药物制剂的制作方法
【专利摘要】包括聚(乙二醇)修饰的重组hCG(r?hCG)的制剂。
【专利说明】药物制剂
[0001]本发明涉及用于治疗不育的人绒毛膜促性腺激素(hCG)。具体地，本发明涉及人绒毛膜促性腺激素(hCG)的化学修饰(包括聚乙二醇化)，通过所述化学修饰，可以改变例如hCG的化学和/或生理学性质。
[0002]促性腺激素类是一组在男性和女性中调节生殖腺功能的异二聚体糖蛋白激素。它们包括促卵泡激素(FSH)，黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。
[0003]人绒毛膜促性腺激素(hCG)由垂体前叶腺自然分泌，并且发挥功能以支持卵泡发育和排卵。hCG包含对于其它糖蛋白激素LH和FSH也是常见的92个氨基酸的α亚基，以及赋予该激素特异性的hCG独有的145个氨基酸的β亚基。每个亚基通过添加复杂的糖残基进行翻译后修饰。α亚基包含在氨基酸52和78处的2-Ν-连接的糖基化位点，β亚基包含在氨基酸13和30处的2-Ν-连接的糖基化位点和在氨基酸121、127、132和138处的4个O-连接的糖基化位点。
[0004]从怀孕妇女的尿液中提取的hCG[Choragen(Ferring)]已经在不育治疗中使用了许多年。从尿液中提取的hCG的产生包括大量尿液的收集和处理。重组形式的hCG，SPOvitrelle (Serono)也是可获得的。这在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。已知的重组hCG产物具有与从人尿中产生的hCG不同的药代动力学模式(pharmacokinetic profile)。
[0005]存在与hCG制剂相关的相当大的异质性，其涉及在存在的各种同工型的量上的不同。单独的hCG同工型显示相同的氨基酸序列，但是在它们翻译后修饰的程度上不同；特定的同工型特征为糖分枝结构的异质性以及唾液酸(末端糖)结合量的不同，这两者都显示影响具体的同工型生物活性。
[0006]天然hCG的糖基化是高度复杂的。在自然来源的垂体hCG中的聚糖可以包含广泛范围的结构，其可以包括二天线聚糖、三天线聚糖和四天线聚糖的组合。所述聚糖可以具有其它的修饰:核心岩藻糖基化、平分型葡糖胺、用乙酰基半乳糖胺延伸的链、部分或完全唾液酸化(sialylation)，具有α 2，3和α 2，6连接的唾液酸化，和取代半乳糖的硫酸化的半乳糖胺。此外，在单独的糖基化位点的聚糖结构的分布之间存在差异。
[0007]重组hCG(“rhCG”)产品的糖基化反映在宿主细胞系中存在的糖基转移酶范围。现存的rhCG产品Ovitrelle源自改造的中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。在CHO来源的rhCG中的聚糖修饰范围比在源自尿液的天然产物中发现的那些更有限。在CHO来源的rhCG中发现的减少的聚糖异质性的例子包括缺少平分型葡糖胺和降低含量的核心岩藻糖基化和乙酰基乳糖胺延伸。此外，CHO细胞仅能够使用α 2，3连接加入唾液酸(Kagawa等人，1988，Takeuchi等人，1988, Svensson等人，1990) 。这不同于天然产生的hCG,其包含具有α 2，3和α 2，6-连接的唾液酸混合物的聚糖。
[0008]已经证实当与垂体、血清或绝经期后尿液FSH比较时，重组FSH制剂(Organon)在具有低于4的等电点(pi)的FSH(考虑酸性同工型)的量上不同(Ulloa-Aguirre等人.1995)。与重组产物Gonal-f (Serono)和Puregon(Organon)比较,在尿制备物中的酸性同工型的量高得多(Andersen等人.2004)。这必定反映在rFSH中更低摩尔含量的唾液酸，因为在FSH中用硫酸盐修饰的带负电荷的聚糖的含量低。与天然FSH比较，更低的唾液酸含量是两种商购FSH产品的特征，并且因此必定反映制备方法中的限制(Bassett和Driebergen, 2005)。已经关于来自多种来源的物质记载了 FSH的循环寿命。这些物质中的一些已经基于总分子电荷进行分离，总分子电荷如通过它们的Pl表征，其中更多的酸等同于更高的负电荷。对于总分子电荷的主要贡献者是每种FSH分子的总唾液酸含量。例如，rFSH (Organon)具有约8mol / mol的唾液酸含量，而尿来源的FSH具有更高的唾液酸含量(de Leeuw等人.1996)。在大鼠中的相应血浆清除率是0.34和0.14ml /min (Ulloa-Aguirre等人.2003)。在另一个实例中，其中将重组FSH样品分为高和低Pl级分，高Pl(更低唾液酸含量)级分的体内功效减少并且其具有更短的血浆半衰期(D’ Antonio等人.1999)。本 申请人:已经发现，与FSH类似，已知的来源于CHO的重组hCG产物(例如，Ovitrelle)也具有比尿hCG更低量的具有低于4的等电点(pi)的hCG(认为是酸性同工型)，这也反映已知的rhCG产品比尿hCG更低的唾液酸含量。
