用于成像的基于聚苹果酸的纳米缀合物的制作方法
【专利摘要】纳米缀合物，该纳米缀合物包括基于聚苹果酸的分子骨架，连接到所述骨架上的一个或多个成像部分和一个或多个靶向模块。至少一个成像部分和至少一个靶向模块连接到所述基于聚苹果酸的分子骨架上。纳米缀合物的合成方法包括提供包含多个羧基侧基的聚苹果酸。所述方法使含有巯基和氨基酸基团的化合物起反应，使巯基通过羧基侧基加成到聚苹果酸上，以形成活化的聚苹果酸。所述方法使至少一个含有巯基结合基团的成像部分与活化的聚苹果酸反应以形成缀合物前体。所述方法可以包括对受试者给药包括基于聚苹果酸的分子骨架、至少一个成像部分和至少一个靶向模块的纳米缀合物。
【专利说明】用于成像的基于聚苹果酸的纳米缀合物
[0001]本申请要求2011年4月6日提交的美国临时申请N0.61/472,362的优先权，该临时申请在此以全文援引方式纳入本文。
[0002]政府权力
[0003]本发明的一部分是在来自美国国立卫生研究院的R01CA123495和U01CA151815的资助支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
【技术领域】
[0004]本发明涉及纳米缀合物，所述纳米缀合物含有连接到基于聚苹果酸的分子骨架上的成像部分和靶向模块。本发明还涉及合成纳米缀合物的方法，以及通过对受试者进行纳米缀合物的给药来使药物靶向病变细胞或组织的方法。
【背景技术】
[0005]影像诊断(diagnostic imaging)允许通过确认不同病理状况的性质来避免不必要的侵入性外科手术干预，所述不同病理状况包括:水肿和肿瘤的区分，多发性转移病灶(multiple metastases)的检测,或者精神病或痴呆症的检测。非侵入性成像可能特别适用于对通过许多常规的探测方法(例如活检和光成像)难以达到的人脑部的疾病或病理状况的诊断。阿尔茨海默症(Alzheimer disease,AD)是在65岁以上的人群中发现的最常见的痴呆症类型，其诊断也需要非侵入性成像。
[0006]最古老的诊断AD的方法是死后通过使用小化合物证实人体组织中的阿尔茨海默症斑块，所述小化合物能够与所述斑块特异性结合，并通过体外染色或体内的放射性闪烁扫描能够使其可视化(Newberg A B et al.2006 J Nuc Med 47:748)。
[0007]在小鼠模型可用于 AD和癌症(如三阴性乳腺癌，HER2阳性乳腺癌，成胶质细胞瘤)之后，体内成像方法逐渐成熟起来。体内成像方法是利用可特异性结合病变细胞或组织的组分的荧光剂或标记抗体，或者使用正电子发射断层扫描(PET;Raymond SB et al.2008Plos One 3:e2175, I ；Klunk WE et al.2004 Annals Neurol 55:306)。
[0008]虽然上述其中的一些方法可以证实病变组织的存在，但是其应用需要较长的曝光时间，且分辨率不足以清楚地区分细节，或小的阿尔茨海默症斑块。突破性的成像技术使用磁共振成像(MRI)。由于含有礼(Gd)的高分辨率造影剂(contrast agents)的应用，MRI成为最先进的非侵入性的成像系统之一。然而，MRI不能区分发生在脑内的病理状况。例如，MRI不能区分癌症的类型，甚至不能区分癌症与其他恶性肿瘤。许多体内成像方法，例如MRI，效率低的原因源于造影剂(例如，钆)不能穿越血脑屏障(BBB)，并且造影剂会通过肾脏被迅速清除。
【发明内容】
[0009]—方面，本发明涉及一种纳米缀合物(nanoconjugate),所述纳米缀合物含有基于聚苹果酸的分子骨架、至少一个成像部分(imaging moiety)和至少一个祀向模块(targeting module)。所述至少一个成像部分中的一个或多个以及所述至少一个祀向模块中的一个或多个缀合到所述基于聚苹果酸的分子骨架上。
[0010]一方面，本发明涉及一种用于促进受试者的细胞或组织成像的试剂盒。所述试剂盒包括纳米缀合物，所述纳米缀合物含有基于聚苹果酸的分子骨架、至少一个成像部分和至少一个靶向模块。所述至少一个成像部分中的一个或多个以及所述至少一个靶向模块中的一个或多个缀合到所述基于聚苹果酸的分子骨架上。
[0011]一方面，本发明涉及一种靶向受试者的细胞或组织的方法。该方法包括对受试者进行组合物的给药，所述组合物包括基于聚苹果酸的分子骨架、至少一个成像部分和至少一个靶向模块。所述至少一个成像部分中的一个或多个以及所述至少一个靶向模块中的一个或多个缀合到所述基于聚苹果酸的分子骨架上。
[0012]一方面，本发明涉及一种合成纳米缀合物的方法。该方法包括:提供具有多个羧基侧基(pendant carboxyl group)的聚苹果酸。该方法还包括:使含有巯基和氨基酸基团的化合物反应，通过羧基侧基使巯基添加到聚苹果酸上，以形成活化的聚苹果酸。该方法包括使含有巯基结合基团的至少一个成像部分与活化的聚苹果酸反应以形成缀合物前体。该方法还包括使含有巯基结合基团的至少一个靶向模块与所述缀合物前体反应。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]结合附图阅读将会更好地理解以下优选实施方式的详细说明。出于图解的目的，图中显示的是目前优选的实施方式。然而，应当理解的是，本发明并不局限于这些具体的设计和方法。附图中:
[0014]图1为设计的便于对转移到脑部的三阴性乳腺癌(TNBC)进行成像的纳米缀合物的示意图。
[0015]图2 为,L (Gd)-1, 4, 7, 10-四氣环十二烧(tetraazocyclododecane)-1, 4, 7, 10-四乙酸(DOTA)胺的合成图。
[0016]图3为Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物的合成图。
[0017]图4显示了含有西妥昔单抗的Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物的HPLC洗脱曲线。
[0018]图5为一组线性图，显示了含有聚苹果酸(P )，12%的Gd-DOTA和15%的2_巯基-乙烧-1-胺(MEA)的Polycefin纳米缀合物的Tl-弛豫率的计算。
[0019]图6为一组线性图，显示了通过饱和酶联免疫吸附试验(ELISA)测定对小鼠转铁蛋白受体(抗MsTfR单抗(抗-MsTfR mAb))特异性的单克隆抗体的亲和力。实线表示游离的抗-MsTfR mAb。虚线表示结合到Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物上的MsTfR mAb,所述缀合物还含有西妥昔单抗和AlexaFluor 680。
[0020]图7为一组荧光激活细胞分选(FACS)柱形图，显示了罗丹明标记的含西妥昔单抗的Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物与在MDA-MB-468细胞中表达的表皮生长因子受体(EGFR)的结合，及其与游离的西妥昔单抗和磷酸盐缓冲液(PBS)的对比。
[0021]图8为显示了具有TNBC转移性肿瘤的小鼠的脑切片的一组MRI图像。左侧图像是未对动物进行造影剂给药的条件下获得的。右侧图像是动物接受Polycefin-Gd纳米缀合物静脉注射后获得的。比例尺=50 μ m。
[0022]图9为显示了具有TNBC转移性肿瘤的小鼠脑中肿瘤的切片的一组MRI图像。上部图像是对动物进行市售的Gd (III)增强剂给药后15分钟(左)和I小时45分钟(右)后获得的。下部图像是对动物进行含有聚苹果酸、Gd-DOTA、MsTfR、西妥昔单抗和Alexa Fluor680染料的Polycefin纳米缀合物给药后15分钟(左)和3小时15分钟(右)后获得的。比例尺=50 μ m。
[0023]图1OA和IOB为注射含有Gd-DOTA、MsTfR、西妥昔单抗和Alexa Fluor 680染料的Polycefin-Gd-DOTA纳米缀合物的动物的Xenogen突光图像。
[0024]图11是一组线性图，示出了对动物注射临床使用的Gd (III)(空心圆圈)和含有Gd-DOTA, MsTfR，西妥昔单抗和Alexa Fluor 680的纳米缀合物(实心圆圈)后，肿瘤的MRI动力学。
[0025]图12A和12B显示了对受试者注射临床使用的Gd(III)(图12A)和含有Gd-DOTA、MsTfR、西妥昔单抗和Alexa Fluor 680的Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物(图12B)后，具有肿瘤的脑部(实线)与健康的脑部(虚线)比较的MRI动力学。
[0026]图13A到13D为一组示意图,说明了设计的用于祀向原发性脑瘤(primary brain)和转移至脑部的TNBC (图13A)、转移至脑部的HER2阳性乳腺癌(图13B)和胶质细胞瘤(图13C)的纳米缀合物，以及与缺乏特异性靶向模块的对照分子(图13D)的比较。
[0027]图14为设计的便于阿尔茨海默症斑块成像的纳米缀合物的示意图。
[0028]图15为姜黄素-PEGltl。。-胺的合成图。
[0029]图16示出了在聚苹果酸上姜黄素和Gd-DOTA模块的结合。
[0030]图17为用20 μ M的游离姜黄素染色(右)和20μ M的Polycef in_姜黄素纳米缀合物染色(左)的具有AD的人 脑部切片(顶部图片)和正常的人脑部切片(底部图片)的一组荧光显微镜照片。
【具体实施方式】
[0031]以下描述中使用的某些术语只为方便而非限制。词语“右”，“左”，“上部”和“下部”用于指代在所参照的附图中的方向。
[0032]在权利要求中和说明书的相应部分中所用的词语“一种”和“一个”，除非特别声明外，被定义为包括一个或多个所引用的项目。该术语包括上面具体提到的词语、它们的衍生词，以及相似词(similar import)。短语“至少一个”后面跟有两个或两个以上的项目，例如“A，B或C”时，是指单独的A，B或C及其任意组合。
[0033]一种实施方式提供了一种纳米缀合物，所述纳米缀合物可以含有基于聚苹果酸的分子骨架、一种或多种成像部分和一种或多种靶向模块。至少一种所述成像部分和至少一种所述靶向模块可以缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上。所有的成像部分都可以缀合到所述基于聚苹果酸的分子骨架上。所有的靶向模块都可以缀合到所述基于聚苹果酸的分子骨架上。
[0034]缀合(conjugate)是指共价结合。
[0035]在一种实施方式中，所述纳米缀合物可以是Polycefin。本文中所使用的术语“Polycefin”是指以聚苹果酸作为基础、附着各种特定残基的用于治疗性靶向的化合物家族。Polycefin可以包括来源于黏菌的聚苹果酸。Polycefin的大小可以为20_30nm并可以作为药物。Polycefin可以被设计为转运其它治疗性分子。聚苹果酸(PMLA)可以包括含有酯链主链(main chain ester linkage)的同聚物。聚苹果酸可以从多头绒泡菌(Physarum polycefallum)的培养物中获得。所述聚苹果酸可以具有任意的长度和任意的分子量。所述聚苹果酸可以具有的分子量为10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、100kDa或更大。所述聚苹果酸可以具有在下述任意两个分子量之间范围的分子量:10、20、30、
