用于不同治疗应用的含热稳定氧载体的药物组合物的制作方法
【专利摘要】提供了一种适合用于哺乳动物且不会导致肾损伤和血管收缩的高度纯化的和热稳定的、交联的非聚合四聚体血红蛋白。执行高温短时(HTST)加热加工步骤以有效地去除不合乎需要的二聚体形式的血红蛋白、未交联的四聚体血红蛋白、和血浆蛋白杂质。在热处理后和任选地在热处理前添加N-乙酰半胱氨酸维持低水平的高铁血红蛋白。热稳定的交联四聚体血红蛋白可以改善和延长常氧和低氧组织中的氧合。在另一方面,该产品用于治疗各种类型的癌症诸白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。本发明的四聚体血红蛋白还可以用于预防手术切除肿瘤后的肿瘤转移和复发。此外本发明的四聚体血红蛋白可以在化疗和放射治疗之前施用于患者。
【专利说明】用于不同治疗应用的含热稳定氧载体的药物组合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是要求于2011年7月11日提交的美国部分继续申请号13/179,590、目前为专利号8,048,856的优先权的国际专利申请,该美国部分继续申请的公开内容通过引用
结合于此。
[0003]版权通知/许可
[0004]本专利文件的一部分公开内容含有受版权保护的资料。版权拥有者不反对任何人对出现在美国专利商标局专利文件或记录中的专利文件或专利公开内容的传真印刷,但另外地完全保留所有的版权权利。下面的通知适用于如下所述以及在所附的附图中的方法、实验和数据:版权? 2010, Billion King International Limited,保留所有权利。
【技术领域】
[0005]本发明涉及一种用于制备含热稳定氧载体的药物组合物的方法和由所述方法制备的组合物。本发明还涉及所述含热稳定氧载体的药物组合物在人和其他动物的癌症治疗、缺氧病症(oxygen-deprivation disorder)和器官保存中的用途。
【背景技术】
[0006]血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至机体细胞,并且还将代谢废物二氧化碳从机体细胞运离至呼吸系统,在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性,因此如果其在离体(ex vivo)状态下可以被稳定并且可以在体内(in vivo)使用,贝U其可以被用作有效的供氧器。
[0007]天然存在的血红蛋白是四聚体,当其存在于红细胞内时通常是稳定的。然而,当天然存在的血红蛋白移出红细胞时,其在血浆中变得不稳定,并且分裂成两个α-β 二聚体。这些二聚体的每一个的分子量为约32kDa。这些二聚体当通过肾脏过滤和排泄时可能导致显著的肾损伤。四聚体键的断裂还负面地影响了功能性血红蛋白在循环系统中存在的持久性。
[0008]为了解决这个问题,近年来在血红蛋白加工方面的发展已经结合了多种交联技术来形成四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键,从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而,本发明人确定,聚合血红蛋白在血液循环中更容易转变成为闻铁血红蛋白。闻铁血红蛋白不能结合氧因此不能氧合组织。因此,现有技术教导的导致形成聚合血红蛋白的交联作用是有问题的。在本领域中存在着对允许分子内交联从而形成稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术的需求。 [0009]现有技术为稳定血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括:产生的四聚体血红蛋白中包含无法接受的高百分比的二聚体单位;二聚体的存在使得血红蛋白组合物不能令人满意地施用于哺乳动物。血红蛋白的二聚体形式可以导致哺乳动物身体的严重肾损伤;此肾损伤可以严重到足以导致死亡。因此,本领域中存在着对在终产物中形成具有检测不到的二聚体形式的稳定的四聚体血红蛋白的需求。
[0010]现有技术血红蛋白产品存在的另一问题是给药后血压的急剧增加。在过去,从上一代基于血红蛋白的氧载体已经记录到血管收缩事件。例如,Hcino丨)ure?产品(BiopureC0.,USA)导致与基线(96±10mmHg)相比较高的平均动脉压(124±9mmHg)或高30%,如由Katz等人,2010公开。现有技术解决此问题的尝试依赖于巯基试剂与血红蛋白巯基反应,据称以防止内皮细胞舒血管因子与该巯基的结合。然而,巯基处理的使用增加了加工步骤,导致增加的成本和杂质,所述杂质以后必须从血红蛋白组合物中去除。因此,在本领域中存在着对制备当应用于哺乳动 物时不引起血管收缩和高血压的血红蛋白的方法的需求。