[0009]hCG和rhCG的总唾液酸含量不是直接可比较的，因为唾液酸一般通过两种方式连接。垂体/血清/尿hCG都包括α2，3和α 2，6-连接的唾液酸，其中主要为前者。然而，CHO细胞来源的重组体仅包括α 2, 3 (Kagawa等人，1988, Takeuchi等人，1988, Svensson等人，1990)。换言之，使用CHO系统表达的重组蛋白将在其末端唾液酸连接的类型方面不同于其天然对应物。除了后者更低的唾液酸总含量以外，这是在天然产物和目前的重组产物之间存在另一种差异，并且在生产药用的生物制剂中这是一项重要的考虑，因为糖结构部分可能对所述分子的药理学性质有贡献。
[0010]因此，合乎需要的是，具有这样的rhCG产品:所述rhCG产品更接近地复制或模拟由人尿生产的产品的生理化学和药代动力学模式。合乎需要的是，具有这样的rhCG产品:其与已知重组产物比较，具有一种或多种改善的药物代谢动力学性质。
[0011] 申请人:已经开发了人来源的重组hCG，其具有比CHO来源的产物Ovitrelle更加酸性的模式，并且其 具有更高的唾液酸含量。 申请人:的研究表明，唾液酸连接的类型，α2，3_或α 2，6_，可以具有对hCG的生物清除的巨大影响。与CHO细胞系相反，人细胞系可以表达唾液酸通过α 2，3和α 2，6连接两者进行连接的重组hCG。
[0012]通过改造人细胞系以表达rhCG和α 2，3唾液酸转移酶两者来制备具有α 2，3和α 2，6-连接的唾液酸二者的混合物的重组hCG。表达的产物是高度酸性的并且携带α 2，3-和α 2，6_连接的唾液酸两者的混合物；后者由内源的唾液酸转移酶活性提供。与在常规CHO细胞中表达的rhCG比较，这具有两个优势:首先，由于这两种唾液酸转移酶的组合活性，所以所述物质是更加高度唾液酸化的；其次，所述物质更接近地类似于天然hCG。与CHO细胞来源的重组产物比较，这可能在生物学上是更加适合的，所述CHO细胞来源的重组产物仅产生α 2，3连接的唾液酸并且具有减少的唾液酸含量。这是国际专利申请号PCT /GB2010 / 001854的主题。 申请人:令人惊奇地发现，与其它重组产物相比，他们的人来源的重组hCG可以更接近地复制或模拟天然人尿产物的生理化学和药代动力学模式。换言之，本发明的rhCG可以更接近于“天然” hCG。关于给药等，这可能具有明显的优势。此外，更“天然”或更“人化”的产品对于可能需要治疗的患者可能是更理想的，尽管在某种意义上，人工是指尽可能的是“天然的”。
[0013]普遍已知的是，用例如水溶性聚合物对治疗性蛋白的化学修饰可能获得这样的结果:改变蛋白的化学和/或生理学性质(例如降低清除率、提高稳定性等，由此延长活性时间)。一类这样的水溶性聚合物是聚(氧化烯)(poly (alkylene oxide)),例如聚(乙二醇)(poly (ethylene glycol),PEG)。实际上，已经创造出术语“聚乙二醇化”或“PEG化”来表示至少一个PEG分子对化学实体的修饰(连接)。用于连接某些聚(乙二醇)部分的方法是可得到的，例如 Roberts M.J.等人，Adv.Drug Del.Rev.54:459-476, 2002 ； ，HarrisJ.M.等人.，Drug Delivery Sytems40:538-551, 2001。已经描述了聚乙二醇化的治疗性蛋白，例如ADAGENX(用于治疗重症联合免疫缺陷疾病的腺苷脱氨酶的聚乙二醇化制剂)和0NCASPAR(用于治疗过敏性ALL患者的聚乙二醇化L-天冬酰胺酶)。但是，聚乙二醇化形式的hCG，特别是可成为商业产品的具有适当性能的那些，迄今不可得到。[0014]根据本发明，提供了一利聚(乙二醇)修饰的hCG。优选地，所述聚(乙二醇)修饰的hCG具有式(Ia)
[0015](R)n-X-Y (Ia)；
[0016]其中:(R)是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG) ；n是1、2、3或4 ;X是键或接头基团；且Y是hCG或其激动性变体。优选地，η是I且X是共价键，或者η是1、2或4且X是接头基团。优选地，所述接头基团X在一个末端处键合至hCG的N-端。
