多抗原提呈免疫原性组合物及其方法和用途
【专利摘要】本实施方式提供免疫原性多抗原提呈系统，所述免疫原性多抗原提呈系统包含聚合物，抗原通过互补亲和分子缔合至所述聚合物。例如，所述聚合物可为多糖、或抗原性多糖，来自相同或不同病原体的蛋白抗原或肽抗原间接连接至所述聚合物。本发明的免疫原性组合物可同时引发针对一种或多种抗原的体液免疫应答和细胞免疫应答两种免疫应答。
【专利说明】多抗原提呈免疫原性组合物及其方法和用途
[0001]政府支持
[0002]本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的基金号A1067737-01和AI51526-01的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定权利。
[0003]相关申请的交叉引用
[0004]根据35U.S.C.§ 119(e)，本申请要求2011年5月11日提交的美国临时申请号61 / 484，934,2012年3月8日提交的美国临时申请号61 / 608，168以及2012年3月13日提交的美国临时申请号61 / 609，974的优先权，以引用的方式将其各自的内容全部并入本文。
【技术领域】
[0005]本发明涉及分子遗传学、免疫学和微生物学。本申请总体上针对用于制备免疫原性组合物的方法以及组合物。更具体地说，本发明的实施方式提供免疫原性大分子-复合物(macro-complex),所述免疫原性大分子-复合物包含连接至聚合物(如多糖)(也可为抗原)的至少一种蛋白或肽抗原。在一些实施方式中，可将这种复合物用作免疫原性组合物(例如疫苗)以赋予协同的体液免疫应答和细胞免疫应答；在一些实施方式中，引发协同的抗体介导的和细胞介导的针对病原体的防护，例如，此类病原体的致死感染和粘膜运输(mucosal carriage)。
【背景技术】
[0006]疫苗提供对各种疾病的预防和治疗，包括微生物感染、病毒感染和癌症。然而，目前基于多糖的疫苗在多数易感人群(vulnerable populations)中并不总是有效。例如，在发展中国家中，肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,肺炎球菌)感染和伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)感染是儿童的两种主要疾病。对于伤寒(typhoid fever),许可的Vi多糖疫苗对两岁以下的儿童无效。然而，基于多糖的疫苗的成功和防止定殖(colonization)或疾病的被动免疫已表明了荚膜抗体的重要性，特别是在对由肺炎链球菌引起的疾病进行控制这一方面。此外，对动物和人二者的研究表明由肺炎球菌接种(vaccination)引发的抗体可以保护免于鼻咽(NP)肺炎球菌定殖,其在肺炎球菌疾病之前发生。
[0007]当前多糖肺炎球菌疫苗的局限在于，抗荚膜抗体给予的保护受到其血清型特异性限制。例如，尽管7价肺炎球菌缀合疫苗(PCV7)由于疫苗型(VT)菌株显著地降低了侵袭性肺炎链球菌疾病(invasive pneumococcal disease)的发病率,但是最近的研究表明非VT血清型已逐渐取代了 VT肺炎球菌群，潜在地限制疫苗的有效性。这已导致对是否可以通过保守性抗原的免疫(immunization)来防止肺炎球菌定殖进行评价。特别是，若干肺炎球菌蛋白在肺炎球菌定殖动物模型中已被评价为候选疫苗。已经证明，以这些蛋白中的一些进行的粘膜免疫引发全身性抗体和粘膜抗体，并赋予针对肺炎球菌疾病和定殖的保护。仍然需要含有肺炎球菌多糖和蛋白二者的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物能够产生针对所有肺炎球菌血清型的稳健的(robust)细胞免疫应答和体液免疫应答这两种免疫应答。
[0008]此外，固有免疫应答提供了针对微生物病原体的迅速且通常有效的防御。这种应答包括对病原体相关分子的细胞识别、触发炎症介质(inflammatory mediators)的产生和释放、白细胞的募集、以及抗菌效应物的活化。Toll样受体(TLR)能够在多种病原体相关分子之间进行识别并引发保护性应答，就哺乳动物而言已经描述了其中至少十一种。例如，TLR4识别许多微生物产物，包括来自革兰氏阴性菌的微生物产物、呼吸道合胞病毒的F蛋白以及革兰氏阳性菌的胆固醇依赖细胞溶素(O)C, cholesterol-dependent cytolysins)。此外，TLR2识别大量的微生物化合物和合成化合物。因此，纳入此类TLR激动剂可增强对疫苗的免疫应答。仍有需要通过引发针对感染(例如肺炎球菌的定殖和疾病)的固有免疫应答(TLR介导的或其它的应答)来改善疫苗的效力。
【发明内容】
[0009]本发明提供了免疫原性多抗原提呈系统(MAPS)，该免疫原性多抗原提呈系统对免疫原性组合物(例如，在疫苗中有用的组合物)的生产有用。特别地，本发明涉及含有免疫原性复合物(immunogenic` complex)的组合物,所述免疫原性复合物含有至少一种类型的聚合物(例如多糖)，所述聚合物可任选为抗原性的；至少一种抗原蛋白或抗原肽；以及至少一种互补亲和分子对，所述互补亲和分子对含有Q)与所述聚合物缔合(associatewith)的第一亲和分子，以及(ii)与所述蛋白或肽缔合的互补亲和分子，以使得所述第一亲和分子和互补亲和分子作为所述聚合物与所述抗原蛋白或抗原肽之间的间接连接。因此，所述聚合物可连接至少I种、或至少2种、或多种相同或不同的蛋白抗原或肽抗原。在一些实施方式中，所述聚合物为抗原性的，例如，所述聚合物为肺炎球菌荚膜多糖。在一些实施方式中，所述蛋白抗原或肽抗原为重组蛋白抗原或肽抗原。
[0010]本文所公开的免疫原性组合物可同时引发针对一种或多种抗原的体液应答和细胞应答这两种应答。所述免疫原性组合物提供了长期记忆应答，潜在地保护受试者免于以后的感染。这允许单个免疫原性组合物产生高效价(titer)的功能性抗多糖抗体，并使其诱发的抗体水平类似于或高于由传统缀合疫苗诱发的抗体水平。此外，对具体的载体蛋白没有限制，并且多种抗原蛋白可用于MAPS构建体中来生成稳健的抗多糖抗体应答。此外，强烈的抗体应答和Thl7 / Thl应答对经由所述MAPS组合物提呈的多种蛋白抗原具有特异性。这呈现出作为用一种构建体引发两种形式的免疫的手段的主要优点。除了针对缀合至蛋白载体的抗原多糖的更传统的免疫应答之外，本发明提供了针对全身性注射的蛋白的T细胞应答以及，更具体地说，为Thl7和Thl应答。此外，本免疫原性组合物可将配体并入到所述聚合物骨架上。这提供了如下潜能:通过改变蛋白/聚合物比例、复合物大小，或通过将特定共刺激因子(如TLR2 / 4配体等)并入所述组合物中，来增强特异性B细胞应答或T细胞应答。
[0011]与典型的缀合技术(涉及对蛋白的严苛处理)相比，本方法避免了肽抗原的其它修饰的变性风险。这提供了如下很大的优势:保持所包含的蛋白的抗原性，并增加蛋白本身将作为抗原(而不只是载体)的可能性。同样地，本方法避免了对多糖骨架不必要的修饰/损坏，因为没有重度化学交联:可精确地控制生物素化以使其与多糖的特定官能团进行反应，并且可容易地对生物素化水平进行调节。这有利于避免缀合的典型过程，所述缀合的典型过程导致关键侧链或表位的损坏，这可能会导致降低的免疫原性和保护。
