[0294]实施例9
体外模型
使用PC12细胞作为神经元细胞的简单模型来评价所述纳米粒的神经保护作用(如前面在图15中所示，在与GC-FA纳米粒一起温育4小时以后，姜黄素进入细胞中，且GC-FA靶向细胞膜)。在本实施例中，将PC12细胞与加载姜黄素的GC(-Cy5.5)-FA纳米粒一起温育4小时。此后，通过共焦成像(参见图16(a))，证实GC-FA的细胞膜附着和姜黄素的细胞内化。
[0295]因为氧化应激和谷氨酸兴奋性中毒是脊髓损伤以后的2种主要的不同的病理[X]，使用过氧化氢(H2O2)和谷氨酸损伤的PC12细胞进一步评估了所述纳米粒的神经保护作用。在与FA-GC/姜黄素、FA-GC或姜黄素一起温育细胞4小时以后，通过钙黄绿素和碘化丙啶(PI)双重染色来测量细胞生存力。
[0296]使用0.2 mg/ml GC-FA/姜黄素的处理会显著减小PI染色的细胞的数目(参见图16 (b))。GC-FA/姜黄素处理使存活率从20%增加至95%，而单独的GC-FA帮助挽救了 55%的细胞(参见图16 (c))。在谷氨酸损伤模型中，所有3种处理显著地保护了 PC12细胞(参见图16(d))。这些结果一起提示，所述纳米粒可有效地保护PC12细胞免于H2O2和谷氨酸损伤。[0297]实施例10
体内脊髓损伤模型和FA-GC/姜黄素施用
A.方法
本实施例的所有方案都得到Purdue动物管理和使用委员会(Purdue Animal Care andUse Committee)的批准。使用90 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪,麻醉成年Long-Evans大鼠。进行TlO椎板切除术，以暴露下面的胸部脊髓段(一个或多个)。使用由New YorkUniversity (Tcuner, 1992)开发的落重装置和由多中心协会(Basso等人，1996)开发的方案，产生脊髓挫伤损伤。使用从12.5 mm高度下落的IOg棒(直径2.5 mm),对暴露的脊髓背侧面进行落重撞击。损伤以后，将肌肉和皮肤逐层封闭，并将大鼠放置在加热垫上以维持大鼠的体温，直到它们苏醒。在麻醉恢复期中，并且在外科手术后前3天，每12小时通过皮下注射施用镇痛剂丁丙诺啡(0.05-0.10 mg/kg),用于手术后的疼痛控制。
[0298]将大鼠随机分成4个施用组进行对比:1 ml FA-GC/姜黄素(5 mg/ml，在盐水中；n=10) ；1 ml单独的FA-GC (4 mg/ml,在盐水中；n=8) ；1 ml甲泼尼龙琥拍酸钠(MPSS, 30mg/kg; n=5);或等容剂量的盐水(n=10)。在损伤后2小时,通过静脉内颈静脉注射,施用治疗。每天3次地进行手工膀胱表达，直到建立反射性膀胱排空。
[0299]使用Basso Beattie Bresnahan (BBB)运动分级评分,评估运动恢复。该试验由2人独立地进行，并在完成评分之前就评分达成一致。在手术后第1、7、14、21、28天，记录BBB评分。
[0300]B.结果
评价了运动功能恢复，并将结果显示在图17中。在第7天和随后的3周中发现了FA-GC/姜黄素治疗的大鼠和MP治疗的大鼠之间的显著差异。在第28天，FA-GC/姜黄素组比MP组明显好6.3点。令人惊奇地，单独FA-GC的组也在第14天和随后的2周中表现出与盐水对照动物相比显著更高的评分。
[0301]还在理解修复机制的尝试中，评价了血液和尿试验。如表2所示，在FA-GC治疗后，镁和BUN (2种重要的肾损伤指示剂)的水平显著减小(参见图18)。
[0302]表2.血液试验结果:
【权利要求】
1.一种包含疏水地修饰的纳米粒的组合物，所述纳米粒包含多糖和药效团，其中所述多糖与所述药效团共价地结合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多糖经由酰胺键与所述药效团共价地结入口 ο
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多糖是乙二醇壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述药效团是阿魏酸。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多糖是乙二醇壳聚糖，且所述药效团是阿魏酸。
6.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物另外包含治疗有效量的抗炎剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述抗炎剂是姜黄素。
8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述抗炎剂是甲泼尼龙。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述纳米粒的平均直径是约200至约400纳米(nm) ο
10.一种包含聚合纳米结构的组合物，所述聚合纳米结构包含疏水芯、亲水壳和治疗有效量的抗炎剂。
11.根据权利要求10所述的组 合物，其中所述纳米结构是胶束。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述抗炎剂是姜黄素。
13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述抗炎剂是甲泼尼龙。
14.根据权利要求10所述的组合物，其中所述纳米结构的平均直径是约50至约150纳米(nm)。
15.—种治疗患有神经元损伤的患者的方法,所述方法包括下述步骤:给所述患者施用治疗有效量的权利要求1的疏水地修饰的纳米粒。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述神经元损伤是脊髓损伤。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述神经元损伤是外伤性脑损伤。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述施用在发生神经元损伤的24小时内进行。
19.一种药物制剂，其包含权利要求1的疏水地修饰的纳米粒。
20.根据权利要求19所述的药物制剂，所述药物制剂另外包含药学上可接受的载体。
【文档编号】A61K9/26GK103491950SQ201280018731
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年2月24日 优先权日:2011年2月24日
【发明者】J.程 申请人:普渡研究基金会