40、50、60、70、80、90、95或lOOkDa。所述聚苹果酸可以具有下述属性中的至少一种:可生物降解和具有高分子弹性、溶于水(当电离时)和有机溶剂(以其酸的形式)、无毒，或无免疫原性(Lee Bs et al., ffater-soluable aliphatic polyesters:poly (malic acid)s,in:Biopolymers, vol.3a(Doi Y, Steinbuchel A eds., pp 75-103, ffiley-VCH, New York2002，在此以全文援引的方式纳入本文)。
[0036]在一种实施方式中，聚苹果酸可被用作携带靶向模块的分子骨架。在一种实施方式中，靶向模块可具有除靶向以外的功能。可用于本发明实施方式的基于聚苹果酸的分子骨架在以下专利申请中有所记载:2004年12月3日提交的PCT申请N0.PCT/US04/40660、2009年4月10日提交的PCT申请N0.PCT/US09/40252、2010年12月10日提交的PCT申请 N0.PCT/US10/59919.2010 年 12 月 30 日提交的 PCT 申请 N0.PCT/US10/62515、2007 年 3月12日提交的美国申请N0.10/580,999(授权的美国专利为7，935，677)，以及2010年9月28日提交的美国申请N0.12/935，110，所有上述PCT申请和美国申请在此以全文援引的方式纳入本文。
[0037]基于聚苹果酸的分子骨架可以是具有至少两个或多个连接到基于聚苹果酸的分子骨架上的靶向模块的分子。所述靶向模块也可以将药物或其它治疗实体转运至靶组织。
[0038]在一种实施方式中，所述基于聚苹果酸的分子骨架可以基于聚(β-L-苹果酸)。聚(β -L-苹果酸)可以通过其羧基，以化学方法与各种模块以确定的比例缀合。
[0039]在一种实施方式中，具有基于聚苹果酸的分子骨架的纳米缀合物可以高特异性地靶向细胞或组织。作为药物载体的纳米缀合物的高特异性可以在靶组织中引起增强的通透性和保留(可能是由于其较 大的分子量，所述分子量可大于20000) (Duncan R.1999Research Focus 2:441;Seymour Lff et al., 1995 Eur J Cancer Res 31A:766)。
[0040]在一种实施方式中，所述一个或多个成像部分可以包括适宜的有助于成像过程的化合物。所述化合物可以是造影剂。成像可以是用作临床诊断工具的任何成像过程。成像可以是MRI过程，所述MRI过程可以对光学不透明的物体进行非侵入性成像，并且可以提供在高空间分辨率下软组织之间的对比。在所述一个或多个成像部分中的成像部分可以为用于MRI的螯合分子。所述螯合分子可以是但不限于:1，4，7，10-四氮环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(1,4，7，10-tetraazocyclododecane-l, 4, 7, 10-tetraacetic acid,D0TA)、二苯并-D0TA(dibenzo-DOTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮环十二烷 _1，4，7，10-四(2-丙酸)(DOTMA)U, 4, 8, 11-四氮环十四烷 _1，4，8，11-四乙酸(1，4，8，11-tetrazacyclotetradecane-1, 4, 8, 11-tetra acetic acid, TETA)、1，4，7，-三羧基甲基-1, 4，7，10-四氮环十二烷-三乙酸(D03A)、1，4，7，10-四氮环十二烷_1_(2-羟丙基)-4，7，10-三乙酸(HP-D03A)、乙二胺四乙酸(EDTA)、双-2 (羟基苯甲基)-乙二胺二乙酸(bis_2 (hydroxybenzyl)-ethylenediamine diacetic acid,HBED)或 1，4，7_ 三氮环壬烧-N, N ' , N "-三乙酸(1，4，7-triazacyclo-nonane N, N' ，N" -triacetic acid, ΝΟΤΑ)。
[0041]在一种实施方式中，所述螯合分子可以与顺磁性离子形成复合物。顺磁性离子可以是与磁场平行或反相平行的磁化的金属离子。所述顺磁性离子可以是顺磁金属的多价离子。所述顺磁金属可以选自但不限于镧系元素和过渡金属元素。过渡金属元素可以包括但不限于锰、铁、铬、镍和钴。镧系元素可以包括但不限于镨、钕、钐、钆、铽、镝、钦、铒、铕及镱。
[0042]在一种实施方式中，所述造影剂可以是钆，钆是一种高度顺磁的离子。该实施方式可以应用于MRI过程。钆(Gd)可以与螯合分子结合。钆可以与(2,2' ,2" -(2-(2-(2-疏基乙胺基)_2_氧乙基)_1，4，7-四氮环十二烧-1，4，7-二基)三乙酸)(2,2' ,2〃 -(2-(2-(2-mercapto ethylamino)-2-oxoethyl)-1, 4, 7-tetraaza-cyclododecane-1, 4, 7-triyl) triacetic acid, DOTA)结合，并可以形成 Gd-DOTA 复合物。Gd-DOTA可以形成稳定的造影剂。Gd-DOTA可用于人类。
[0043]本文中的纳米缀合物具有高分子量，并且包括可以改善BBB穿透效果和延长循环时间的Gd-DOTA分子。由于纳米缀合物的高分子量，可以改善在脑肿瘤区域内或具有病理状况的其他区域内造影剂的积累。
[0044]所述连接到基于聚苹果酸的分子骨架上的一个或多个靶向模块可以包括除靶向之外的生物活性。所述一个或多个靶向模块可以被设计为进行药物前体的送递。所述一个或多个靶向模块可以包括可释放的在细胞质中开始生效的功能模块。所述一个或多个靶向模块可以被设计为，通过能够与细胞表面结合，指导纳米缀合物至特定组织。所述一个或多个靶向模块可以被设计为有助于纳米缀合物通过核内体内化到靶细胞中。所述一个或多个靶向模块可以被设计为通过疏水性功能单元促进所述缀合物从核内体逸出，所述疏水性功能单元被整合到核内体膜上并破坏核内体膜。所述一个或多个靶向模块可以被设计为增加核内体到溶酶体的酸化过程的有效性。所述一个或多个靶向模块可以被设计为免受降解酶，例如肽酶和蛋白酶的活性的影响。
[0045]在一种实施方式中，祀向模块可以为但不限于:抗体、多肽、寡核苷酸、化学治疗剂或噬菌体。所述一个或多个靶向模块可能能够靶向病变细胞或组织的组分。
[0046]在一种实施方式中，靶向模块可以是抗体。所述抗体可以具有识别并特异性结合到靶标的能力。所述靶标可以为 但不限于:蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸，脂质，或至少前述两种的组合，所述结合通过抗体可变区内的至少一种抗原识别位点进行。
[0047]在一种实施方式中，靶向模块可以是一类被称为拮抗抗体(antagonistantibodies)的抗体,所述拮抗抗体特异性地结合癌干细胞标记蛋白，并且干扰,例如,配体结合、受体二聚化(receptor dimerization)、癌干细胞标记蛋白的表达和/或癌干细胞标记蛋白的下游信号传导。
[0048]在一种实施方式中，靶向模块可以是一类被称为激动剂抗体(agonistantibodies)的抗体,所述激动剂抗体特异性结合癌干细胞标记蛋白并且促进如配体结合、受体二聚化和/或癌干细胞标记蛋白的信号传导。在一种实施方式中，靶向模块可以一种抗体，该抗体既不干扰或也不促进癌干细胞标记蛋白的生物活性，而是可以通过例如抗体的内化和/或免疫系统的识别而具有抑制肿瘤生长的功能。
[0049]靶向模块可以选自任何类型的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段，所述抗体片段可以为但不限于Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv片段、单链Fv(scFv)突变体、嵌合抗体或多特异性抗体。多特异性抗体可以是从至少两种完整的抗体产生的双特异性抗体。祀向模块可以是人源化抗体(humanized antibody)或人源抗体(humanantibody)。靶向模块可以是包括抗体的抗原决定部分的融合蛋白。靶向模块可以是含有抗原识别位点的抗体片段。选择的抗体可以包括五大类免疫球蛋白的任意种类:IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM，或者其子类(亚型)(例如，IgGl, IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)，基于其重链恒定区的同一性被称为α、δ、ε、Y或μ。靶向模块可以是裸露的抗体或与其他分子缀合的抗体。靶向模块可以为与例如毒素或放射性同位素缀合的抗体。
[0050]在一种实施方式中，靶向模块可以是单克隆抗体。在一种实施方式中，靶向模块可以是多克隆抗体。在一种实施方式中，靶向模块可以是特异性针对细胞中的至少一种脉管蛋白的抗体。所述脉管蛋白可以是转铁蛋白受体蛋白。本文中所用的转铁蛋白受体蛋白是指在内皮细胞表面上表达、并在某些肿瘤细胞上水平升高的受体(Lee JH et al.2001 EurJ Biochem 268:2004 ；Kovar MK et al., 2003 J Drug Targeting 10:23)。单克隆抗体革巴向模块(TfR-mAb)可以结合转铁蛋白受体蛋白，并通过内皮细胞与BBB结合而实现转胞吞作用。一种实施方式包括连接到含有礼的纳米缀合物上的Tfr-mAb,所述Tfr_mAb可以特异性结合到位于脑毛细血管腔面的内皮细胞表面上的转铁蛋白受体上，从而将所述纳米缀合物结合于此。一旦结合，所述纳米缀合物可以通过转胞吞作用而有效地穿过BBB内皮细胞。含Tfr-mAb的纳米缀合物的大小可以是20_30nm (分子量100，000),众所周知,这远高于肾排出极限。
[0051]TfR mAb祀向模块可以为人源化抗体(hu-Tgr-mA)或嵌合抗体。为了研究阿尔茨海默症(AD模型)或转移至脑的TNBC的大鼠和小鼠模型的体内成像，可以用小鼠或大鼠的TfR mAb代替纳米缀合物的hu-TfR mAb。所述纳米缀合物可以包括用于类似目的的其他多肽。
[0052]靶向模块可以包括对转铁蛋白受体特异性的凝集素或另一种配体。靶向模块可以是任意数量的细胞表面受体或抗原的其中一种的配体。
[0053]靶向模块可以是在构建纳米缀合物过程中共价缀合到聚苹果酸上的小药物分子或发色团分子或蛋白质分子或凝 集素。