[0012]本发明的基于亲和的组装(assembly)提供了简单且高度灵活的免疫原性组合物的制备。它高度特异和稳定；它可以在寒冷中保存数月并保持其效力。组装过程足够简单以确保了高重现性；仅需要几个步骤，这降低了批次间存在偏差的风险，并具有巨大的工业优势。即使在低浓度的蛋白和多糖(如0.1mg / ml)中，MAPS组装也是高效的(超过95%)；这是主要优点，因为缀合制造的低效率(效率通常在〈50%的范围内)是主要障碍和疫苗高成本的原因。就制剂(formulation)而言:其易于调整终产物的组成和物理性质。在复合物中蛋白:聚合物的比例是可调节的；就聚合物适度的生物素化而言，蛋白:聚合物可为10:l(w / w)以上；相反，如果这就是基于免疫目标的兴趣，所述比例可为1:10以下。此外，免疫原性MAPS组合物的大小可通过对聚合物大小的选择来进行调节。制备MAPS的方法在将聚合物与蛋白联合而几乎无需修饰这方面提供了方便。通过在单一的免疫原性构建体中装载来自相同或不同病原体(例如，肺炎球菌和肺结核)的多种蛋白抗原而得到的终产物的可能的多价性提供了如下组合物:所述组合物可用于减少针对超过一种疾病对受试者进行免疫时所需的疫苗的数量。此外，MAPS组合物高度稳定；只有在煮沸时才会解离(dissociated)，并且在4°C甚至许多个月后仍保持免疫原性。MAPS复合物的免疫原性可能会受到抗原蛋白或抗原肽组分的稳定性的限制，所述抗原蛋白或抗原肽的稳定性可通过包含于MAPS复合物 中而被延长。本文所用的特定抗原在室温下以及在至少一个冷冻-解冻循环后具有稳定性。这提供了相比于当前疫苗的重要优点，如果没有仔细维持“冷链”的话，当前疫苗会受到损害。
[0013]因此，本发明一方面涉及免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含聚合物、至少一种蛋白抗原或肽抗原、以及至少一种互补亲和分子对，其中，所述互补亲和分子对包含与所述聚合物缔合的第一亲和分子以及与所述蛋白抗原或肽抗原缔合的互补亲和分子，以使得当所述第一亲和分子与所述互补亲和分子缔合时，间接地将所述抗原连接至所述聚合物。
[0014]在一些实施方式中，用交联剂将所述第一亲和分子交联至所述聚合物，例如，交联剂选自于=CDAP (1-氰基-4- 二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐)、EDC (1-乙基-3- [3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)、氰基硼氢化钠；溴化氰；或碳酸氢铵/碘乙酸。在一些实施方式中，所述第一亲和分子交联至所述聚合物的羧基、羟基、氨基、苯氧基、半缩醛以及巯基官能团。在一些实施方式中，所述第一亲和分子共价键合至所述聚合物。
[0015]在一些实施方式中，所述第一亲和分子为生物素或其衍生物、或具有与生物素类似的结构或物理性质的分子，例如，胺-PEG3-生物素((+)-生物素酰-3，6，9-三氧代十一烧二胺(trixaundecanediamine))或其衍生物。
[0016]在一些实施方式中，所述免疫原性组合物的蛋白抗原或肽抗原为融合蛋白，所述融合蛋白含有融合至互补亲和结合分子的抗原蛋白或抗原肽。所述融合可为遗传构建体，即重组融合肽或重组融合蛋白。在一些实施方式中，抗原可作为融合蛋白共价连接至所述互补亲和分子。在替代的实施方式中，所述抗原非共价连接至所述互补亲和分子。
[0017]在一些实施方式中，所述互补亲和分子为生物素结合蛋白或其衍生物或功能部分。在一些实施方式中，互补亲和分子为亲和素样蛋白或其衍生物或功能部分，例如但不限于，rhizavidin或其衍生物。在一些实施方式中，互补亲和分子为亲和素或链霉亲和素或它们的衍生物或功能部分。
[0018]在一些实施方式中，分泌信号肽位于所述亲和素样蛋白的N端。本领域普通技术人员所知的任何信号序列均可使用；在一些实施方式中，所述信号序列为MKKIffLALAGLVLAFSASA(SEQ ID NO:1)或其衍生物或功能部分。在一些实施方式中，所述抗原可经由柔性接头肽融合至互补亲和分子，其中，所述柔性接头肽将所述抗原连接至所述互补亲和分子。
[0019]在一些实施方式中，免疫原的聚合物组分包含来自活生物体(living organism)的聚合物，例如多糖。在一些实施方式中，聚合物可从天然来源中纯化和分离得到，或者可将所述聚合物合成为具有天然组成/结构，或者所述聚合物可为合成(例如，具有人造组成/结构)聚合物。在一些实施方式中，聚合物来源于选自于由以下生物体所组成的组中的生物体:细菌、古生菌、或真核细胞例如真菌、昆虫、植物，或上述生物体的嵌合体。在一些实施方式中，所述聚合物为来源于病原性细菌的多糖。在【具体实施方式】中，所述多糖为肺炎球菌荚膜多糖、肺炎球菌细胞壁多糖或伤寒沙门氏菌Vi多糖。[0020]在一些实施方式中，本文所公开的免疫原性组合物的聚合物为支链聚合物，例如分支多糖；或者，可为直链聚合物，例如单链聚合物，例如多糖。在一些实施方式中，所述聚合物为多糖，例如，葡聚糖或其衍生物。在一些实施方式中，聚合物(例如葡聚糖多糖)的平均分子量可为425kD-500kDa(包括端值)；或者，在一些实施方式中，为大于500kDa。在一些实施方式中，聚合物(例如葡聚糖多糖)的平均分子量可为60kD-90kDa(包括端值)；或者，在一些实施方式中，为小于70kDa。所述葡聚糖聚合物可来源于细菌，如肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。
[0021 ] 在一些实施方式中，本文公开的免疫原性组合物包含至少2种抗原、或至少3种抗原、或至少5种抗原、或2-10种之间的抗原、或10-15种之间的抗原、或15-20种之间的抗原、或20-50种之间的抗原、或50-100种之间的抗原或超过100种抗原，包括端值。在一些实施方式中，当本文所公开的免疫原性组合物包含至少2种抗原时，所述抗原可为相同的抗原或至少2种不同的抗原。在一些实施方式中，所述抗原可以来自相同病原体或不同病原体，或者可为相同抗原蛋白的不同表位或不同部分，或者可为对相同病原体的不同血清型或季节性变型(如流感病毒A、B和C)具有特异性的相同抗原。
[0022]在一些实施方式中，本文公开的免疫原性组合物包含来自病原性生物体或异常组织的抗原。在一些实施方式中，所述抗原为肿瘤抗原。在一些实施方式中，抗原可为选自于寄生虫或病原体抗原的至少一种抗原，例如如下抗原:肺炎链球菌抗原、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原或破伤风分枝杆菌(M tetanus)抗原、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)抗原、HIV抗原、季节性或流行性流感抗原(如HlNl或H5N1)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)抗原、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)抗原或淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)抗原、HPV抗原、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原、HSV抗原或其它疱疫病毒抗原、或痕原虫(Plasmodia) sp抗原。这些抗原可包括肽、蛋白、糖蛋白或多糖。在一些实施方式中，所述抗原为类毒素或毒素的一部分。
[0023]在一些实施方式中，本文公开的免疫原性组合物包含抗原多糖，例如，如Vi抗原(伤寒沙门氏菌荚膜多糖)、肺炎球菌荚膜多糖、肺炎球菌细胞壁多糖、Hib (B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B))荚膜多糖、脑膜炎球菌(meningococcal)荚膜多糖、炭疽杆菌的多糖(炭疽的病原体(causative agent))、以及其它细菌荚膜多糖或细胞壁多糖，或上述多糖的任意组合。所述多糖可具有蛋白组分，例如，如来源于病毒的糖蛋白。