[0017]所述接头基团X是这样的部分:其将hCG(例如其在一个末端处结合至hCG，例如其在一个末端处结合至hCG的N-端)连接至所述(或每个)R基团(例如其也结合至所述R基团或每个R基团，例如其也结合至每个R基团的末端氧或每个R基团)。所述接头基团X可以是在聚乙二醇化领域中已知的任意接头分子。
[0018]所述接头基团X可以是，例如，O或-C (=0)-或-(CH2) t-C (=0)-，其中t是O或1-10的整数。
[0019]所述接头基团X 可以是例如式(Z1CH2) b- (CH2) z- (CHZ2) a_ (CH2) U_0_C (=0) -NH- (CH2)t-c (=0)-的基团，其中:_C (=0)-结合至Y -,Z1 Z2代表与R基团的键；a和b各自独立地选自O和I，前提条件是，a和b不都是O ;t、u和Z各自独立地选自O或1-10的整数。
[0020]在一些实施例中，a、b和u是I ;1:是2，且2是0，所以父是Z1CH2-CHZ2-CH2-O-C(=0)-NH- (CH2) 2-C (=0)-，且所述聚(乙二醇)修饰的 hCG 具有式 CH2R-CHR-CH2-O-C (=0) -NH- (CH2)2-C(=0)-hCG，其中每个R是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。在一个优选实施例中，每个R是甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)(参见实施例12A)。
[0021 ]所述接头基团 X 可以是例如式(Z1CH2) b- (CH2) z- (CHZ2) a_ (CH2) U-0_C (=0) -NH- (CH2)t-C(=0)-的基团，其中:-C(=0)-结合至Y;a和b各自独立地选自O和I ;t、u和Z各自独立地选自O或1-10的整数；且Z1和Z2各自独立地选自(Z3CH2)d-(CH2)e-(CHZ4)e-(CH2)f-0 (CH2CH2O)m，其中Z3和Z4代表与R基团的键；c和d各自独立地选自O和I ;e和f独立地选自O或1-10的整数，且m是1-20，例如1-10。
[0022]在一些实施例中，a和b和u是l，t是2，且z是O J1=Z2且均为(Z3CH2)d- (CH2) e- (CHZ4) c- (CH2) f-0 (CH2CH2O) m,其中 c、d 和 f 是 l，e 是 0，且 Z3 和 Z4 代表与 R基团的键；所以 X 是[CH2R-CHR-CH2-0(CH2CH20)J-CH2-CH[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)J-CH2-O-C (=0)-NH-(CH2) 2-C(=0)-，且所述聚(乙二醇)修饰的hCG具有结构:
[0023]
【权利要求】
1.聚(乙二醇)修饰的hCG。
2.根据权利要求1所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其具有式(Ia) (R)n-X-Y (Ia) 其中: (R)是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)； η 是 1、2、3 或 4 ； X是键或接头基团；且 Y是hCG或其激动性变体。
3.根据权利要求1或2所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中η是I且X是共价键，或者其中η是2或4且X是接头基团。
4.根据任一项前述权利要求所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是重组hCG。
5.根据任一项前述权利要求所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是人细胞系来源的重组hCG。
6.根据任一项前述权利要求所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是包括α 2，3-和α 2，6_唾液酸化的重组hCG (rhCG)。
7.根据任一项前述权利要求所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是具有15mol / mo I或更大的唾液酸含量[以唾液酸的摩尔数与蛋白的摩尔数的比率表示]的重组hCG，例如具有15mol / mol至25m`ol / mo I的唾液酸含量的重组hCG。