[0054]靶向模块可以是被设计为特异性结合蛋白的抗体，所述蛋白选自但不限于:表皮生长因子受体(EGFR)、人类表皮生长因子(HER)、层粘连蛋白411、胰岛素样生长因子(IGF)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α )0结合EGFR的抗体可以是西妥昔单抗。结合HER的抗体可以是Herceptin⑧。结合层粘连蛋白411的抗体可以结合层粘连蛋白β I亚基或层粘连蛋白a 4亚基,或其两者。
[0055]靶向模块可以是寡核苷酸。寡核苷酸可以是抑制靶核酸分子表达的反义寡核苷酸。寡核苷酸可以是抑制层粘连蛋白411 (Iamin 411)表达的反义寡核苷酸的一种,所述寡核苷酸在2004年9月13日提交的PCT申请PCT/US04/29956和2007年I月30日提交的美国申请N0.10/570, 747 (作为美国专利N0.7，547，511授权)以及2009年5月28日提交美国申请N0.12/473, 992中有所记载，上述文献以全文援引的方式纳入本文。
[0056]靶向模块可以包括如2009年4月10日提交的PCT申请PCT/US09/40252中所描述的核内体逸出单元(endosomal escape unit),该文献以全文援引的方式纳入本文。核体内逸出单元可以为连接到基于聚苹果酸的骨架上的载体模块,通过核内体囊泡(endosomalvesicles)成熟为溶酶体的过程中的酸化而变得有活性。所述载体模块可以包括通过酰胺键连接到基于聚苹果酸的分子骨架上的多肽中的多个亮氨酸残基。所述载体模块可以包括通过酰胺键连接到基于聚苹果酸的分子骨架上的多肽中的多个缬氨酸残基。所述载体模块可包括通过酰胺键连接到基于聚苹果酸的分子骨架上的亮氨酸乙酯。在核内体到溶酶体的酸化过程中，这一系列载体模块可以使电荷中和并具有疏水性，并能够破坏细胞膜。在构建含有聚苹果酸和核内体逸出单元的组合物时，可以使用其他在溶酶体PH值条件下成为电中性的分子来代替亮氨酸或缬氨酸残基或亮氨酸乙酯。
[0057]靶向模块可以是用于防止被网状内皮系统(RES)再吸收和/或酶降解的模块。例如，所述用于防止被再吸收的模块可以为但不限于聚乙二醇(PEG)分子。聚乙二醇可用于增加缀合蛋白的体内半衰期，以延长循环时间，并增强向祀实体瘤的外渗(Arpicco S etal.2002 Bioconjugate Chem 13:757 ；Maruyama K et al.，1997 FEBS Letters 413:1771，在此以全文援引的方式纳入本文)。其它已知的能够增加纳米缀合物的半衰期的分子也可以用于设计本文的纳米缀合物。
[0058]图1显示了包括连接到聚苹果酸平台上的Gd-DOTA复合物的典型纳米缀合物。所述纳米缀合物可以在转移到脑部的人类TNBC的小鼠模型中，用于肿瘤类型特异性的MRI。连接到聚苹果酸上的模块可包括MRI造影剂(Gd-DOTA)、靶向模块(嵌合的鼠-人单克隆抗体西妥昔单抗(Erbituxt?)，特异性针对由肿瘤细胞呈现的EGFR和用于穿透BBB的MsTfR)，和用于提高溶解性的羧基。在用于人类时，抗小鼠TfR mAb可以被替换为抗人TfR mAb。
[0059]可以使用任意分子量(Mw)的聚苹果酸作为携带一个或多个靶向模块以及一个或多个成像部分的平台。本文中所使用的聚苹果酸可以具有的分子量为10，000、15，000、20，000,30, 000,40, 000,50,000,60,000,70,000,80,000,90,000,100,000,110,000、120，000、130，000、140，000、150，000或更大，或在前述的任意两个值(含端点)之间范围内的任意值。分子量80，000的聚苹果酸可以作为用于携带共价结合的MsTfR mAb和肿瘤特异性mAb，以及多个共价结合的Gd-DOTA的纳米缀合物的平台。所述平台可能包括任意数量的可衍生的(derivatisable)羧基。在实施方式中，所述平台可包括700个或更多个可衍生的羧基和大量的能够被负载的以产生强MRI信号的Gd-DOTA单元。
[0060]在一种实施方式中， 一个或多个靶向模块能够靶向病变细胞或组织的组分。所述组分可以是但不限于，被认为促进脑中的神经元退化和随后的阿尔茨海默症的症状的β_淀粉样蛋白斑。一个或多个靶向模块可以包括用于特异性结合阿尔茨海默症的淀粉样蛋白斑的姜黄素(5-羟基-1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，4，6-庚三烯(h印tatrien)-3-酮(on))。姜黄素可以特异性地紧密结合到β淀粉样斑块上，从而可以使脑内的纳米缀合物积累并具有高度的染色强度。所述纳米缀合物可以包括一个或多个姜黄素分子。纳米缀合物上多个姜黄素分子的存在导致所述纳米缀合物牢固结合地在β_淀粉样斑块的周围，有助于形成高对比度的尖峰(sharp contours)。
[0061]含有姜黄素的纳米缀合物分子中可以携带任意数量的钆离子。纳米缀合物可以携带单个礼离子。纳米缀合物可以携带多个礼离子。纳米缀合物可以携带1、5、10、20、30、40、50或60个或更多个钆离子。纳米缀合物可以携带多个钆离子，每分子纳米缀合物可以携带的钆离子的数量可以在1、5、10、20、30、40、50或60的任意两值之间。靶组织，例如，淀粉样斑块上高浓度的Gd可以使得通过MRI以高对比度和高质量的分辨率成像。
[0062]所述一个或多个靶向模块可包括治疗性多肽。
[0063]在实施方式中，所述一个或多个靶向模块可以包括额外的治疗剂。在实施方式中，额外的一种或多种治疗剂选自由生长因子，抗炎剂，血管加压剂，胶原酶抑制剂，类固醇(topical steroid),基质金属蛋白酶抑制剂,抗坏血酸盐,血管紧张素II,血管紧张素III，钙网蛋白，四环素类，纤连蛋白，胶原蛋白，血小板反应蛋白，转化生长因子(TGF)，角质细胞生长因子(KGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，胰岛素样生长因子(IGF)，表皮生长因子(EGF),血小板衍化生长因子(PDGF),神经鞘分化因子(neu differentiation factor,NDF)，肝细胞生长因子(HGF)和透明质酸。
[0064] 在一种实施方式中，纳米缀合物可以包括跟踪荧光染料，以追踪在受试者体内纳米缀合物的分布。跟踪染料可以便于通过使用除MRI以外的成像系统来对纳米缀合物在体内的分布进行总的监测。在不使用Gd的情况下，在对受试者疾病或状况的第一阶段的调查中，跟踪染料可以确认姜黄素聚苹果酸缀合物进入脑部。跟踪染料也可以确认在脑内姜黄素是否连接到了聚苹果酸上。因此，跟踪染料可用于实验的优化。追踪可以通过使用例如Xenogen突光成像系统来执行。
[0065]在一种实施方式中，提供了便于细胞或组织成像的试剂盒。所述细胞可以是病变细胞。所述组织可以是病变组织。所述试剂盒可以通过用于可视化病理状况的方法实现。所述试剂盒可以包括纳米缀合物，所述纳米缀合物包括基于聚苹果酸的分子骨架，一个或多个成像部分和一个或多个靶向模块。所述试剂盒可以包括本文描述的任何一种或多种纳米缀合物。至少一个成像部分和至少一个靶向模块可以缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上。所有的成像部分均可以缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上。所有的靶向模块均可以缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上。
[0066]试剂盒中的模块和部分的具体性质的设计取决于其预定目的。在实施方式中，所述试剂盒可以设计为实现阿尔茨海默症或其他涉及异常的脑功能、活性或病理状况的可视化、治疗或监测的目的。为此，所述试剂盒可以包括含有用于结合β淀粉样斑块和MRI成像的模块的纳米缀合物。在实施方式中，所述试剂盒可以设计为用于癌症的可视化、处理或监测。
[0067]在实施方式中，所述试剂盒出于治疗哺乳动物受试者的目的可以进行特别的配置。所述试剂盒也可以为了治疗人类受试者的目的进行特别的配置。所述试剂盒可以配置用于兽医应用。所述试剂盒可以被配置为但并不限于治疗农场动物，家畜或实验室动物。所述试剂盒中可以包括使用说明。所述使用说明可以包括使用所述试剂盒组分的方法的具体描述，以实现期望的结果。例如，所述说明可以描述用于可视化β淀粉样斑块或肿瘤细胞或细胞类型的方法。所述试剂盒还可以包括其它有用的成分。例如，所述试剂盒可包括本领域的技术人员公知的稀释剂，缓冲剂，药学上可接受的载体，注射器，导管，喷头(applicators ),移液或测量工具,包扎材料或其他有用的器具。
[0068]实际操作者(practitioner)可以将试剂盒中组装的材料或成分以任何方便的和合适的方式存储，以保持其可操作性和可用性。例如，所述成分可以以溶解的，脱水的或冻干的形式提供。这些成分可以在室温、冷藏或冷冻的温度下提供。这些成分可以包装在合适的包装材料中。如本文所用的，术语“包装材料”指的是一种或多种物理结构，用于容纳试剂盒的内含物，如本发明的组合物等等。包装材料可以由公知的方法，优选在能提供无菌，无污染物的环境下构建。如本文所用的，术语“包(package)”指的是合适的固体基质或材料，如玻璃，塑料，纸，箔等，能够容纳单独的试剂盒成分。包装材料可以具有指示试剂盒的内含物和/或目的和/或其成分的外部标签。
[0069]在一种实施方式中，提供了一种靶向受试者细胞或组织的方法。所述细胞可以是病变细胞。所述组织可以是病变组织。所述方法可以包括对受试者进行含有基于聚苹果酸的分子骨架，至少一个成像部分和至少一个靶向模块的纳米缀合物的给药。所述至少一个成像部分和至少一个靶向模块可以缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上。所有成像部分均可以缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上。所有靶向模块均可以缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上。所述纳米缀合物可以是本文中描述的任何纳米缀合物。所述方法还可以包括提供使得纳米缀合物与病变细胞或病变组织的组分发生相互作用的条件。
[0070]所述受试者可以是患者。如本文所用的，术语“患者”是指人类。所述患者可以是具有疾病或状况的一种或多种症状的人。所述患者可能需要在临床环境中治疗疾病或状况。疾病或状况的症状可能会因为治疗而变化，或自发缓解，或随疾病的进展而进一步发展。术语“患者”也可指非人类生物。所述患者可以是实验动物，农场动物或动物园的动物。所述患者可以是小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、马、兔子、山羊或牛。