[0024]在一些实施方式中，本文公开的免疫原性组合物进一步包含至少一种与所述聚合物或多糖缔合的共刺激因子，其中，所述共刺激因子可直接或间接缔合。例如，在一些实施方式中，共刺激因子可共价连接至所述聚合物。例如，在一些实施方式中，共刺激因子可共价连接至所述第一亲和分子，然后将其交联至所述聚合物。例如，在一些实施方式中，共刺激因子可连接至互补亲和分子，所述互补亲和分子与第一亲和分子缔合，从而将所述共刺激因子连接至所述聚合物。在一些实施方式中，共刺激因子为佐剂(adjuvant)。在替代的实施方式中，共刺激因子可为本领域普通技术人员所知的任何共刺激因子，并包括任意组合，例如但不限于，Toll样受体激动剂(TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9等的激动剂)、NOD激动剂或炎性小体(inflammasome)激动剂。
[0025]本发明的另一方面涉及将本文所公开的免疫原性组合物给予受试者以在所述受试者中引发免疫应答的用途。在一些实施方式中，所述免疫应答为抗体应答/ B细胞应答、⑶4+T细胞应答(包括Thl、Th2和Th 17细胞)和/或⑶8+T细胞应答。在一些实施方式中，将至少一种佐剂与所述免疫原性组合物联合给药。
[0026]本发明的另一方面涉及用于在受试者中诱导针对至少一种抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予本文所公开的免疫原性组合物。
[0027]本发明的另一方面涉及针对至少一种抗原对动物(例如鸟类、哺乳动物或人)进行接种的方法，所述方 法包括给予含有本文所公开的免疫原性组合物的疫苗组合物。
[0028]在本文公开的所有方面中，动物或受试者可为人。在一些实施方式中，所述受试者可为农业动物或非驯养动物(non-domestic animal)、或驯养动物。在一些实施方式中,含有本文所公开的免疫原性组合物的疫苗组合物可经由以下方式给药:皮下、鼻内、口腔、舌下、阴道、直肠、皮内、腹腔内、肌内注射，或经由皮肤贴剂来经皮免疫。
[0029]在本文公开的所有方面中，免疫应答是针对蛋白/肽抗原的抗体应答/ B细胞应答、⑶4+T细胞应答(包括Thl、Th2和Th 17应答)或⑶8+T细胞应答。在一些实施方式中，免疫应答是针对所述聚合物(例如，肺炎球菌多糖)的抗体应答/ B细胞应答。在一些实施方式中，将至少一种佐剂与所述免疫原性组合物联合给药。
[0030]本发明的另一方面涉及本文所公开的免疫原性组合物在对暴露于病原体或免疫原性剂进行诊断中的用途。
[0031]本发明的另一方面涉及用于制备本文所公开的免疫原性组合物的试剂盒。例如，此类试剂盒可包含以下物质中的任意一种或多种:含有聚合物(如多糖)的容器，所述聚合物与多个第一亲和分子交联；以及含有互补亲和分子的容器，所述互补亲和分子与所述第一亲和分子缔合，其中，所述互补亲和分子与抗原缔合。
[0032]在另一个实施方式中，所述试剂盒可包含:含有聚合物(例如多糖)的容器；含有多个第一亲和分子的容器；以及含有交联分子的容器，所述交联分子用于将所述第一亲和分子交联至所述聚合物。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含至少一种共刺激因子，所述至少一种共刺激因子可添加至所述聚合物。在一些实施方式中，所述试剂盒包含用于将所述共因子连接至所述聚合物或多糖的交联剂，例如但不限于，CDAP (1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐)、EDCd-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)、氰基硼氢化钠、溴化氰、碳酸氢铵/碘乙酸。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含将所述互补亲和分子连接至所述蛋白抗原或肽抗原的手段(means)，所述手段可为通过交联剂或通过一些中间(intermediary)融合蛋白。
[0033]在一些实施方式中，所述试剂盒可包含含有表达载体的容器，所述表达载体用于表达蛋白抗原- 亲和分子融合蛋白或肽抗原-亲和分子融合蛋白，例如，用于将蛋白抗原或肽抗原以与所述互补亲和分子一起的融合蛋白进行表达的表达载体。在一些实施方式中，所述载体可任选地包含接头肽序列，其中，所述表达载体可表达含有接头肽的抗原-互补亲和分子融合蛋白，所述接头肽位于所述抗原和所述亲和分子之间。
[0034]在一些实施方式中，所述试剂盒可任选地包含含有互补亲和分子的容器，所述互补亲和分子与所述第一亲和分子缔合，其中，所述互补亲和分子与肽抗原/蛋白抗原缔合。在一些实施方式中，所述试剂盒可进一步含有将所述互补亲和分子连接至所述抗原的手段，例如，使用本文所公开的交联剂或其它中间蛋白(例如二价抗体或抗体片段)。
[0035]本文还提供了以本文所公开的免疫原性组合物对受试者(例如哺乳动物，如人)进行接种的方法，所述方法包括向所述受试者给予本文所公开的疫苗组合物。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1是多抗原提呈系统(MAPS)的示意图。MAPS表示复合免疫原性组合物的新平台，其通过如下方式制得:将若干蛋白抗原经由亲和对(例如，亲和素-生物素对)的稳定相互作用连接至多糖或多糖抗原。在MAPS复合物的一个实施方式中，将来自同一病原体或不同病原体的蛋白抗原重组融合至亲和素样蛋白，并将其在大肠杆菌(E.coli)中进行表达。将多糖骨架(可选自于各种病原体)进行生物素化和/或将多糖骨架与共刺激因子交联或不与共刺激因子交联(使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)或1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)作为活化试剂)。MAPS复合物可仅通过将纯化的融合抗原(一种或多种)以所需的比例与生物素化的多糖进行混合和孵育而容易地组装。可通过凝胶过滤色谱根据大小对组装的MAPS复合物进行纯化/分离。
[0037]图2示出了多糖生物素化的示例性实例:生物素衍生物(胺-PEG3-生物素，也称作(+)_生物素酰_3，6，9-三氧代十一烷二胺)的结构、CDAP的结构、以及EDC的结构。图中还显示了多糖生物素化方法的示意图:使用CDAP作为活化试剂的过程(I);或使用EDC作为活化试剂的过程(2)。用于生物素化的其它方式均涵盖于本发明的方法中。
[0038]图3A-图3C显示了重组rhizavidin和rhizavidin-抗原融合蛋白的实施方式。图3A显示了修饰的rhizavidin(上图)和rhizavidin-抗原融合蛋白(下图)的结构示意图。将所有构建体克隆进PET21b载体，并转化进大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以进行表达。图3B显示了纯化的重组rhizavidin (rRhavi)的SDS-PAGE。图3C显示了纯化的rhav1-抗原融合蛋白的 SDS-PAGEo 泳道 I:rhav1-Pdt ;泳道 2:rhav1-PsaA ;泳道 3:rhav1-spl733 ;泳道4:rhav1-spl534 ;泳道 5:rhav1-sp0435 ;泳道 6:rhav1-spl458 ;泳道 7:rhav1-ESAT-6 /CfplO ;泳道 8:rhav1-TB9.8 / TB10.4 ;泳道 9:rhavi_MPT64 ;泳道 10:rhavi_MPT83。