[0011]现有技术为形成稳定的血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括:存在蛋白杂质诸如免疫球蛋白G,其可以引起哺乳动物中的变态反应效应。因此,本领域中存在着对可以产生稳定的不含蛋白杂质的四聚体血红蛋白的方法的需求。
[0012]除了上述问题以外,在本领域中还存在着对稳定化的四聚体血红蛋白的需求,所述四聚体血红蛋白不含二聚体,不含磷脂并且能够以工业规模生产。
【发明内容】
[0013]本发明提供了一种加工非聚合的、热稳定的、纯化的、交联的四聚体血红蛋白的方法,所述四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物,而不会引起严重肾损伤、血管有害作用和严重不良事件包括死亡。本发明去除了二聚体形式的血红蛋白、未交联的四聚体血红蛋白、磷脂和蛋白杂质。另外地,本发明使用(I)用于精确的和受控的低渗裂解的即时细胞裂解设备,
(2)流通柱色谱(flowthrough column chromatography), (3)高温短时(HTST)设备,其用于在纯化过程中热加工血红蛋白溶液,以去除不合乎需要的未稳定化的血红蛋白二聚体,并且去除蛋白杂质,例如免疫球蛋白-G,使得可以避免肾损伤、血管有害作用和其他毒性反应,和(4)气密输液袋包装以避免氧侵入至产品中。
[0014]该方法包括哺乳动物全血的起始材料,所述全血至少包括红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离,紧接着进行过滤从而获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质。在即时细胞裂解设备中以50-1000升/小时的流速通过受控的低渗裂解来破坏所述洗涤过的红细胞,持续足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间。进行过滤从而从溶胞产物中去除至少一部分废渗余物。从所述溶胞产物中提取第一血红蛋白溶液。
[0015]使用超滤滤器进行第一超滤过程,所述超滤滤器被配置成从第一血红蛋白溶液中去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质并且进一步去除任何病毒和残留的废渗余物,从而获得第二血红蛋白溶液。对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱以去除蛋白杂质、二聚体血红蛋白和磷脂以形成无磷脂的血红蛋白溶液。使用配置成去除杂质的滤器对所述无磷脂的血红蛋白溶液进行第二超滤过程,产生浓缩的纯化的无磷脂的血红蛋白溶液。
[0016]通过富马酸二-3,5-二溴水杨酸酯交联纯化的血红蛋白的至少α-α亚基,从而形成热稳定的交联血红蛋白而不形成聚合血红蛋白,使得得到的非聚合交联四聚体血红蛋白的分子量为60-70kDa。表述“非聚合”当在本文中使用时是指不与其他血红蛋白分子或任何其他非血红蛋白分子诸如PEG分子间交联的四聚体血红蛋白。用合适的生理缓冲液诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乳酸盐林格氏溶液、乙酸盐林格氏溶液或Tris缓冲液交换所述交联四聚体血红蛋白。使用切向流过滤去除任何残留的化学物质。
[0017]在此步骤后,交联血红蛋白被热处理以去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何未稳定化的血红蛋白(例如,二聚体形式的血红蛋白)和任何其他蛋白杂质。在热处理之前,任选地向所述交联四聚体血红蛋白加入约0.2%的浓度的N-乙酰半胱氨酸以防止高铁血红蛋白的形成。在热处理和冷却后立即加入约0.2% -0.4%的浓度的N-乙酰半胱氨酸以进一步防止高铁血红蛋白的形成。热处理优选是在约70°C -95°C下进行30秒至3小时的高温短时处理,随后冷却至25°C。之后在热处理期间形成的任何沉淀物均通过离心或过滤设备去除以形成清亮的溶液。
[0018]不含二聚体、不含磷脂、不含蛋白杂质的、热稳定的、非聚合的交联四聚体血红蛋白然后加入至药学上可接受的载体。