[0071]在一种靶向细胞或组织的方法的实施方式中，可以通过任何适当的途径对受试者进行纳米缀合物的给药。所述纳米缀合物可通过静脉内注射给药。所述纳米缀合物也可以通过选自由肌内注射、皮下注射、静脉注射、皮内注射、鼻内注射、吸入、口服给药、舌下给药、口腔含化给药(buccal administration)或局部给药所组成的组中的方法进行运送。
[0072]在一种靶向细胞或组织的方法的实施方式中，所述至少一个成像部分可以是促进成像技术的分子。可通过任何技术进行成像，所述技术包括但不限于X射线成像，计算机断层摄影(CT)扫描和MRI。所述成像部分可以包括成像造影剂。所述成像造影剂可以为Gd-DOTA。所述方法可包括在受试者中进行成像造影剂的可视化。可视化可以通过成像技术进行，例如，通过X-射线，CT或MRI。
[0073]在一种实施方式中，靶向细胞或组织的方法还可以包括对受试者的疾病或其他状况(conditions)的诊断。诊断可以基于病变细胞或病变组织的图像。诊断可以包括与健康个体的正常细胞或组织的图像 进行比较。所述图像可以通过任何非侵入性的临床影像诊断方式获得。例如，可以通过MRI获得所述图像。MRI装置利用核磁共振现象，可以形成待呈像的细胞或组织的横截面的图像。所述MRI可以测量来自接受成像的受试者的细胞或组织中存在的水分子的质子的信号。MRI图像的强度可以取决于特定的组织的物理性质。MRI信号的强度可以取决于质子密度，自旋晶格弛豫时间(Tl)，和自旋-自旋弛豫时间(T2)。
[0074]“异常状况(abnormail condition)”是指患者体内细胞和组织的机能偏离机体正常机能的机能。异常状况可以指疾病。异常状况可以包括脑失调。脑失调可以为但不限于:阿尔茨海默症、多发性硬化症、帕金森氏病、亨廷顿氏病、精神分裂症、焦虑症、痴呆症、智力低下和焦虑。异常状况可以包括增殖性疾病(proliferative disorder)。术语“增殖性病变”和“增殖性疾病(proliferative disease)”是指与异常细胞增殖相关的疾病(disorders)。增殖性疾病可以是但不限于:癌症、血管发生、牛皮癣和纤维变性病(fibrotic disorders)。癌症是哺乳动物体内以细胞群生长失调为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于，肿瘤(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这种癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌(cancer of the peritoneum)、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤(hepaticcarcinoma)和不同类型的头颈部癌。乳腺癌可以包括TNBC和HER2阳性乳腺癌。
[0075]癌症可以是原发癌或转移性癌。术语“原发癌”是指癌症起源的原始位点。例如，起源于乳腺的癌症被称为原发性乳腺癌。如果其转移，即扩散至脑，所述癌症就被称为转移至脑部的原发性乳腺癌。
[0076]术语“转移”指癌症从原始位点扩散或转移到机体其他部位的过程，并发展为相似的癌症病变，即在新的位置具有相同或大致相同的生化标志物。一种“转移的”或“正转移的”细胞是一种具有与相邻细胞接触的粘度活性降低，并通过血液或淋巴内从疾病的原发部位迁移到远端的其他位点，例如，侵入邻近的身体结构或远端结构。
[0077]异常状况还可以包括糖尿病、类风湿关节炎、哮喘、牛皮癣、动脉粥样硬化、心血管疾病、青光眼和视网膜病变(rethinopathy)。术语“疾病”是指所有的异常状况。诊断可以包括除异常状况以外的其他状况的诊断。所述其他状况可以与异常状况相关。所述其他状况可以与异常状况不相关。例如，除诊断阿尔茨海默症之外也可以诊断精神分裂症。
[0078]术语“肿瘤”，是指任何由于细胞过度生长或增殖而产生的组织块，无论是良性(非癌)或包括癌前期病变的恶性肿瘤(癌)。肿瘤细胞可能来自肿瘤或包括非致瘤性细胞和致瘤性细胞(即癌干细胞)的癌前期病变。
[0079]—种实施方式包括肿瘤特异性纳米缀合物，其可用于MRI的增强和促进影像诊断。增强包括这样一种方法。具体而言，肿瘤特异性纳米缀合物可用于区分普通MRI过程无法区分的脑部的肿瘤和非肿瘤性病变。纳米缀合物可以用来区分发生在相同个体同侧(side-by side)的不同类型的肿瘤。纳米缀合物可用于癌症患者脑部的MRI增强，所述癌症患者有下列病史:原发性乳腺癌、来自原发性乳腺癌的转移性脑肿瘤，来自不同类型的癌转移瘤，原发性脑肿瘤和/或化疗并发症的免疫系统损害引起的感染。
[0080]本发明的纳米缀合物被 设计为增强基于MRI的对特定状况的诊断。在一种实施方式中，纳米缀合物(MRI增强剂)可以包括在特异性针对肿瘤细胞表面的肿瘤标志物的抗体。所述抗体可以特异性针对过表达的细胞表面抗原，例如EGFR、HER2、B淋巴细胞抗原CD20或层粘连蛋白。所述抗体可通过靶向肿瘤毛细血管内皮上的转铁蛋白受体，利用转胞吞作用，跨越BBB而进入肿瘤间质，从而促进进入肿瘤组织。一旦连接，所述增强剂可以保留的时间尺度远远超过通过肾脏清除的未结合的游离MRI增强剂的。由于其在脑部或其他肿瘤中延长的保留时间，使得提供自旋的朝向MRI装置的外部磁场的脉冲后，通过发射作为水分子周围的试剂的缩短的弛豫时间Tl的信号，MRI能够识别标记肿瘤。Tl倒数的缩短与MRI增强剂的浓度成比例(proportional)，因此，信号的增强可能是由于肿瘤的特异性结合导致的累积的结果。肿瘤的非特异性MRI信号可以通过用于脑部健康部分测量的Tl的测量而获得。可以测量肿瘤脑部和健康脑部之间Tl值的差异，并作为反映特异性肿瘤保留增强剂的时间函数，而健康脑部内和其他地方的试剂可能已通过肾脏被清除。肿瘤类型特异性MRI扫描可以在健康脑部的Tl接近零值时进行。
[0081]本文所述的纳米缀合物中可以包括大量的造影剂，以提高MR图像的分辨率。造影剂可以是适于在体内产生对比效果的分子。造影剂可形成金属蛋白复合物。造影剂可以形成影响弛豫时间Tl或T2或两者的复合物。影响Tl的造影剂可以是镧系金属离子。造影剂可以是与低分子量的分子螯合以限制其毒性的钆。影响T2的造影剂可由小颗粒的磁铁矿(Fe0_Fe203)组成。造影剂可以与组织中的自由水(mobile water)互相作用而形成对比。
[0082] 在一种实施方式中，疾病或状况的诊断可能会涉及具有异常的脑功能、活性或病理的患者。阿尔茨海默症的诊断可以基于患者脑部的β淀粉样斑块的存在来进行。
[0083]可以通过对患者进行含有基于聚苹果酸的纳米缀合物的组合物的给药，并获取在患者机体的特定组织类型中所述纳米缀合物的位置的图像来进行诊断，所述基于聚苹果酸的纳米缀合物包含用于结合的β淀粉样斑块的靶向模块和用于MRI成像的成像部分。
[0084]所述纳米缀合物可以通过ΒΒΒ，然后靶向斑块(阿尔茨海默症的标志物)，所述纳米缀合物同时连接有能结合斑块的姜黄素和TfR mAb。接近β_淀粉样斑块的成像可以使得确定阿尔茨海默症的状态并在治疗该疾病的过程中对患者进行跟踪。可以使用含有姜黄素和/或其它活性化合物的类似的Polydefin纳米缀合物来治疗阿尔茨海默症。
[0085]在一种实施方式中，纳米缀合物的应用可以提高BBB渗透的效率，并可以延长含钆造影剂的循环时间。由于姜黄素与阿尔茨海默症淀粉样斑块的紧密结合，纳米缀合物的应用还可以提高在含有斑块的脑部区域内的积累。
[0086]在一种实施方式中，靶向病变细胞或组织可以导致所述疾病或状况的至少一种症状的减少或消除，从而治疗受试者的所述疾病或状况。靶向病变细胞或组织可以作为一种治疗手段，以促进癌症的消退或者防止进一步发展或转移；或者作为一种预防手段，以使与肿瘤或癌症的发展相关的并发症最小化。
[0087]在一种实施方式中，被监测或治疗的状况和/或疾病可以是阿尔茨海默症。在一种实施方式中，提供了治疗患者状况的方法。所述方法可以包括，进行含有纳米缀合物的组合物的给药，所述纳米缀合物包括用于结合β淀粉样斑块的靶向模块和用于MRI成像的成像部分。所述方法还可以包括用所述组合物治疗患者。
[0088]为了达到所需效果，即抑制至少一种靶受体的配体的表达，可进行治疗有效量的组合物的给药。所述组合物的“治疗有效量”可以是用于有效防止癌症的进一步发展或转移生长甚至是使癌症达到消退效果的剂量。
[0089]可以由临床医生根据待治疗的患者的需要选择确切的剂量。可调节剂量和给药方式以提供足够的活性剂水平或维持所需的效果。加以考虑的其他因素包括疾病状态的严重程度，例如，肿瘤的大小和位置，年龄，患者的体重和性别，饮食，给药的时间和频率，药物组合，反应敏感性，和对治疗的耐受性/应答。长效(Long acting)组合物的给药可以为每3至4天、每周或每两周一次，这取决于具体组合物的半衰期和清除速率。
[0090]在一种实施方式中，所述一个或多个靶向模块可以包括用于治疗患者疾病或状况的活性剂。活性剂可配制成便于给药和剂量均匀的单位剂型(dosage unit form)。在本文中的表述“单位剂型”，是指用于待治疗患者的活性剂的物理上独立的单位。
[0091]对于任何活性剂，可以在细胞培养实验或动物模型中初步估算治疗有效剂量，所述动物模型通常指如本文实施例中所示的鼠、兔、狗或猪。也可以使用动物模型来获得所需的浓度范围和给药途径。然后可以使用上述信息来确定用于人类给药的有用剂量和途径。治疗有效剂量是指可以改善症状或状况的活性剂的量。活性剂的疗效及毒性可通过标准制药学程序在细胞培养或实验动物中来确定，例如，ED 50 (对50%的群体有治疗效果的剂量)和LD50 (使50%的群体致死的剂量)。毒性与治疗效果的剂量比值比为治疗指数，并可以表示为LD50/ED50的比值。本文的组合物可以呈现出很大的治疗指数。从动物研究中获得的数据可以用于制定供人类使用的剂量范围。
[0092]如上文所讨论的和在实施例中更详细地描述的，本文所述的纳米缀合物可以在防止癌症发展或转移的方法中进行给药。具体而言，纳米缀合物可以用于防止特定的癌症类型的进一步生长，所述癌症类型包括但不限于:乳腺癌；皮肤癌；卵巢癌；宫颈癌；视网膜母细胞瘤；结肠癌和其他包括源于胃肠道粘膜的状况；肺癌和呼吸道癌；肾细胞癌和其他源于肾小管内表面的肿瘤；白血病和淋巴瘤等血液疾病；以及其他类型的生殖系统癌症，包括与不同菌株的乳头状瘤病毒相关的生殖系统癌症；脑肿瘤；子宫癌、阴道癌和尿道癌。
[0093]在实施方式中，诊断、预测和治疗的方法可以不限于治疗人类的状况，也可以用于治疗任何哺乳动物的类似状况，所述哺乳动物包括但不限于:牛、犬、猫、山羊、绵羊、猪、鼠和马等物种。
[0094]在一种实施方式中，提供了一种监测受试者的疾病或状况的治疗效率的方法。监测可以包括，治疗后在受试者的病变细胞或病变组织中获得第一图像，并且在一段时间之后，获取病变细胞或组织的第二图像。可以进行所述第一和第二图像的对比以确定治疗后的细胞和组织在临床上的显着差异。例如，可以将两张或更多张图像进行比较，以确定治疗是否减少了肿瘤中癌细胞的数量或特定肿瘤的大小。