[0039]图4A-图4C显示了组装的实例MAPS的洗脱图谱。图4A的MAPS通过将0.5mg纯化的rRhavi与Img生物素化的葡聚糖90(BD90，平均MW60-90KD)在4°C孵育过夜组装而成，然后施加于superdex-200柱。峰A和峰B表示含有MAPS复合物的洗脱部分(fraction),峰C表示含有游离rRhavi的洗脱部分。图4B显示了峰部分的SDS-PAGE。所有样品在具有IOmM DTT的SDS样品缓冲液中煮沸。图4C显示了 MAPS复合物的稳定性。处理相同量的样品，然后将其应用于SDS-PAGE。即使是在经含有还原剂的SDS样品缓冲液处理之后(泳道I)，MAPS复合物仍保持完整，其仅在煮沸后可被破坏，这证明了缔合的稳定性。泳道1:用含有IOmM DTT的SDS样品缓冲液处理过的MAPS，在室温下10分钟；泳道2:用不含DTT的SDS样品缓冲液处理过的MAPS，煮沸10分钟；泳道3:用含有IOmM DTT的SDS样品缓冲液处理过的MAPS，煮沸10分钟。
[0040]图5显示了在不同温度以及不同浓度的PS和蛋白抗原下MAPS复合物的组装。MAPS复合物在多糖(PS)或蛋白抗原的宽浓度范围内(低至0.1mg / ml)均可有效地进行组装。该组装可通过在4°C (图5A)或在25V (图5B)孵育过夜而完成，这取决于抗原的稳定性。可通过在事先将样品煮沸或不煮沸的情况下，将组装混合物通过SDS-PAGE跑胶来对MAPS复合物的组装效率进行评价。在不经过煮沸处理的情况下，并入到MAPS复合物中的蛋白抗原继续待在PS上，因此在凝胶上显示为分子量非常大的带(MAPS / PS);只有未结合的蛋白可跑至凝胶的较低处，并在抗原的预期分子量处(单体位置或二聚体位置)被检测到。通过对煮沸前后的蛋白抗原条带作比较，可估算出组装至MAPS复合物中的抗原的百分比。通常情况下，4°C的组装效率大于85%，25°C的组装效率接近95% -99%。
[0041]图6显示了以不同比例的蛋白与多糖组装的MAPS的洗脱图谱。将0.5mg纯化的rRhavi分别与lmg、0.5mg或0.1mg的BD90孵育过夜,然后应用于使用superdex200柱的凝胶过滤色谱。相比以较低的蛋白对多糖比例组装的MAPS复合物，以较高的蛋白对多糖比例组装的MAPS复合物似乎具有更高的分子量。对每个样品中含有MAPS复合物的峰部分(用箭头表示)进行收集。对纯化的MAPS复合物中的蛋白对多糖的比例进行测定并且显示出与输入比(inpu t ratio)具有良好的相关性。
[0042]图7显示了以各种大小的多糖组装的MAPS的洗脱图谱。将0.5mg融合抗原与0.25mg生物素化的葡聚糖一起进行孵育，所述生物素化的葡聚糖的平均分子量为425KD-500KD (BD500)、150KD (BD150)或 60KD-90KD (BD90)。使用 Superpose6 柱对 MAPS 复合物进行分离；色谱图谱显示，用较大的多糖组装的MAPS复合物具有较大的大小。
[0043]图8A-图8D显示了具有多抗原的MAPS组装。图8A显示了具有不同比例的两种抗原的MAPS组装。二价MAPS复合物通过如下方式来制备:将生物素化肺炎链球菌(SP)血清型14荚膜多糖与两种不同的肺炎球菌融合抗原rhav1-1652和rhavi_0757进行孵育，所述 rhav1-1652 和 rhav1-0757 以 1:4、1:2、1:1、2:1 或 4:1 的摩尔比进行混合。SDS-PAGE显示，MAPS复合物中所并入的每种抗原的量与输入比具有很好的相关性。图SB-图8D显示了多价MAPS复合物，所述多价MAPS复合物用生物素化的多糖(葡聚糖或血清型3肺炎球菌荚膜多糖)连接2种(2V，图8B)、3种(3V，图8C)或5种(5V，图8D)不同的肺炎球菌抗原和/或肺结核抗原而制得。SDS-PAGE显示了并入到MAPS复合物中的抗原。在具有IOmMDTT的SDS样品缓冲液中将所有样品煮沸。
[0044]图9显示以MAPS复合物进行的免疫诱发了针对多糖抗原的强抗体应答。与仅接受佐剂(无Ag)的动物组或接受未偶联(uncoupled)的多糖和蛋白混合物(混合物)的动物组相比，用MAPS复合物免疫的小鼠产生了显著较高量的抗多糖抗体，所述MAPS复合物是由生物素化葡聚糖(9A)、Vi多糖(9B)或肺炎球菌细胞壁多糖(CWPS) (9C)制成。图9D-图9F显示了，与传统缀合疫苗相比，MAPS复合物在产生抗PS Ab方面要更优。MAPS复合物由SP血清型1、5和14荚膜多糖(CPS)制成，其装载有五种蛋白抗原。用MAPS或Prevnar 13?(肺炎球菌13价缀合疫苗[白喉CRM197蛋白]；ffyeth / Pfizer) (PCV13)间隔2周对小鼠皮下免疫两次，并在第二次免疫后2周，通过ELISA对针对所接种的血清型CPS的血清IgG抗体进行分析。将PCV13免疫小鼠中的抗CPS IgG的效价任意地(arbitrarily)设置为1200单位以进行比较。对于所有测试的血清型而言，与PCV13接种所产生的抗CPS IgG抗体水平相比，MAPS复合物的免疫产生了相似(血清型5)或者高得多(血清型I和血清型14)的抗CPS IgG抗体水平。血清型I (图9D);血清型5 (图9E);血清型14 (图9F)。
[0045]图10比较了由不同免疫剂量的MAPS诱导出的抗PS抗体。MAPS复合物是由血清型5SP CPS制成，装载有五种蛋白抗原。以每剂量PS含量为I μ g-16 μ g向小鼠给予MAPS复合物，免疫两次，间隔2周。在第二次免疫后两周，对不同免疫组间针对血清型5CPS的血清抗体进行测量和比较。在所有剂量中，MAPS的免疫均诱导出针对血清型5CPS的稳健IgG抗体。给予每剂量2 μ g PS产生了最高的抗体效价，而将PS剂量增加至16 μ g使抗体效价减少了约4倍。
[0046]图11显示了由MAPS复合物免疫所产生的抗PS抗体在体外促进了对靶病原体的杀灭。图1lA证明了对表达Vi的细菌的抗体介导的杀灭。来自用MAPS复合物(使用Vi作为骨架)免疫而非来自其它两组的动物的血清在孵育I小时内显示出对表达Vi的菌株强有力的杀灭(超过90%的杀灭)。来自于用明矾(Alum)(虚线)、混合物(黑线)、或MAPS (灰线)免疫的小鼠的血清。图1lB-图1lD表明来自MAPS免疫小鼠的血清的调理吞曬(opsonophagocytic) 杀灭活性比来自许可疫苗PCV13免疫小鼠的血清的杀灭活性要好。对来自PCV13免疫的小鼠或MAPS免疫的小鼠的血清在如下方面的能力进行测量和比较:介导通过嗜中性粒细胞对肺炎球菌的体外调理吞噬杀灭。人嗜中性粒细胞分化自HL-60细胞系的细胞。调理吞噬杀灭通过如下方式完成:将不同稀释度的血清(血清型1(图11B)、血清型5(图11C)或血清型13(图11D))、肺炎球菌以及分化的HL-60细胞在37°C孵育I小时(在幼兔补体存在下)。孵育后，将小份(aliquot)混合物铺板以对存活的细菌进行计数。将调理吞噬杀灭单位定义为观察到50%细菌杀灭的血清的稀释倍数。对于所有测试的血清型而言，相比来自PCV13免疫小鼠的血清，来自MAPS免疫小鼠的血清显示出高至少4倍的杀灭活性(0ΡΑ效价)。图1lB-图1lD:来自用明矾(虚线)、PCV13(黑线)、或MAPS (灰线)免疫小鼠的血清。