[0019]之后,将热稳定的交联四聚体血红蛋白在定制的和气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE、EVA、EV0H)输液袋中配制和包装。该包装防止氧污染,氧污染导致形成无活性的高铁血红蛋白。
[0020]通过上述方法制备的热稳定的交联四聚体血红蛋白用于治疗多种癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。破坏癌细胞的机制是改善低氧条件下肿瘤的氧合,从而提高对放射线和化疗剂的敏感性。该热稳定的交联四聚体血红蛋白也用于在移植期间保护器官组织或用于在体内缺少供氧的情况下(诸如在缺氧心脏中)保护心脏。
[0021]此外,通过上述方法制备的热稳定的交联四聚体血红蛋白用于减少癌性肿瘤复发和使肿瘤细胞转移最小化。在用于肿瘤切除手术的缺血前和在去除肿瘤后重建血供(再灌注)期间施用所述血红蛋白。所 述血红蛋白还可以用于增加癌组织的氧合和减小肿瘤的大小。
[0022]附图简述
[0023]图1是描绘本发明的方法的概况的流程图。
[0024]图2示意性描绘了本发明的方法中使用的即时细胞裂解设备。
[0025]图3描绘了对于(a)未热处理的交联四聚体血红蛋白、和(b)热稳定的交联四聚体血红蛋白(其已经在90°C经历45秒至2分钟或在80°C经历30分钟的热处理)的高效液相色谱分析。
[0026]图4描绘了对热稳定的交联四聚体血红蛋白的电喷雾电离质谱(ESl-MS)分析。
[0027]图5显示了对(a)纯化的血红蛋白溶液和(b)热稳定的交联四聚体血红蛋白的圆二色性光谱分析。
[0028]图6显示了正常组织中氧合的改善。注射0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液导致(A)血浆血红蛋白浓度和(B)至肌肉的氧输送的显著增加。与血浆血红蛋白水平相比观察到持续较长时间段的氧合显著增加。
[0029]图7显示了低氧的肿瘤组织中氧合的改善。注射0.2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液导致至头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)异种移植物的氧输送显著增加。
[0030]图8显示了⑷鼻咽癌(NPC)和⑶肝肿瘤的啮齿动物模型中的部分肿瘤缩小。
[0031]图9示出了在用热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗后,严重出血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化。
[0032]图10是流通柱色谱的洗脱图;血红蛋白溶液处于流过级分中。
[0033]图11示意性描绘了用于工业规模操作的具有超滤作用的流通CM柱色谱系统。
[0034]图12是用于HTST热处理加工步骤的设备的示意性图示。
[0035]图13示出了 HTST加工设备中的温度曲线和在本发明的系统中在85°C和90°C去除未被稳定化的四聚体(二聚体)所需的时间。
[0036]图14示出了在图12的HTST加工设备中在85°C和90°C在系统中高铁血红蛋白形成的速率。
[0037]图15是用于本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白的输液袋的示意性图示。
[0038]图16显示了总结在肝切除术期间的手术和血红蛋白产品给药操作的示意图。
[0039]图17显示了在肝切除术和缺血/再灌注操作后IR损伤组大鼠中诱发的肝内肝癌复发和转移以及远处肺转移以及使用本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白的保护作用的代表性实例。
[0040]图18显示了在肝切除和IR损伤操作后4周时实验组和对照组中的组织学检查。
[0041]图19A显示了在肝切除术和IR操作后的IR损伤组(对照组)大鼠以及已经用本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗的大鼠(Hb治疗组)中发现的复发肝肿瘤的体积(cm3)。
[0042]图19B显示了在肝切除术和IR操作后的IR损伤大鼠(对照组)以及已经用本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗的大鼠(Hb组)的肝复发率(左)和平均复发肿瘤大小(右)。