[0095]受试者可为需要MRI过程的患者。可以在将患者置于MRI装置之前或之后的任何时候进行组合物的给药，所述组合物包括基于聚苹果酸的分子骨架、至少一个成像部分和至少一个靶向模块。在产生图像前，所述组合物可以靶向患者机体不同部位的细胞或组织。在这种情况下，所述组合物可在成像前在具体位置累积。图像也可以在组合物在靶细胞或组织中积累的过程中产生。通过检查一张或多张图像可以确定所述组合物靶向的任何病变细胞或组织。一段时间后，可以对受试者进行所述组合物的再次给药，时间间隔取决于具体的治疗计划，例如，可以每周，每两周，每三周或每个月进行所述组合物的给药。在所述组合物后续给药期间或之后可以生 成图像，并可以对不同阶段期间获取的图像进行比较以评估疗效。
[0096]本发明的方法可以包括提供足以使纳米缀合物在靶细胞或组织中积累的一段时间。
[0097]在另一种实施方式中，提供了一种用于对具有异常的脑功能、活性或病理的个体的疾病和/或状况的预测方法。所述方法可以包括对受试者进行含有纳米缀合物的组合物的给药，所述纳米缀合物包括用于结合β淀粉样斑块的靶向模块和用于MRI成像的模块；并且基于在所述个体中相对正常受试者存在的高水平β淀粉样斑块，预测所述疾病和/或状况的严重程度。
[0098]在一种实施方式中，包括基于聚苹果酸的分子骨架、至少一个成像部分和至少一个靶向模块的组合物还可以包括药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括适合所需的具体剂型的任何和所有的溶剂、稀释剂或其它液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂和润滑剂。药学上可接受的载体可为 Remington ' s Pharmaceutical Sciences Ed.by Gennaro, MackPublishing, Easton, PA, 1995中描述的载体,该文献在此以全文援引方式纳入本文,该文献中还公开了用于配制药物组合物的各种载体和用于制备它们的已知技术。可以作为药学上可接受的载体的材料的一些例子，包括但不限于:糖类:乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉:玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂:可可脂和栓剂蜡；油:花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油:乙二醇、丙二醇；酯类:油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂:氢氧化镁和氢氧化招；藻酸；无热原水(pyrogen-free water);等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲液；以及其他无毒的兼容润滑剂、十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁。所述组合物也可以含有着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂。
[0099]在一种实施方式中，提供了一种合成纳米缀合物的方法。所述方法可以包括提供具有多个羧基侧基的聚苹果酸。所述方法可以包括含巯基和氨基的化合物与羧基侧基进行反应，以将巯基添加到聚苹果酸上而形成活化的聚苹果酸。所述方法还可以包括使至少一种含有巯基结合基团的成像部分与活化的聚苹果酸进行反应，以形成缀合物前体。所述方法还可包括使至少一种含有巯基结合基团的定靶向模块与活化的聚苹果酸进行反应。
[0100]所述合成方法可以包括通过添加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)到聚苹果酸中对聚苹果酸的羧基侧基进行活化，以形成NHS-酯。所述方法还可以包括使活化的羧基与2-巯基乙烷-1-胺的氨基进行反应。所述方法还可以包括使至少一种含有氨基的成像部分与经NHS活化的羧基侧基反应。所述方法还可以包括使至少一种含有巯基的靶向模块与缀合物前体(preconjugate)反应。所述至少一种成像部分可包括造影剂的活化分子。造影剂的活化分子可以包括钆(Gd)-1，4，7，10-四氮环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)-胺。所述至少一个靶向模块可以包括活化的抗体。所述活化的抗体可以包括抗体-聚乙二醇-马来酰亚胺。所述抗体-聚乙二醇-马来酰亚胺可以与缀合物前体进一步反应形成纳米缀合物。
[0101]所述至少一个靶向模块可以包括活化的姜黄素-聚乙二醇胺。所述至少一个靶向模块可以特异性结合受试者病变细胞或组织的组分，所述组分选自由表皮生长因子受体(EGFR)、人受体生长因子(HER)、层粘连蛋白411、胰岛素样生长因子(IGF)、转铁蛋白受体蛋白、姜黄素和肿瘤坏死因子-α (TNF-α )所组成的组中。
[0102]具有一个或多个靶 向模块的聚苹果酸可通过任何已知的方法来合成。例如，连接有一个或多个靶向模块的聚苹果酸可以由衍生的苹果酸内酯的开环聚合来合成。阿霉素-聚苹果酸可以由聚-β -D, L-苹果酸合成。
[0103]可以通过在本发明的实施方式中添加来自本文中任何一种或多种其它实施方式中的一种或多种元素，和/或用本文中的一种或多种其它实施方式的一种或多种元素替换一种实施方式中的一种或多种兀素，从而形成进一步的实施方式。
[0104]实施例
[0105]下文提供了非限制性实施例来说明具体的实施方式。所有的实施方式都可以添加来自以下一种或多种实施例的一种或多种细节，和/或，一种实施方式中的一种或多种兀素可以被以下实施例的一种或多种细节取代。
[0106]实施例1.用于MRI增强的组织特异性的纳米缀合物的化学合成
[0107]材料将从多头绒泡菌(Physarum polycephalum)的培养液中分离出的高纯度聚苹果酸(PMLA ；Mw 800, 000,多分散系数(polydispersity factor) P=L 2,通过 Sec-HPLC 测定)用作Polycefin平台(Ljubimova JY et al.2007 Chem-Biol Interactions 171:195)。鼠抗人 TfR mAb RVSlO 购自 Southern Biotech 公司(Birmingham, AL,美国)，ERBITUX ?(西妥昔单抗)购自Bristol-Myers Squibb公司(纽约，NY,美国)。mPEG5(l(IQ-胺和马来酰亚胺-PEG34qq-马来酰亚胺购自Laysan Bio, Inc.(阿拉伯，AL，USA)。3-(2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(PDP ； Car I s son J et al.1978 Biochem J 173:723)。Alexa Fluor? 680 C2 马来酰亚胺(Alex680)购自 Invitrogen 公司(Carlsbad, CA, USA), 2_ 氛基乙基单酸胺-DOTA-三叔丁基酯购自(MaciOcyclics，Inc.TX, USA)。除非另有注明，最高纯度的化学品和溶剂均购自美国 Sigma-Aldrich 公司(St.Louis, MO)。
[0108] 用于化学合成的分析方法Gd-DOTA-胺和2-MEA与聚苹果酸进行缀合反应，然后在UV光和/或通过水合茚三酮染色条件下，在预涂硅胶60 F254铝板(Merck, Darmstadt, Germany)上进行薄层色谱(TLC)。在带有L2455 二极管阵列检测器(Hitachi, Pleasanton, CA,美国)的Elite LaChrom分析系统上进行排阻色谱(Sizeexclusion chromatography), Mw 值通过 BioSep-SEC-S 3000 或 PolySep-GFC P4000(300X7.80mm ；Phenomenex, Torrance, CA,美国)，使用 ρΗ6.8、50mM 的磷酸钠缓冲液为流动相(0.75毫升/分钟),聚苯乙烯磺酸盐(polystyrene sulfonates)作为分子量标准进行测定。疏基残基通过 Ellman 法(Ellman GL 1959 Arch Biochem Biophys 82:70)测定。与聚苹果酸缀合的抗小鼠TfR mAb的TfR的结合活性通过Protein Detector? ELISA试剂盒来测定(KPL，Inc.,Gaithersburg，MA，美国)。用作抗原的小鼠TfR的胞外域从加州理工学院(Pasadena，CA USA)蛋白表达中心获得。缀合有西妥昔单抗的聚苹果酸与三阴性乳腺癌细胞表达的EGFR的结合通过荧光激活细胞分选(FACS)分析来证实。钆在加州大学洛杉矶分校(洛杉矶，CA，美国)用ICP-MS进行测定。在不存在蛋白质的情况下，DOTA-Gd的反应通过其固有荧光以280nm的激发波长和316nm的发射波长进行跟踪(Hagan JJ et al.1988Anal Biochem.60:514)。
[0109]实施例2合成-概述
[0110]肿瘤类型特异性的MRI增强剂的合成通过两部分来完成:第一，Gd-DOTA-胺的合成(图2);第二，Gd-DOTA-胺缀合到NHS-活化的PMLA上(图3)。可选择的路线包括:首先将DOTA-胺与PMLA缀合，然后加载Gd3+。合成的第一部分始于市售的DOTA的氨基衍生物的脱保护(图2)。在图3中所示的Gd-DOTA氨基与活化的聚苹果酸的缀合，可以通过变异(variation)以进一步增加每条聚合物链上的礼的数量并进一步增加反应产率。
[0111]实施例3 Boc脱保护的一般程序
[0112]参考图2，( I)将2-氨基乙基-单酰胺DOTA-三叔丁基酯(1.23克，1.77毫摩尔)溶解于三氟乙酸(TFA) (25ml)中，加入三异丙基硅烷(TIS) (1.12克，7.1毫摩尔)。将反应混合物在50°C下搅拌3小时并冷却至室温。在减压条件下蒸发溶剂，得到粘稠的棕色油状物。加入冰冷的乙醚(25ml)，过滤白色沉淀并用乙醚洗涤。将干燥后的沉淀物溶解在纯水中并冷冻干燥。反应产率为97%。
[0113]实施例4制备金属复合物的一般程序
[0114]参考图2，将当量的DOTA胺(2) (295毫克，0.56毫摩尔)溶解在4毫升水中，将化学计量稍微过量的醋酸礼(III) (250晕克,0.61晕摩尔)逐滴加入到4毫升水中。在室温(RT)下搅拌该溶液，同时持续加入IM KOH以使得pH保持在5.5。搅拌48小时后，加入EDTA (0.2当量)，在室温下搅拌该混合物I小时，然后冷冻干燥。反应产率为95%。[0115]实施例5缀合物前体[P/Gd-DOTA (15%) /MEA (5%)]的合成