[0047]图12A-图12D表明MAPS复合物的免疫诱导出针对蛋白抗原的稳健抗体应答和细胞应答。二价MAPS复合物由生物素化的葡聚糖(BD500)和两种肺炎球菌抗原(rhav1-Pdt和rhav1-PsaA)制成。皮下接种每两周进行一次，进行三次。图12A显示了在最后一次免疫后2周时所测量到的针对PsaA或Pdt的血清IgG抗体的结果。相比接受混合物的小鼠，用MAPS复合物免疫的小鼠产生出具有显著较高效价的抗Pdt抗体和抗PsaA抗体。通过对免疫动物全血的体外刺激来对抗原特异性T细胞应答进行评价。对血液样品中的IL-17A(图12B)和IFN-y (图12C)的体外生产进行测量，所述血液样品与纯化的PsaA、Pdt或肺炎球菌全细胞抗原(WCA) —起孵育了 6天。与用混合物免疫的小鼠相比，接受MAPS复合物的动物显示出显著较强的IL-17A应答和IFN-y应答。图12D显示了通过WCA刺激得到的IL-17A生产和IFN-y生产的相关性。对于所有图，棒表示具有标准差的平均值，使用Mann-Whitney检验进行统计分析，或者对于相关性使用Spearman R。
[0048]图13显示了对不同大小的MAPS复合物的免疫原性的评价。MAPS复合物由两种肺炎球菌融合抗原Crhav1-PsaA和rhav1-Pdt)制成,并使用不同长度的葡聚糖作为骨架(BD500, Mw为425-500kDa ；BD90, Mw为60_90kDa)。在免疫三次之后，对针对葡聚糖、两种蛋白抗原PdT和PsaA的抗体应答以及抗原特异性T细胞应答进行测量和比较。如图所示，相比接受较小复合物(MAPS BD90)的动物，用较大复合物(MAPS BD500)免疫的小鼠产生了相似水平的抗PsaA抗体和抗Pdt抗体(图13B)，但是产生了显著较高效价的抗葡聚糖抗体(图13A)以及显著较高的IL-17A相关的T细胞应答(图13C)。
[0049]图14显示了，将共刺激因子(TLR配体)加入到MAPS复合物中促进了 IL-17A和IFN-Y相关的T细胞应答。MAPS复合物由生物素化的葡聚糖和一种肺炎球菌蛋白抗原(rhav1-0435)制成，具有或不具有额外的TLR配体/激动剂:rhavi_Pdt，TLR4配体；Pam3CSK4，TLR2激动剂。Rhav1-Pdt的并入经由rhavi和生物素之间的亲和相互作用实现，而Pam3CSK4共价连接至`葡聚糖骨架。皮下给予三次免疫，并对针对0435蛋白的T细胞应`答进行测量和比较。结果显示，TLR2激动剂或TLR4和TLR2配体的联合的添加显著增强了针对蛋白抗原的IL-17A和IFN-y相关的T细胞应答。
[0050]图15显示多价肺炎球菌/结核分枝杆菌(TB)联合疫苗(combination vaccine)的实例。多价SP / TB联合MAPS疫苗通过使用SP血清型3，并装载一种SP蛋白(肺炎球菌溶血素类毒素，Pdt)以及六种TB蛋白(四种融合构建体)而制成(图15A)。用SP /TB MAPS免疫小鼠诱导出针对3型CPS (图15B，左侧)以及针对Pdt (图15B，右侧)的高效价IgG抗体，并导致100%保护小鼠免受血清型3肺炎球菌的致死肺部感染(图15C)。图15D-图15J显示了通过接种SP / TB MAPS所诱导的针对TB抗原的B细胞免疫和T细胞免疫。图MD显示了针对不同TB蛋白抗原的抗体应答。图15E-图15F显示了，在用纯化的TB蛋白抗原体外刺激后，在来自MAPS免疫小鼠的全血样品中强烈的IL-17A(图15E)和IFN-Y (图15F)相关的T细胞应答。图15G和图15H显示了在来自MAPS免疫动物的脾细胞中，针对纯化的TB蛋白抗原的混合物或针对TB全细胞提取物的IL-17A(图15G)和IFN-y (图15H)相关的T细胞应答。图151和图15J提供了关于由MAPS免疫诱导的TB特异性记忆T细胞/效应T细胞的更多数据。结果显示，⑶4+T细胞而非⑶8+T细胞的耗竭(depleted)对TB抗原特异性细胞因子的产生具有重大影响，这表明用MAPS疫苗的免疫主要致敏(primed) 了 CD4+T细胞(T辅助细胞)免疫应答。
[0051]图16证明了基于原型(prototype)MAPS的多价免疫原性组合物预防肺炎球菌的侵袭性感染和鼻咽定殖。多价SP MAPS使用SP细胞壁多糖(CWPS)作为骨架制成，并装载有五种肺炎球菌蛋白抗原(图16A)。用该SP MAPS对小鼠进行三次免疫，每次间隔两周，并在最后一次免疫后两周，对针对肺炎球菌的血清抗体和特异性T细胞应答进行分析。图16B显示了针对CWPS (左侧)或针对肺炎球菌全细胞抗原(WCA)(右侧)的血清IgG抗体。相比仅接受佐剂(无Ag)或未偶联的PS /蛋白混合物(混合物)的对照组小鼠，用SP MAPS免疫的小鼠产生了具有显著较高效价的针对CWPS或WCA的抗体。图16C和图16D显示了由SP MAPS接种所诱导的SP特异性T细胞应答。用纯化的肺炎球菌蛋白(抗原混合物)或WCA对来自不同免疫组小鼠的外周血进行刺激。来自MAPS接种小鼠而非来自对照组的细胞对SP抗原应答强烈，并且引起了 IL-17A(图16C)和IFN-y (图16D)的稳健产生。图16E和图16F显示了用MAPS复合物进行的接种保护小鼠免受肺炎球菌的侵袭性感染以及鼻咽定殖。不同免疫组的小鼠在肺穿刺模型(lung aspiration model)中以SP血清型3菌株WU2进行激发(challenged)(图16E)，或在鼻定殖模型中以血清型6肺炎球菌菌株603进行激发(图16F)。对脓毒症或定殖的保护仅在MAPS免疫的小鼠中观察到。
【具体实施方式】
[0052]应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体方法学、方案和试剂等，此类方法学、方案和试剂等可以变化。本文所使用的术语仅出于描述【具体实施方式】的目的，而并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。
[0053]除非上下文中清楚地另有说明，本文和权利要求中所使用的单数形式包括复数的情况，反之亦然。除非通过例如“任一(either)”进行修饰，术语“或(or)”具有包含的意味。除了在操作实施例中或另有说明的情况下，本文所使用的表示成分的量或反应条件的所有数字均应被理解为在所有情况下由术语“约(about)”修饰。应当进一步理解的是，对于核酸或多肽所给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子质量的值均为近似值，并且提供用于说明。
[0054]为了描述和公开的目的，以引用的方式将所标明的所有专利和其它出版物明确并入本文，例如，在此类出版物中描述的可用于本发明的方法学。这些出版物仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应视作本发明人无权借助于在先发明或因任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信 息，并不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。
[0055]除非另有定义，本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属【技术领域】中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管任何已知的方法、设备和材料可被用于本发明的实践或测试中，就这一点而言，在本文中对所述方法、设备和材料进行了描述。