[0043]图20显示了在肝切除术和缺血/再灌注操作后IR损伤组大鼠(对照组:C10和C13)和使用本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗的大鼠(Hb治疗组:Y9、YlO和Yll)中诱发的肝内肝癌复发和转移以及远处肺转移的代表性实例。
[0044]图21显示了在整个肝脏手术和再灌注中从第一次施用本发明的血红蛋白产品或RA缓冲液(对照)起的肝氧分压(_Hg)的代表性实例。
[0045]图22显示了在肝脏手术后用或不用本发明的血红蛋白产品治疗28天的情况下大鼠外周血中循环内皮祖细胞水平(EPC)的比较。
【具体实施方式】
[0046]血红蛋白是哺乳动物和其他动物的血液的红细胞中含铁的氧运输蛋白。血红蛋白显示蛋白的三级和四级结构两者的特性。血红蛋白中的大多数氨基酸形成由短的非螺旋段连接的α螺旋。氢键稳定血红蛋白内部的螺旋段,产生其分子内的吸引力,将每条多肽链折叠成特定的形状。血红蛋白分子由四个球状蛋白亚基组装而成。每个亚基由排列成一组α -螺旋结构段的多肽链构成,所述α -螺旋结构段以“肌红蛋白折叠”排列方式与包埋的血红素基团连接。
[0047]血红素基团由固定在称为卟啉的杂环中的铁原子组成。铁原子与位于一个平面中的环中心中的所有4个氮原子同等地结合。然后氧能够结合于与卟啉环的平面垂直的铁中心。因此,单个血红蛋白分子具有与四个氧分子结合的能力。
[0048]在成人中,最常见类型的血红蛋白是称为血红蛋白A的四聚体,其由称为α2β2的两个a和两个β非共价结合的亚基组成,每个亚基分别由141和146个氨基酸残基构成。a和β亚基的尺寸和结构彼此非常类似。对于总分子量为约65kDa的四聚体,每个亚基的分子量为约16kDa。四条多肽链通过盐桥、氢键和疏水相互作用彼此结合。牛血红蛋白的结构与人血红蛋白类似(α链中的同一性为90.14% ;β链中的同一性为84.35% )。不同之处在于牛血红蛋白中的两个巯基位于β Cys93处,而人血红蛋白中的巯基分别位于a Cysl04、β Cys93 和 β Cysll2 处。
[0049]在红细胞内部的天然存在的血红蛋白中,α链与其相应的β链的缔合非常强并且在生理条件下不会离解。然而,在红细胞外,一个α β 二聚体与另一个α β 二聚体的缔合相当弱。该结合具有分裂成两个α β 二聚体的倾向,每个二聚体为约32kDa。这些不需要的二聚体足够小从而被肾脏过滤和排泄,结果造成潜在的肾损伤和并导致显著减少的血管内滞留时间。
[0050]因此,从功效和安全性两方面来看,稳定在红细胞外使用的任何血红蛋白是必要的。下面概述了制备稳定的血红蛋白的方法;本发明的方法的概况呈现在图1的流程图中。
[0051]首先,选择全血来源作为来自红细胞的血红蛋白的来源。选择哺乳动物全血,包括,但不限于,人、牛、猪、马和犬全血。将红细胞与血浆分离、过滤、和洗涤以去除血浆蛋白杂质。
[0052]为了从红细胞释放血红蛋白,需裂解细胞膜。尽管多种技术可以用来裂解红细胞,但本发明利用可以以适合于工业规模生产的体积以精确受控的方式在低渗条件下的裂解。为此,图2中所示的即时细胞裂解设备用来裂解红细胞。低渗裂解形成溶胞产物溶液,其包含血红蛋白和废渗余物。为了能够进行工业规模生产,小心地控制裂解作用使得仅红细胞被裂解却不裂解白细胞或其他细胞。在一个实施方案中,选择即时细胞裂解设备的尺寸使得红细胞在2-30秒内或另外地在足以裂解红细胞的时间内(优选30秒内)穿越该设备。所述即时细胞裂解设备包括静`态混合器。去离子的和蒸馏的水用作低渗溶液。当然要理解使用具有不同的盐浓度的其他低渗溶液将导致红细胞裂解的时间段不同。由于受控的裂解步骤仅裂解红细胞,不裂解白细胞或细胞性物质,因此其使毒性蛋白、磷脂或DNA从白细胞和其他细胞性物质的释放最小化。在30秒后,即在含有红细胞的溶液已经穿越即时细胞裂解设备的静态混合器部分后,立即加入高渗溶液。得到的血红蛋白与使用其他裂解技术得到的血红蛋白相比具有较高的纯度和较低水平的污染物诸如不合乎需要的DNA和磷脂。分别通过聚合酶链式反应(检出限=64pg)和高效液相色谱(HPLC,检出限=I μ g/mL)方法没有在该血红蛋白溶液中检测到来自白细胞的不合乎需要的核酸和磷脂杂质。
[0053]进行两个超滤过程:一个过程在流通柱色谱前去除分子量比血红蛋白大的杂质,另一个过程在流通柱色谱后去除分子量比血红蛋白小的杂质。后一超滤过程浓缩血红蛋白。在一些实施方案中,IOOkDa滤器用于第一超滤过程,而30kDa滤器用于第二超滤过程。