[0116]将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (0.62mmol)和N，N' -二环己基碳二亚胺(DCC，Immol)溶解在2mL 二甲基甲酰胺(DMF)中，然后连续加入到72mg溶于1.5mL无水丙酮中的PMLA (根据苹果酰单位计算为0.62毫摩尔)中。在室温下搅拌3小时以完成活化后，将混合物过滤，通过旋转蒸发除去丙酮。在室温下逐滴加入溶于二甲基甲酰胺(DMF) 15Mol-%(以苹果酰(malyl)单位计)的Gd-DOTA溶液，在搅拌条件下加入0.15mmol的三乙胺(TEA)。根据TLC (茚三酮，聚合物缀合物的Rf=0，Gd-DOTA的Rf=0.2，正丁醇:乙酸:水=1:1:1)可知反应在2小时后完成。加入0.511111101溶于01^(10(^ I _，以苹果酰单位计为5Mol_%)的2-巯基-乙烷-1-胺(MEA)，并在室温下搅拌I小时，然后加入缓冲液(IOOmM的磷酸钠和150mM的NaCl，pH为6.8)，并在室温下继续搅拌30分钟。在1500Xg离心10分钟后，将上清液过用去离子水(DI)平衡的 Sephadex 柱(PD-10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)。将含有包括缀合物聚苹果酸(P)、Gd-DOTA (15%)和2-巯基乙烷-1-胺(MEA ；5%)的级分(fractions)的产物冻干(白色粉末)。反应产率为34.4%。
[0117]参考图3，基于PMLA的缀合物前体含有25%的Gd-DOTA，70%的可衍生化羧基和5%的疏基。
[0118]实施例6合成抗体-PEG34tltl-马来酰亚胺的一般程序
[0119]参考图3,将抗体(抗-MsTfR mAb或西妥昔单抗的每一种；5mg-33nmol,Mr-150kD)溶解于2mL的pH5.5、含有150mM的NaCl的IOOmM磷酸钠缓冲液中。加入三(2-羧乙基)憐化氢盐酸盐(Tris (2-carboxy ethyl) phosphine hydrochloride, TCEP, 50mM 水溶液)使其最终浓度为5mM。在室温下放置30分钟。然后通过S印hadex HHO柱除去TCEP，立即将还原的抗体逐滴加入至溶于5mL的无菌磷酸钠缓冲液(lOOmM，pH5.5、含有150mM的NaCl，总是在临用前新配)中的马来酰亚胺(MAL)-PEG34qq-MAL (IOmmol)中。4°C搅拌过夜后，将混合物通过离心薄膜过滤器(Vivascience,截留值(cut off) 30kD,置于20mL的ρΗ5.5、含有150mM的NaCl的IOOmM磷酸钠缓冲液中)浓缩，并通过经pH6.2、含有150mM的NaCl的IOOmM磷酸钠缓冲液平衡的S 印hadex G75柱纯化。反应产率为75%_85%。
[0120]实施例7合成Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物的一般程序
[0121]将总共6mg (2mg/mL)的抗小鼠转铁蛋白受体单抗(抗-MsTfR mAb)和西妥昔单抗(每种都缀合有PEG35tltl/马来酰亚胺)溶于IOOmM磷酸钠缓冲液/150mM氯化钠(pH6.2)中，将该溶液加入至含IOmg (2-3mg/mL)的溶于相同缓冲液的缀合物前体P/Gd-D0TA (15%)/MEA(5%)中。室温下放置I小时后，通过SEC-HPLC分析反应的延伸。加入溶于ImL DMF的ImgAlexa Fluor ? 680 C2-马来酰亚胺(Alx 680)，常温下搅拌I小时。通过加入过量的吡啶基(二硫代)丙酸酯(PDP)并在室温下反应30分钟，以封闭剩余的-SH基团。用离心薄膜过滤器(Vivaspin 20,截留值 30kDa, 20mL 的离心膜)(Sartorius Stedim Biotech,Concord,CA，美国)以1500 X g浓缩后，在使用经pH值7.4的PBS平衡的S印hadex G-75纯化前，调节最终体积至2ml。分离出含有产物的级分，合并后通过膜过滤浓缩。反应产率为80-90%。图3显示了一种合成的Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物，所述纳米缀合物含15%的Gd-DOTA，
0.25% 的西妥昔单抗(Cetuxumab),0.25% 的抗-MsTfR mAb, 1% 的 Alexa Fluor'、? 680 (Alx680)，3.5%的PDP和70%的羧基侧基。Gd分析结果表明:相对于聚苹果酸的羧基而言加载量为12%。12%的加载量相当于平均每个增强剂分子上加载了 82分子的Gd。[0122]实施例8共价结合有西妥昔单抗的Gd-DOT-Polycefin的表征
[0123]用HPLC图谱评估所合成的纳米缀合物的纯度。图4显示了携带有共价结合的西妥昔单抗的Gd-DOTA-Polycefin分子的洗脱曲线。在220nm波长处进行检测。参照图4，作为早期级分(8分钟)，其洗脱峰的位置表示纳米缀合物具有高纯度和高分子量(Mw为470000)。
[0124]图5 示出了 Polycefin-Gd-DOTA (12%) -MEA (5%)的 Tl 弛豫率的计算。弛豫率是指在核磁共振应用中，磁性化合物增加周围水质子自旋的弛豫速率的能力的量度。参照图5，计算出的Tl弛豫率值等于Ts-1HiM'计算的值小于使用1.4特斯拉静磁场强度的临床MRI系统的值。所用的Siemens Microscan系统的静磁场强度为9.4特斯拉。弛豫率通过测量1/T1相对于Gd浓度(μ Μ)的斜率(slope)来计算。使用方程Y=7E_.6x+0.0004可以将在OD 450处的吸光度直接换算为μ M浓度。R2值等于0，9989，表明计算精度很高(R2等于I是完美的)。
[0125]抗-小鼠TfR mAb与靶抗原(小鼠-TfR)的亲和力通过饱和ELISA测定(图6)。数据显示，含有西妥昔单抗、MsTfR和Alexa Fluor 680的Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物的结合力(binding)与游离的抗小鼠TfR mAb相当。如图6所示,观察到抗原-抗体复合物的解离常数值是相似的，并且在0.03-0.08 μ g/mL (相当于0.2nM至0.5nM)的范围内。这些值接近公布的数值，并表明抗-鼠TfR mAb的抗原结合力不受其连接到Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物的影响。
[0126]西妥昔单抗对EGFR受体的特异性通过荧光激活细胞分选(FACS)测定，所述测定基于将带罗丹明标记的Gd-DOTA-Polycefin-西妥昔单抗(2.5微克/毫升)与MDA-MB-468细胞(数量为30，000)中的EGFR的结合，并与磷酸盐缓冲液(PBS)(阴性对照)的数值和游离西妥昔单抗(阳性对照)的数值进行比较(图7)。在该图中，右侧的峰值对应于带罗丹明标记的Gd-DOTA-Polycefin-西妥昔单抗与EGFR的结合。作为比较，发现直方图中间的峰值对应于游离的未标记且未与EGFR结合的西妥昔单抗(25 μ g/mL)。对应于游离的未标记的西妥昔单抗的峰值的位置 和对应于阴性对照PBS的峰值的位置是非常接近的。
[0127]分析数据表明与Polycefin-Gd-DOTA缀合的抗小鼠TFR mAb和西妥昔单抗均保留了其功能活性，并且可以在体内MRI中具有活性。
[0128]实施例9肿瘤类型特异性MRI的材料和方法
[0129]细胞系和培养条件。人乳腺癌细胞系MDA-MB-468 (TNBC，EGFR阳性)和人肺癌细胞系A549 (EGFR阳性)获自美国典型培养物保藏中心(Manassas, VA)。将细胞分别在添加有10%FBS和抗生素/抗真菌剂的L-15和F-12K培养基中培养。
[0130]裸鼠肿瘤移植。所有动物实验都依照Cedars-Sinai医学中心实验动物管理与使用委员会(IACTC)批准的方案进行。无胸腺NCr-nu/nu小鼠从NC1-Frederick获得。MDA-MB-468细胞以1.5X IO6或2.5X IO6定向(stereotactically)植入到小鼠右侧基底神经节区域中。A549细胞以5X105定向植入。
[0131]Xenogen荧光成像。为进行对健康脑部和肿瘤组织中的造影剂累积的MRI和近红外研究，将小鼠置于吸气室内通过吸入异氟烷(2-4%有效)进行麻醉。一旦麻醉就将老鼠从吸气室中取出，将其尾部浸泡在温水中以使得静脉(vain)扩张，并置于小鼠尾部照明器(Braintree Scientific Inc, Braintree, MA)中，以避免由于意外从麻醉中快速复苏而造成注射失败。使用30号针头的Iml注射器，将溶于PBS的造影剂以0.1mmol Gd/kg的剂量、5秒100μ I的速率经尾静脉注射给药(每只小鼠单独注射)。然后，在图像检测前再次将小鼠置于吸气室内通过吸入异氟烷(2-4%有效)进行麻醉。MRI测量过程中放置鼻锥管(nosecone)以保持麻醉。在测量过程中，维持1.8%的异氟烷。将鼠床加热以防止小鼠在麻醉过程中冷却。
[0132]MRI测量。细胞孵育45天后(对于A549)和27天、48和52天后(对于MDAMB468)，当肿瘤直径约为4mm时，在Siemens Microscan System 9.14 Tesla上进行MRI系列测量(sessions)。获得了整个脑部的自旋回波和Tl图像。轴向切片定位于整个脑部。使用TR=900毫秒的多面回波序列。对于1.8 X 1.8厘米的区域和196 X 196的矩阵大小，获得了50张0.5毫米的厚度的切片。平面内分辨率为92X92 μ m/像素。通过利用用于不同重复次数扫描的强度的单指数拟合，以测得目的区域的样品的Tl值。在这种情况下，平面内的分辨率为234 X 234 μ m/像素。
[0133]Xenogen IVIS 200成像。为评估药物在裸鼠体内的分布和定位，在不同时间点(给药前和注射药物24小时后)用Xenogen IVIS 200成像仪在异氟烷麻醉下对动物进行研究。给药二十四小时后安乐处死小鼠。进行PBS动脉内灌注以洗出血管内的循环药物。获取肿瘤和主要器官以用于荧光信号的检测。肿瘤和不同器官的荧光信号强度通过XenogenLiving ImageH 软件 2.50 版(WaveMetrix,美国)进行分析。
[0134]实施例10 由 Gd-DOTA-Polycefin 引起的 MRI 增强
[0135]由于没有足够的Gd-DOTA结合到Polycefin纳米缀合物的聚苹果酸上(低于5%)，TNBC肿瘤A549的初步实验为阴性，％是指共价结合Gd-DOTA的聚苹果酸平台中总羧基的分数(fraction)。随后的实验使用加载12_13%Gd的Gd-DOTA-Polycefin进行。图8示出了注射有人TNBC-特异性MRI增强剂纳米缀合物的两只代表TNBC小鼠模型的动物的成像结果。肿瘤接种后27天，对小鼠进行人TNBC的MRI成像。参考图8，观察到经Polycefin-Gd纳米缀合物注射的动物显示，在肿瘤内有显著的Polycefin-Gd积累，从而使得肿瘤可见。与此相反，在未注射造影剂的动物的图像上未观察到可见的肿瘤。数据表明了使用Polycefin-Gd纳米缀合物进行MR成像的可行性。