[0056]本发明涉及免疫原性组合物和包含免疫原性复合物的组合物，所述免疫原性复合物包含至少一种抗原或多种抗原，所述至少一种抗原或多种抗原连接至聚合物支架以在给予受试者时用于引发针对连接至所述聚合物的各抗原的免疫应答，以及任选的针对所述聚合物本身的免疫应答。该多抗原提呈系统(MAPS)刺激体液免疫应答和细胞免疫应答:它可使用单个MAPS免疫原性构建体来产生针对多种蛋白抗原的抗多糖抗体和B细胞/ Thl /Thl7应答。赋予生物体的联合的B细胞免疫力和T细胞免疫力可能代表了针对多种疾病的最佳疫苗策略，所述疾病包括肺炎球菌疾病相关的侵袭性感染和鼻咽携带(carriage)。在一些实施方式中，所述免疫原性组合物为疫苗或包含于疫苗中。
[0057]因此，本发明一方面涉及免疫原性组合物(多抗原提呈系统，或MAPS)，所述免疫原性组合物包含至少一种聚合物(例如，一种多糖)、至少一种蛋白抗原或肽抗原及至少一种互补亲和分子对，所述互补亲和分子对包含(i)与所述聚合物缔合的第一亲和分子以及(?)与所述抗原缔合的互补亲和分子，所述互补亲和分子对用于间接地将所述抗原连接至所述聚合物(例如，所述第一亲和分子与所述互补亲和分子缔合，以将所述抗原连接至所述聚合物)。因此，可将所述聚合物用作支架以连接至少I种、或至少2种或更多种(例如，多种)相同或不同的抗原。本文所公开的免疫原性组合物可用于同时引发针对多种抗原的体液免疫力和细胞免疫力这两种免疫力。
[0058]因此，本文的实施方式提供了对引发受试者中的免疫应答有用的免疫原性组合物和方法，所述免疫原性组合物和方法可使用其自身或与基本上任意已存在的疫苗方法结合或混合使用。
[0059]定义:
[0060]为了方便起见，这里收集了在整个申请(包括说明书、实施例以及所附的权利要求书)中所使用到的某些术语。除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属【技术领域】的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
[0061]本文所使用的术语“免疫原性组合物”被定义为当给予受试者时，能够引发免疫应答(例如抗体免疫应答或细胞免疫应答)的组合物。本发明的免疫原性组合物可具有免疫保护性或治疗性，或可不具有免疫保护性或治疗性。当本发明的免疫原性组合物预防、转佳(ameliorate)、缓和(palliate)或消除(eliminate)受试者的疾病时,所述免疫原性组合物即可任选地被称为疫苗。然而，本文使用的术语免疫原性组合物并不意味着局限于疫苗。
[0062]本文使用的术语“抗原”是指促进针对该物质的免疫应答的任何物质。在一些实施方式中，抗原为肽或多肽；在其它实施方式中，它可为引发针对该物质的免疫应答的任何化学品或部分，例如，碳水化合物。
[0063]本文使用的术语“缔合(associates) ”是指两个以上分子通过非共价键或共价键的连接。在一些实施方式中，当两个以上分子的连接通过共价键发生时，所述两个以上分子可融合在一起、或交联在一起。在一些实施方式中，当两个以上分子的连接通过非共价键发生时，所述两个以上分子可形成复合物。
[0064]本文使用的术语“复合物”是指两个以上分子的集合(collection)，所述分子通过除共价相互作用以外的手段进行空间连接；例如它们可通过静电相互作用、氢键或通过疏水相互作用(即，范德华力)连接。
[0065]本文使用的术语“交联”是指在聚合物链和第二分子之间形成的共价键。术语“交联剂”是指如下实体(entity)或试剂:所述实体或试剂为催化聚合物和实体(例如，第一亲和分子或共刺激因子)形成共价连接的中间分子。
[0066]本文使用的术语“融合”意思是至少一个蛋白或肽与第二个蛋白或肽物理缔合。在一些实施方式中，融合通常为共价连接，但是，其它类型的连接也包含于术语“融合”之内，所述其它类型的连接包括例如经由静电相互作用、或疏水相互作用等的连接。共价连接可包括如融合蛋白的连接、或化学偶联的连接(例如，通过在两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键)。
[0067]本文使用的术语“融合多肽”或“融合蛋白”是指通过将两个以上多肽序列接合(joining)在一起而制造的蛋白。本发明所涵盖的融合多肽包括嵌合基因构建体的翻译产物，所述嵌合基因构建体将编码一种或多种抗原或其部分或突变体的DNA序列与编码第二多肽的DNA序列接合以形成单个开放读码框。换句话说，“融合多肽”或“融合蛋白”为通过肽键或经由数个肽接合的两个以上蛋白的重组蛋白。在一些实施方式中，抗原融合的第二蛋白为能够与互补亲和对的第一亲和分子相互作用的互补亲和分子。
[0068]术语“多肽”和“蛋白”可交换使用，是指通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，出于所请求保护的本发明的目的，通常具有至少25个氨基酸的最小长度。术语“多肽”和“蛋白”可包括多体蛋白(multimeric protein),例如,包含一个以上结构域或亚基的蛋白。本文使用的术语“肽”是指肽键连接的氨基酸的序列，含有小于25个氨基酸，例如，长度为约4个氨基酸至25个氨基酸。蛋白和肽可由通过肽键连接的线性排列的氨基酸组成，无论是生物生产的、重组生产的、或是合成生产的，以及无论是由天然存在的氨基酸组成的还是由非天然存在的氨基酸组成的，均包含在这一定义内。大于25个氨基酸的全长蛋白及其片段均涵盖在蛋白这一定义中。该术语还包括具有多肽的共翻译修饰(例如，信号肽切割)和翻译后修饰的多肽，例如，二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、脂化、蛋白水解切割(例如，金属蛋白酶的切割)等。此外，本文使用的“多肽”是指包含对天然序列的修饰(例如删除、添加和替换(如本领域技术人员所知在自然界通常是保守的))的蛋白，只要该蛋白保持所需的活性。这些修饰可以是仔细考虑过的，例如通过定点突变，或者可为偶然的，例如通过产生所述蛋白的宿主的突变，或由于PCR扩增或其它重组DNA方法所产生的错误。
[0069] “信号序列”是指这样的核酸序列:当将其可操作地连接至核酸分子时，促进由所述核酸分子编码的产物(例如，蛋白或肽)的分泌。在一些实施方式中，所述信号序列优选位于所述核酸分子的5’端。
[0070]本文使用的术语“N-糖基化的(glycosylated) ”或“N-糖基化(glycosylation) ”是指糖部分与多肽中的天冬酰胺残基的共价连接。糖部分可包括但不限于葡萄糖、甘露糖和N-乙酰葡糖胺。聚糖的修饰还包括，例如，唾液酸化。
[0071]“抗原提呈细胞”或“APC”是表达主要组织相容性复合物(MHC)分子，并可将与MHC复合的外源抗原呈现在其表面的细胞。抗原提呈细胞的实例为树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、成纤维细胞(皮肤)、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞(脑)、胰腺β细胞和血管内皮细胞。
[0072]在“抗原功能部分”的背景下使用的术语“功能部分”或“功能片段”是指抗原或抗原多肽的一部分，所述部分介导与全抗原部分相同的作用(例如，在受试者中引发免疫应答)或介导与其它分子的缔合(例如，包含至少一个表位)。
[0073]本文所使用的术语靶抗原的“部分”为至少3个氨基酸的长度，并且可以为例如，至少6个、至少8个、至少10个、至少14个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少25个氨基酸或更多个氨基酸，包括端值。
[0074]术语“细胞毒性T淋巴细胞”或“CTL”是指通过凋亡或其它机制诱导靶细胞死亡的淋巴细胞。CTL与靶细胞通过TCR与靶细胞表面的经处理的抗原(Ag)的相互作用而形成抗原特异性缀合物，从而导致所靶向的细胞凋亡。凋亡小体被巨噬细胞清除。术语“CTL应答”用于指CTL细胞介导的初次免疫应答。