[0054]流通柱色谱用来去除纯化血红蛋白溶液中的蛋白杂质诸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些实施方案中,通过使用一种市售离子交换柱或其组合来进行柱色谱,所述离子交换柱诸如DEAE柱、CM柱、羟基磷灰石柱等。用于柱色谱的典型pH为6-8.5。在一个实施方案中,使用流通CM柱色谱步骤在pH8.0去除蛋白杂质。进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以检测从柱色谱洗脱后的样品中残留的蛋白杂质和磷脂。此独特的流通柱色谱分离能够实现连续的分离方案以进行工业规模生产。ELISA结果显示在洗脱的血红蛋白中这些杂质的量非常低(免疫球蛋白-G:44.3ng/mL ;白蛋白:20.37ng/mL ;碳酸酐酶:81.2 μ g/mL)。使用不同类型的柱采用不同的pH值去除蛋白杂质的结果显示在下面的表1中。
[0055]表1
[0056]
【权利要求】
1.含有非聚合的、高度纯化的和热稳定的氧载体的组合物在制备用于在哺乳动物中减少癌性肿瘤复发和/或最小化肿瘤细胞转移的药物中的用途,其中所述组合物包含具有检测不到的二聚体浓度的交联的四聚体血红蛋白。
2.权利要求1所述的用途,其中所述组合物在手术去除肿瘤期间的中断血液供应前和重建血液供应期间被施用于所述哺乳动物。
3.权利要求2所述的用途,其中所述组合物以大约0.2g/kg-l.2g/kg所述哺乳动物的体重的范围施用。
4.权利要求1所述的用途,其中所述癌性肿瘤和肿瘤细胞是肝的或鼻咽的。
5.权利要求1所述的用途,其中所述癌性肿瘤和肿瘤细胞是低氧的。
6.权利要求1所述的用途,其中所述交联的四聚体血红蛋白具有60-70kDa的分子量和0.2-0.4%浓度的N-乙酰半胱氨酸。
7.权利要求6所述的用途,其中所述组合物不含引起血管收缩的杂质和蛋白杂质,是无致热原的、无内毒素的、无磷脂的、无基质的和具有小于5%的高铁血红蛋白水平。
8.含有非聚合的、高度纯化的和热稳定的氧载体的组合物在制备用于治疗癌组织的药物中的用途,其中所述组合物包含具有检测不到的二聚体浓度的交联的四聚体血红蛋白。
9.权利要求8所述的用途,其中所述癌组织通过放射治疗或化疗治疗来治疗。
10.权利要求9所述的用途,其中所述组合物在所述癌组织的放射治疗或化疗治疗前被施用于癌组织。
11.权利要求8所述的用途,其中所述癌组织是鼻咽癌或肝肿瘤。
12.权利要求8所述的用途,其中所述癌组织是低氧的。
13.权利要求8所述的用途,其中所述交联的四聚体血红蛋白具有60-70kDa的分子量和0.2-0.4%浓度的N-乙酰半胱氨酸。
14.权利要求13所述的用途,其中所述组合物不含引起血管收缩的杂质和蛋白杂质,是无致热原的、无内毒素的、无磷脂的、无基质的和具有小于5%的高铁血红蛋白水平。
15.权利要求10所述的用途,其中所述组合物以约0.2-1.2g/kg体重的范围和小于IOml/小时/kg体重的速率通过输注施用。
16.含有非聚合的、高度纯化的和热稳定的氧载体的组合物在制备用于增加癌组织的氧合的药物中的用途,其中所述组合物包含具有检测不到的二聚体浓度的交联的四聚体血红蛋白。
17.含有非聚合的、高度纯化的和热稳定的氧载体的组合物在制备用于减少肿瘤尺寸的药物中的用途,其中所述组合物包含具有检测不到的二聚体浓度的交联的四聚体血红蛋白。
18.一种含有非聚合 的、高度纯化的和热稳定的氧载体的组合物,其用于在哺乳动物中减少癌性肿瘤复发和/或最小化肿瘤细胞转移,其中所述组合物包含具有检测不到的二聚体浓度的交联的四聚体血红蛋白。
19.权利要求18所述的组合物,其中所述组合物在手术去除肿瘤期间的中断血液供应前和重建血液供应期间被施用于所述哺乳动物。
20.权利要求19所述的组合物,其中所述组合物以大约0.2g/kg-l.2g/kg所述哺乳动物的体重的范围施用。
21.权利要求18所述的组合物,其中所述交联的四聚体血红蛋白具有60-70kDa的分子量和0.2-0.4%浓度的N-乙酰半胱氨酸。
22.权利要求18所述的组合物,其中所述组合物不含引起血管收缩的杂质和蛋白杂质,是无致热原的、无内毒素`的、无磷脂的、无基质的和具有小于5%的高铁血红蛋白水平。
【文档编号】A61K47/48GK103687609SQ201280034336
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2011年7月11日
【发明者】黄炳镠, 郭瑞仪, 刘思行 申请人:亿京国际有限公司