8.根据任一项前述权利要求所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是总唾液酸化的10%以上为α 2，3-唾液酸化和/或总唾液酸化的50%以下为α 2，6_唾液酸化的重组hCG。
9.根据任一项前述权利要求所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是总唾液酸化的45%至80%为α 2，3-唾液酸化的重组hCG。
10.根据任一项前述权利要求所述的聚(乙二醇)修饰的hCG，其中所述hCG是总唾液酸化的20%至55%为α 2，6-唾液酸化的重组hCG。
11.组合物，其包含式⑴的修饰的hCG: (R)n-X-Y ⑴ 其中: R是水溶性的、基本上无抗原性的聚合物； η 是 1、2、3 或 4 ； X是键或接头基团；且 Y是hCG或其激动性变体。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中η是I且X是共价键，或者其中η是2或4且X是接头基团。
13.根据权利要求11或12所述的组合物，其中所述R或至少一个R是直链聚合物，例如聚(氧化烯)。
14.根据权利要求11、12或13所述的组合物，其中所述R或至少一个R是聚乙二醇PEG或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的组合物，其中所述R或至少一个R是具有约.200至约40，000之间的分子量的聚(氧化烯)，例如,其中所述聚(氧化烯)具有200至约.20，000之间的分子量，例如，其中所述聚(氧化烯)具有2，000至约10，000之间的分子量，例如，其中所述聚(氧化烯)具有约5，000的分子量。
16.药物制剂，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的聚(乙二醇)修饰的hCG或根据权利要求11-15中任一项所述的组合物。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的聚(乙二醇)修饰的hCG或根据权利要求11-15中任一项所述的组合物或根据权利要求16所述的药物制剂，其中聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)或水溶性的、基本上无抗原性的聚合物缀合至hCG的氨基酸残基。
18.根据权利要求1-10中任一项所述的聚(乙二醇)修饰的hCG或根据权利要求11-15中任一项所述的组合物或根据权利要求16所述的药物制剂，其中聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)或水溶性的、基本上无抗原性的聚合物缀合至hCG的N-氨基末端或C-氨基末端。
19.根据权利要求1-10中任一项所述的聚(乙二醇)修饰的hCG或根据权利要求11-15中任一项所述的组合物或根据权利要求16所述的药物制剂，其中90%以上的聚(乙二醇)或甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)或水溶性的、基本上无抗原性的聚合物缀合至hCG的N-氨基末端。
20.药物组合物(任选地用于治疗不育)，其包含根据权利要求1-10或16-19中任一项所述的聚(乙二醇)修饰的hCG或根据权利要求11-15或16-19中任一项所述的组合物或根据权利要求16-19中任一项所述的药物制剂，且任选地进一步包含FSH和/或LH。
21.治疗不育的方法，其包括下述步骤:给受试者施用组合物，所述组合物包含根据权利要求1-10或16-19中任一项所述的聚(乙二醇)修饰的hCG或根据权利要求11_15或16-19中任一项所述的组合物或根据权利要求16-19中任一项所述的药物制剂；或根据权利要求1-10或16-19中任一项所述的聚(乙二醇)修饰的hCG或根据权利要求11_15或16-19中任一项所述的组合物或根据权利要求16-19中任一项所述的药物制剂在制备用于治疗不育的药物中的用途。
【文档编号】A61P15/08GK103619358SQ201280026567
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年3月29日 优先权日:2011年3月31日
【发明者】伊恩·科廷厄姆, 丹尼尔·普拉克辛, 詹尼·阿哈拉诺夫 申请人:辉凌公司