[0075]本文使用的术语“细胞介导的免疫”或“CMI”是指如下免疫应答:所述免疫应答不涉及抗体或补体，而是涉及例如巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(Τ细胞)、T辅助细胞、嗜中性粒细胞的活化，以及在针对靶抗原的应答中各种细胞因子的释放。换种说法，CMI涉及免疫细胞(如T细胞和其它淋巴细胞)，所述免疫细胞结合至呈现靶抗原的其它细胞(如抗原提呈细胞(APC))的表面并触发应答。所述应答可能涉及其它淋巴细胞和/或任何其它白血细胞(白细胞)以及细胞因子的释放。细胞免疫通过以下机制保护机体:(I)活化抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，所述CTL能够破坏将外源抗原的表位呈现在其表面的机体细胞，例如，病毒感染的细胞和携带胞内细菌的细胞；(2)活化巨噬细胞和NK细胞，使它们能够破坏胞内病原体；以及(3)刺激细胞分泌各种细胞因子或趋化因子，所述细胞因子或趋化因子影响涉及适应性免疫应答和固有免疫应答的其它细胞(例如T细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞)的功能。
[0076]本文使用的术语“免疫细胞”是指在针对直接或间接抗原刺激的应答中能够释放细胞因子、趋化因子或抗体的任何细胞。本文中的“免疫细胞”涵盖淋巴细胞，包括天然杀伤(NK)细胞、T细胞(CD4+和/或CD8+细胞)、B细胞、巨噬细胞；白细胞；树突状细胞；肥大细胞；s单核细胞；以及能够在针对直接或间接抗原刺激的应答中生产细胞因子分子或趋化因子分子的任何其它细胞。通常，免疫细胞为淋巴细胞，例如，T细胞淋巴细胞。
[0077]本文使用的术语“细胞因子”是指在用抗原刺激的应答中由免疫细胞所释放的分子。此类细胞因子的实例包括但不限于:GM-CSF、IL-1 a、IL-1 β、IL_2、IL_3、IL_4、IL_5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17A、IL-17F 或 IL-17 家族的其它成员、IL-22、IL-23、IFN- a、IFN- β、IFN- y、MIP-1 a、MIP-1 β、TGF- β , TNF a 或 TNF β。术语“细胞因子”不包括抗体。
[0078]本文使用的术语“受试者”是指对引发免疫应答有用的任何动物。所述受试者可以是野生动物、驯养动物、商业动物或伴侣动物，例如，鸟类或哺乳动物。所述受试者可为人。尽管在本发明的一个实施方式中，设想本文所公开的免疫原性组合物可适于对人进行治疗性处理或预防性处理，但其也适用于温血脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊(sheep)、狗、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛(cow);以及非哺乳动物，如鸡、鸭或火鸡。在另一实施方式中，所述受试者为野生动物，例如，用于 对例如禽流感进行诊断的鸟。在一些实施方式中，所述受试者为作为疾病模型的实验动物或动物替代品。所述受试者可为需要兽医处理的受试者，在其中，弓丨发针对抗原的免疫应答对预防疾病和/或控制疾病的传播有用，例如，SIV、STL1、SFV，或就畜禽(live-stock)而言为口蹄疫,或就鸟类而言为马立克氏病(Marek’s disease)或禽流感，以及其它此类疾病。
[0079]本文使用的术语“病原体”是指在受试者中引发疾病或紊乱的生物体或分子。例如，病原体包括但不限于病毒、真菌、细菌、寄生虫以及其它感染性生物体或从中而来的分子，以及在藻类、真菌、酵母、原生动物等分类中的分类学相关宏观生物体(taxonomicallyrelated macroscopic organisms)。
[0080]“癌细胞”是指在体内、离体，或者在组织培养中的癌细胞、癌前细胞(pre-cancerous cell)或转化细胞,其具有自发的或诱发的表型变化,所述表型变化无需涉及对新遗传物质的吸收。尽管转化可由转化病毒的感染和新基因组核酸的并入而引起、或由对外源核酸的吸收而引起，它也可自发引起或在暴露于致癌物质(carcinogen)后使得内源性基因发生突变而引起。转化/癌症与如下状况有关:例如，在适合的动物宿主(如裸鼠)中的形态学变化、细胞永生化、异常生长控制、病灶形成、锚着非依赖性(anchorageindependence)、恶性肿瘤(malignancy)、接触抑制和生长密度限制的缺失、生长因子或血清非依赖性、肿瘤特异性标志物、侵袭或转移、以及肿瘤生长。参见例如Freshney，CULTUREANIMAL CELLS =MANUAL BASIC TECH.(第三版，1994 年)。
[0081]术语“野生型”分别指通常与其在体内存在时相同的、天然存在的编码蛋白的正常多核苷酸序列或其部分，或蛋白序列或其部分。
[0082]术语“突变体”是指如下生物体或细胞:在其遗传物质方面具有任何变化、特别是相对于野生型多核苷酸序列的变化(即，删除、替换、添加或改变)的生物体或细胞；或相对于野生型蛋白序列具有任何变化的生物体或细胞。可将术语“变体(variant)”与“突变体(mutant) ”互换使用。尽管通常假定遗传物质的变化导致蛋白功能改变，但术语“突变体”和“变体”是指野生型蛋白序列的改变，而不管所述改变是否使所述蛋白的功能发生变化(如，增加、减少、赋予新的功能)，或者所述改变是否对蛋白的功能不产生影响(例如，突变或变异是沉默的)。
[0083]术语“药学上可接受的”是指可给予哺乳动物而不产生过度毒性的化合物和组合物。术语“药学上可接受的载体”不包括组织培养基。示例性的药学上可接受的盐包括但不限于无机酸盐(mineral acid)，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐等；以及有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。药学上可接受的载体在本领域是公知的。 [0084]应当认识到，蛋白或多肽通常含有除通常被称为20种天然存在的氨基酸的20种氨基酸外的氨基酸，还应当认识到，可通过天然过程(如糖基化和其它翻译后修饰)或通过本领域已知的化学修饰技术，对给定多肽中的多种氨基酸(包括末端氨基酸)进行修饰。可在本发明的多肽中存在的已知修饰包括但不限于，乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素(flavin)的共价连接、血红素(heme)部分的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰基醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、制剂、Y-羧化、糖化(glycation)、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蘧酰化、氧化、蛋白水解处理、磷酸化、异戍烯化(prenylation)、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化(sulfation)、转运RNA介导的向蛋白添加氨基酸(例如精氨酰化(arginylation))、以及泛素化(ubiquitination)。