[0136]图9示出了使用Polycefin-Gd纳米缀合物和市售的Gd (III)增强剂，与图8所示的具有相同类型肿瘤的动物的MR图像。但是，Gd (III)增强剂的注射时间为肿瘤接种后49-52天。该肿瘤的MRI用于进行时间依赖性评估。上部图像显示了临床使用的Gd (III)给药。左上图为试剂注射后15分钟得到的，显示出可见的肿瘤。右上图是注射Gd(III)后I小时40分钟得到的，并没有显示出肿瘤影像，因为Gd(III)增强剂已通过肾脏被清除。下部图像显示特异性针对TNCB细胞上表达的EGFR的Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物的给药。左下图为P/Gd-D0TA/MsTfR/Cetux/Alx680纳米缀合物注射后15分钟得到的，显示出可见的肿瘤。右下图为注射纳米缀合物后3小时15分钟得到的。数据表明，Gd-DOTA-Polycefin的增强效果的保留时间比常规应用于临床的Gd (III)试剂长得多。这种延长可被解释为肾脏较慢的清除作用，因为由于纳米缀合物高于清除限(clearance cut-off )的高分子量，以及由于肿瘤特异性结合而使得结合Gd (III)的聚合物得以保留，从而使得肾脏需要更长的时间以清除所述纳米缀合物。
[0137]为了评估实验动物体内所累积的增强剂的特异性定位,将Alexa Fluor 680连接到Gd-DOTA-Polycefin的纳米缀合物上，以用于荧光Xenogen成像。参照图10A-10B，图1OA中的图像显示在动物的肾脏和肝脏中积累了高剂量的显像剂。图1OB中的图像显示在中间被蓝色荧光识别的肿瘤以及Polycefin-Gd-Alexa Fluor 680的累积。
[0138]实施例11 MRI增强剂的特异性评估
[0139]为了区分由于与靶标结合而产生的保留效果和由于通过肾脏延长的自然清除效果，对Tl值的动力学作出了评估。
[0140]图11显示了使用带有共价结合的西妥昔单抗的Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物的制剂和临床使用的Gd (III)制剂分别对受试者注射后的MR成像的动力学。成像的动力学不是解卷积的(deconvoluted),并包括在通过共价结合的西妥昔单抗与肿瘤细胞表面的EGFR相互作用导致的Gd-DOTA-Polycefin保留的情况下，由于不同分子量对不同血液清除时间的影响。参照图11，观察到Polycefin-Gd-DOTA的高1/T1值可保持几个小时，而临床用Gd (III)的曲线达到最大值后迅速衰减。动力学曲线的差异可以通过以下的事实来解释:1/T1值取决于循环血液中临床用Gd (III)或Polycefin结合的Gd (III)的量；以及取决于Polycefin-Gd-DOTA在肿瘤中的保留时间。临床用Gd (III)不能穿透BBB,也不能保留在肿瘤中，只可以在肿瘤毛细血管中循环。临床使用的Gd (III)和Polycefin-Gd-DOTA水平都会因为肾脏的清除而下降。但是由于大分子量的缘故，Polycefin-Gd-DOTA的清除要慢于临床使用的Gd (III)的，例如Polycefin-Gd-DOTA被清除得就比较慢。
[0141]图12Α和12Β比较了分别经临床用Gd (III)增强剂和含有西妥昔单抗的Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物注射后,脑部的健康区域和肿瘤区域的MRI的Tl驰豫时间(relaxation)的动力学。图12A显示，在应用Gd (III)后，然后注射造影剂，50分钟后获得的脑部的健康区域和肿瘤区域的1/T1值没有显著差异。该数据可归因于Gd (III)制剂不能识别肿瘤的事实。图12B显示,在注射含西妥昔单抗的Gd-DOTA-Polycefin纳米缀合物后，从脑部的健康区域和肿瘤区域所获得的1/T1值显著不同。在脑部的健康区域的纳米缀合物的半衰期为20-30分钟，而在肿瘤区域的为130分钟。所获得的纳米缀合物在肿瘤区域中较长的半衰期值可归因于由于EGFR与纳米缀合物的特异性结合而使得纳米缀合物被肿瘤所保留。
[0142]实施例12靶向不同类型的肿瘤的MRI增强剂
[0143]不同类型的肿瘤的成像与能够特异性靶向肿瘤并区分不同类型肿瘤的纳米缀合物制剂相关。图13A-13D的显示了设计的分子的示意图，所述分子被设计为靶向原发性脑瘤和转移至脑部的TNBC (图13A)、转移至脑部的HER-2阳性脑癌(图13B)、胶质细胞瘤(图3C)和缺乏特异性靶向模块的对照分子(图13D)。图13A-13D中所有的纳米缀合物都被设计为靶向特定肿瘤，连同对照分子均包括用于MRI的作为MRI造影剂的Gd-DOTA，以及用于提高溶解度的羧基C00H，其中，这些部分的每一种都被连接到聚苹果酸平台上。如图13A所示，设计的用于原发性脑瘤和三阴性乳 腺癌转移脑瘤的定位和成像的纳米缀合物包括的用于靶向的mAbs:特异性针对层粘连蛋白β I的mAb，MsTfR mAb和特异性针对EGFR的西妥昔单抗。如图13B所示，设计的用于转移至脑部的HER2阳性乳腺癌的定位和促进成像的纳米缀合物包括用于靶向的mAbs:特异性针对层粘连蛋白β I的mAb，特异性针对HER2的Herceptin电和TfR mAb。如图13C所示,设计的用于胶质细胞瘤的定位和促进成像的纳米缀合物包括的用于靶向的mAbs:特异性针对层粘连蛋白β I的mAb，特异性针对层粘连蛋白α 4 的 mAb 以及 MsTfR mAb。[0144]参照图13D，设计的作为其他试剂对照的纳米缀合物包括用于定位的小鼠mAbs:不结合肿瘤中特异性靶标的两种IgGl单克隆抗体。
[0145]通过TNBC、转移至脑部的HER2阳性乳腺癌和胶质细胞瘤的小鼠模型，对纳米缀合物对MRI的特异性的影响进行验证。上述模型也可用于区分纳米缀合物对MRI的特异性和非特异性的影响。例如，虽然纳米缀合物是被设计为结合特异性靶标，但通过被称为典型肿瘤效应(typical tumor effect)的BBB的许可性(permissive)(受到损伤的)内皮，所述纳米缀合物也可能发生非特异性的渗透，这是由于“增强的渗透和保留”(EPR)。将使用设计的用于特异性靶标的纳米缀合物给药后获得的图像与对照图像进行比较。将结果总结在一起可以表明特异性强度以及用对照分子注射的“背景”效果，在对照分子中用IgGl mAbs代替特异性祀向模块。所述背景效果在转化为(translation into)人类系统时值得关注，这是因为在人类肿瘤中转铁蛋白受体通常存在于毛细血管内皮和肿瘤细胞的表面上。通过消除抗人Tfr mAb，并仅依靠用于BTB的EPR渗透和靶向癌组织的效应，可提高肿瘤特异性。
[0146]实施例13靶向阿尔茨海默症斑块的MRI增强剂
[0147]设计了用于阿尔茨海默症斑块成像的MRI增强纳米缀合物。此前已表明姜黄素能结合 β_ 淀粉样斑块(Ryu EK et al.2006 J Med Chem 49:6111)。
[0148]设计了基于聚苹果酸的纳米缀合物，所述纳米缀合物包括同时连接的姜黄素(5-羟基-1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1, 4，6-庚三烯-3-酮)和Gd-DOTA(2, 2' , 2" - (2- (2- (2疏基乙基氣基)-2-氧乙基)-1，4，7_四氣环十二烧_1，4，7-取代基)三乙酸)，并被设计为用于在体内靶向阿尔茨海默症β_淀粉样斑块并成像(图14)。所述纳米缀合物是含有Polycefin特征及以下化学功能模块的复合分子,所述化学功能模块包括:MRI造影剂Gd-DOTA、用于结合淀粉样斑块的姜黄素、羧基和连接到聚苹果酸上的Tfr特异性mAb。每个姜黄素和TfR mAb模块都通过PEG间隔物连接到所述聚苹果酸上。
·[0149]为了研究小鼠和大鼠的阿尔茨海默症模型(AD模型)的体内成像，可以使用小鼠或大鼠的TfR mAb。可以将小鼠或大鼠的TfR替换为用于人类患者成像的人类TfR。纳米缀合物可以携带多个姜黄素分子，这可以使得在β -淀粉样斑块周围牢固地结合纳米缀合物，以有助于形成高对比度的尖峰(sharp contours)。含有姜黄素的纳米缀合物分子也可以携带大量共价连接的Gd-DOTA，通常为每分子纳米缀合物连接40-60个或更多的Gd。淀粉样斑块上的高浓度Gd可以使得在高对比度和高分辨率质量的条件下通过MRI成像。任选的共价结合的跟踪染料可有利于通过除了使用MRI以外的Xenogen成像系统对纳米缀合物的分布进行体内监测，并可以使得在合成/研究的第一阶段，证实姜黄素-Polycefin (无钆离子)进入脑部。跟踪染料也可以验证在脑内姜黄素是否连接到Polycefin上。因此，在没有Gd的情况下，跟踪染料对于姜黄素-Polycefin的实验优化是有用的。
[0150]如果姜黄素的结合作用不够强，还可使用特异性地识别人类阿尔茨海默氏斑块的抗体。可以通过连接抗转铁蛋白抗体(抗TfR mAb)来实现增强剂的渗透作用，该抗体可通过转胞吞作用携带增强剂穿过BBB。因为BBB转胞吞作用是可逆的，增强剂可以非常牢固地附着在斑块上。如果姜黄素的结合作用不够强，可以用斑块特异性mAb代替姜黄素连接至所述平台上。在平台上连接多个姜黄素残基可通过多重结合提高斑块结合强度。如果设计的强度需要进一步增强，也可以使用抗体来进行替代。
[0151]实施例14 N-烷基化的一般程序[0152]图15示出了姜黄素-PEGiqqq-胺的合成。将含有0.2毫摩尔B0c-PEGiqqq-NH2的2毫升乙腈溶液加入至含K2CO3 (1.2毫摩尔)的2ml乙腈悬液中，将反应混合物在室温下搅拌10分钟。将含有经修饰的姜黄素(0.2毫摩尔)的2毫升乙腈溶液加入到反应混合物中，并让反应在室温下继续进行72小时。将反应混合物过滤以除去未溶解的固体，并用乙腈洗涤。将滤液浓缩，残留物置于甲醇中通过交联葡聚糖LH 20柱(sephadex LH 20)。收集含有产物的级分，除去甲醇。产物无需进一步纯化而直接用于下一步。反应产率为73%。
[0153] 实施例15 Boc脱保护的一般程序
[0154]将9毫升3M盐酸的甲醇溶液加入至B0c-NH-PEGiqqq-姜黄素中，并在室温下搅拌反应混合物16小时。用旋转蒸发器将溶剂蒸发干。将紧实(thick)的固体溶解在水中并冷冻干燥，得到所需产物，为暗黄色固体。反应产率96%。
[0155]将姜黄素衍生物以及2-巯基-1-乙胺和Gd-DOTA共价连接聚苹果酸的经NHS激活的羧基上，以得到MRI增强剂，如图16所示。该图中显示姜黄素和Gd-DOTA都连接到聚苹果酸(PMLA，30KDa)上。姜黄素和Gd-DOTA各占据了 5%的聚苹果酸羧基侧基。连接模块的百分比可以增加至最多占羧基侧基的30%或以上，从而提高试剂(reagent)的MRI强度。
[0156]实施例15与聚苹果酸结合的姜黄素(5%)的结合
[0157]与聚苹果酸结合的姜黄素可用于离体的人脑组织斑块的染色(图17)。具有AD的人脑切片(上部图像)和正常人脑切片(下部图像)经20 μ MPolycefin-姜黄素(右侧图像)染色和20μ M游离姜黄素(左图像)染色后通过荧光成像进行分析。参照图17，观察到左上图比右上图中的亮斑数目更多，表明从人类阿尔茨海默症(AD)患者获得的脑切片中的阿尔茨海默症斑块与聚苹果酸-姜黄素的结合要强于游离姜黄素。在下部图像中可见，在包括从健康个体获得的脑部切片的对照中就没有发生结合。聚苹果酸姜黄素缀合物的浓度可以降低到2 μ Μ。使用聚苹果酸-姜黄素比使用游离姜黄素更为有利，因为即使在高浓度(如高于200μ Μ)下也不会显示染色背景。这表明，与聚苹果酸的结合大大增强了姜黄素的溶解度。
[0158]实施例16阿尔茨海默症的诊断和监测
[0159]纳米缀合物Gd-DOTA/聚苹果酸/姜黄素(5%) /抗小鼠TfR mAb可用作对斑块成像的MRI增强剂。成像的策略还可以包括用高荧光染料AlexaFluor 680代替Gd-DOTA，并且使用Xenogen成像系统，研究允许在阿尔茨海默症的小鼠脑中进行荧光检测的条件。也可以使用抗斑块mAb代替姜黄素。对于荧光检测，使用Gd-DOTA (最高可能的％) /聚苹果酸/姜黄素或抗斑块抗体/抗TfR mAb用于MRI系统成像。
[0160]本申请通篇引用的文献，均出于本文所有显而易见的目的而被纳入本文，并且对于文献本身，如同将它们全文纳入本文一样。为了说明，这些参考文献的特定部分被引用到本文特定的位置。文献在特定位置的引用表明将参考文献的教导的方法纳入本文。然而，文献在特定位置的引用，不限制将引用的参考文献教导的所有方法，出于任何目的而纳入本文。
[0161]因此，应当理解的是本发明不限于已公开的【具体实施方式】，旨在涵盖如从属权利要求、如上的说明和/或如附图所示所定义的，在本发明的精神和范围内的所有变型。
【权利要求】
1.一种纳米缀合物，该纳米缀合物含有基于聚苹果酸的分子骨架、至少一个成像部分以及至少一个靶向模块，其中，所述至少一个成像部分中的一个或多个缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上，并且，所述至少一个靶向模块中的一个或多个缀合到所述基于聚苹果酸的分子骨架上。
2.根据权利要求1所述的纳米缀合物，其中，所述至少一个成像部分的每一个都缀合到所述基于聚苹果酸的分子骨架上，并且，所述至少一个靶向模块的每一个都缀合到所述基于聚苹果酸的分子骨架上。
3.根据权利要求1所述的纳米缀合物，其中，所述至少一个成像部分包括造影剂。
4.根据权利要求3所述的纳米缀合物，其中，所述造影剂含有螯合分子。
5.根据权利要求4所述的纳米缀合物，其中，所述螯合分子选自由1，4，7，10-四氮环十二烷-1，4，7，10-四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮环十二烷_1，4，7，10-四(2-丙酸)和1，4，8，11-四氮环十四烷-1，4，8，11-四乙酸所组成的组中。
6.根据权利要求5所述的纳米缀合物，其中，所述造影剂还含有由所述螯合分子螯合的顺磁性离子。
7.根据权利要求6所述的纳米缀合物，其中，所述顺磁性离子选自由钆、铬、锰、铁、镝、铕和铽所组成的组中。
8.根据权利要求7所述的纳米缀合物，其中，所述造影剂包括Gd-DOTA。
9.根据权利要求1所述的纳米缀合物，其中，所述至少一个靶向模块中的每一个均独立地选自由抗体、肽、多肽、寡核苷酸和化学治疗剂所组成的组中。
10.根据权利要求9所`述的纳米缀合物，其中，所述抗体特异性结合选自由表皮生长因子受体、粘连层蛋白411、胰岛素样生长因子、转铁蛋白受体蛋白和肿瘤坏死因子-α所组成的组中的蛋白。
11.根据权利要求9所述的纳米缀合物，其中，所述抗体包括西妥昔单抗或赫赛汀中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的纳米缀合物，其中，所述至少一个靶向模块能够靶向病变细胞或病变组织的组分。
13.根据权利要求1所述的纳米缀合物，其中，所述至少一个靶向模块能够靶向β淀粉样斑块。
14.根据权利要求13所述的纳米缀合物，其中，所述至少一个靶向模块包括姜黄素。
15.一种用于促进受试者的细胞或组织成像的试剂盒，该试剂盒包括含有基于聚苹果酸的分子骨架、至少一个成像部分和至少一个靶向模块的纳米缀合物，其中，所述至少一个成像部分中的一个或多个缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上，并且，所述至少一个靶向模块中的一个或多个缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包括药学上可接受的缓冲液。
17.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，该试剂盒还包括使用说明书。
18.—种祀向受试者细胞或组织的方法,该方法包括 对受试者进行组合物的给药，所述组合物包括基于聚苹果酸的分子骨架、至少一个成像部分和至少一个靶向模块，其中，所述至少一个成像部分中的一个或多个缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上，并且，所述至少一个靶向模块中的一个或多个缀合到基于聚苹果酸的分子骨架上。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一个成像部分包括造影剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述造影剂含有螯合分子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述螯合分子选自由1，4，7，10-四氮环十二烷-1，4，7，10-四乙酸、二乙烯三胺五乙酸、1，4，7，10-四氮环十二烷_1，4，7，10-四(2-丙酸)和1，4，8，11-四氮环十四烷-1，4，8，11-四乙酸所组成的组中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述造影剂还含有螯合到所述螯合分子上的顺磁性离子。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述顺磁性离子选自由钆、铬、锰、铁、镝、铕和铺所组成的组中。
24.根据权利要求19所述的方法，其中，成像造影剂包括Gd-DOTA。
25.根据权利要求20所述的方法，其中，该方法还包括使受试者中的成像造影剂可视化。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，通过磁共振成像技术进行可视化。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，该方法还包括，通过获得病变细胞或病变组织的图像，并将所述图像与 健康个体的正常细胞或组织的对照图像进行比较，以对疾病或其它状况进行诊断。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述疾病选自由阿尔茨海默症、癌症、风湿性关节炎和糖尿病性视网膜病变所组成的组中。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述癌症选自由三阴性乳腺癌、HER-2阳性乳腺癌和成胶质细胞瘤所组成的组中。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述癌症包括原发性癌症或转移癌中的至少一种。
31.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一个靶向模块的每一个均独立的选自由抗体、肽、多肽、寡核苷酸和化学治疗剂所组成的组中。
32.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一个靶向模块中的一个或多个特异性针对β淀粉样斑块。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述至少一个靶向模块包括姜黄素。
34.根据权利要求18所述的方法，其中，所述至少一个靶向模块靶向病变细胞或病变组织，并且，给药的步骤导致疾病或状况的至少一种症状减轻或消除。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，该方法还包括，对受试者的疾病或其它状况的治疗效率进行监测，所述监测的方法包括:获得受试者在第一次给药步骤后的细胞或组织的第一图像；获得第一次给药一段时间后的所述细胞或所述组织的第二图像；并将所述第一图像和第二图像进行对比。
36.根据权利要求18所述的方法，其中，该方法还包括使所述纳米缀合物在病变细胞或病变组织中积累一段时间。
37.一种合成纳米缀合物的方法，该方法包括: 提供含有多个羧基侧基的聚苹果酸； 使含有巯基和氨基酸基团的化合物起反应，通过羧基侧基使巯基添加到所述聚苹果酸上，以形成活化的聚苹果酸； 使含有巯基结合基团的至少一个成像部分与所述活化的聚苹果酸反应，以形成缀合物前体； 使含有巯基结合基团的至少一个靶向模块与所述缀合物前体反应。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述至少一个成像部分包括活化的造影剂分子。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述活化的造影剂分子包括钆-1，4，7，10-四氮环十二烷-1，4，7，10-四乙酸-胺。
40.根据权利要求37所述的方法，其中，所述至少一个靶向模块包括活化的抗体。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述活化的抗体包括抗体-聚乙二醇-马来酰亚胺。
42.根据权利要求37所述的方法，其中，所述至少一个靶向模块包括活化的姜黄素-聚乙二醇_胺。
43.根据权利要求 37所述的方法，其中，所述至少一个靶向模块特异性结合受试者病变细胞或组织的组分，所述组分选自由表皮生长因子受体、人受体生长因子、粘连层蛋白.411、胰岛素样生长因子、转铁蛋白受体蛋白、姜黄素和肿瘤坏死因子-α所组成的组中。
【文档编号】A61K49/00GK103582497SQ201280026653
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年4月6日 优先权日:2011年4月6日
【发明者】K·L·布莱克, J·Y·柳比莫娃, A·V·柳比莫夫, E·哈勒尔 申请人:西奈医疗中心