[0085]本文使用的术语“同源(homologous) ”或“同源物(homologues) ”可互换使用，并且在用于描述多核苷酸或多肽时，表示当进行高同源性的最佳比对(optimally aligned)和比较(例如使用就比对具有默认参数的BLAST，2.2.14版本)时，两个多核苷酸或多肽、或其指定序列(具有适当的核苷酸插入或删除或氨基酸插入或删除)通常在其核苷酸中的至少70%的核苷酸是相同的。对于多肽，在多肽中应该有至少30%的氨基酸一致性，或者对于较高的同源性为至少50%的氨基酸一致性。本文使用的术语“同系物(homolog)”或“同源”还指在结构方面的同源性。对基因或多肽同源性的测定可由本领域技术人员容易地确定。在定义的百分比的情况下，所定义的百分比同源性意味着至少该百分比的氨基酸相似度(similarity)。例如，85%的同源性是指至少85%的氨基酸相似度。
[0086]本文使用的关于核酸序列、蛋白或多肽的术语“异源(heterologous) ”意味着在该细胞中这些分子并不是天然存在的。例如，插入细胞中的编码本文所述的融合抗原多肽的核酸序列(例如在蛋白表达载体的情况下)即为异源核酸序列。
[0087]对于序列比较，通常一个序列作为参比序列，将测试序列与所述序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入计算机，指定子序列坐标(subsequencecoordinates)(如果需要的话)，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参比序列的百分比序列一致性。在必要或需要的情况下，用于序列比较的最佳比对可通过本领域所公知的各种方法中的任何方法来进行。
[0088]本文使用的术语“变体”可以指如下多肽或核酸:通过一个或多个氨基酸或核酸的删除、添加、替换或侧链修饰而不同于天然存在的多肽或核酸，但还保留了天然存在分子的一种或多种特定功能或生物活性。氨基酸替换包括将氨基酸替换为不同的天然存在的氨基酸残基或非常规的氨基酸残基的改变。此类替换可被分类为“保守的”，在这种情况下，将多肽中含有的氨基酸残基替换为另一种在极性、或侧链功能或大小上具有类似特性的天然存在的氨基酸。本文所述的变体所涵盖的替换也可为“非保守的”，其中，将存在于多肽中的氨基酸残基替换为具有不同性质的氨基酸(例如，用丙氨酸替换带电氨基酸或疏水性氨基酸)，或者其中，将天然存在的氨基酸替换为非常规氨基酸。当针对多核苷酸或多肽而使用时，术语“变体”内还涵盖了分别相比于参比多核苷酸或多肽(例如，相对于野生型多核苷酸或多肽)而言，在一级结构、二级结构或三级结构方面的变化。
[0089]当针对相比于原始抗原而言抗原的变体或抗原的功能衍生物而使用时，术语“基本上相似”意味着特定的主题序列与抗原多肽序列因存在一个或多个替换、删除或添加而不同，但保留了至少50%或更高(例如，至少60%、70%、80%、90%以上(包括端值))的抗原在受试者中引发 免疫应答的功能。在对多核苷酸序列进行测定中，能够编码基本上相似的氨基酸序列的所有主题多核苷酸序列均被认为是与参比多核苷酸序列基本上相似，而不考虑密码子序列的差别。如果满足以下条件，则核苷酸序列“基本上类似”于给定抗原核酸序列:(a)所述核苷酸序列杂交至天然抗原序列的编码区域；或(b)所述核苷酸序列能够在适度严格条件(moderately stringent conditions)下杂交至天然抗原的核苷酸序列，并且具有类似于天然抗原蛋白的生物活性；或者(C)所述核苷酸序列相对于(a)或(b)中定义的核苷酸序列为遗传密码子简并的结果。基本上相似的蛋白与相应天然蛋白序列通常具有高于约80%的相似度。
[0090]如下所述，变体可包含保守的氨基酸变化或非保守的氨基酸变化。多核苷酸的改变可导致在由参比序列编码的多肽中发生氨基酸替换、添加、删除、融合和截短。变体还可包含氨基酸的插入、删除或替换，包括通常不会发生在作为变体的基础的多肽序列中的氨基酸和其它分子的插入和替换，例如但不限于通常不会在人蛋白中发生的鸟氨酸插入。“保守的氨基酸替换”由将一个氨基酸替换为另一种具有类似结构性质和/或化学性质的氨基酸造成。提供了功能相似氨基酸的保守替换表是本领域所公知的。例如，以下六组各自包含彼此为保守替换的氨基酸:(I)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T) ； (2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；⑶天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；⑷精氨酸(R)、赖氨酸⑷；(5)异亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缴氨酸(V)；以及(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸⑴、色氨酸(W)。参见例如 Creighton, PROTEINS (ff.H.Freeman&C0.，1984 年)。
[0091]保守氨基酸的选择可基于肽中待被替换的氨基酸的位置进行选择，例如，所述氨基酸是否在肽的外部并暴露于溶剂，或者是否在肽的内部而不会暴露于溶剂。此类对保守氨基酸替换的选择在本领域普通技术人员的技能之内。因此，能够选择适于蛋白或肽外部氨基酸(即暴露于溶剂的氨基酸)的保守氨基酸替换。这些替换包括但不限于以下替换:将Y替换为F，将T替换为S或K，将P替换为A，将E替换为D或Q，将N替换为D或G，将R替换为K，将G替换为N或A，将T替换为S或K，将D替换为N或E，将I替换为L或V，将F替换为Y，将S替换为T或A，将R替换为K，将G替换为N或A，将K替换为R，将A替换为S、K 或 P。
[0092]或者，还能够选择适于蛋白或肽内部氨基酸(即，不会暴露于溶剂的氨基酸)的保守氨基酸替换。例如，能够使用如下保守替换:其中，将Y替换为F，将T替换为A或S，将I替换为L或V，将W替换为Y，将M替换为L，将N替换为D，将G替换为A，将T替换为A或S，将D替换为N，将I替换为L或V，将F替换为Y或L，将S替换为A或T以及将A替换为S、G、T或V。在一些实施方式中，包含非保守氨基酸替换的LF多肽也涵盖在术语“变体”内。本文使用的术语“非保守”替换是指将氨基酸残基替换为具有不同化学性质的不同氨基酸残基。非保守替换的非限制性实例包括将天冬氨酸(D)用甘氨酸(G)替代；将天冬酰胺(N)用赖氨酸(K)替代；以及将丙氨酸(A)用精氨酸(R)替代。
[0093]本文使用的术语“衍生物”是指经化学修饰的蛋白或多肽，例如，通过泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇进行的衍生化)或其它分子的添加进行。当分子包含通常不是该分子的一部分的附加化学部分时，该分子也是另一分子的“衍生物”。此类部分可改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期等。或者，所述部分可降低分子的毒性、或者消除或减弱该分子的不希望的副作用等。能够介导此类效果的部分公开于REMINGTON’ S PHARMACEUTICALSCIENCES (第 21 版，Tory 著，Lippincott ffilliams&ffilkins, Baltimore, MD, 2006 年)。
[0094]当与“衍生物”或“变体”结合使用时，术语“功能性”是指具有与实体或分子的生物活性基本上相似的生物活性的蛋白分子，所述蛋白分子为所述实体或分子的衍生物或变体。在这样的上下文中，“基本上相似”意味着生物活性(例如，多肽的抗原性)为参比(例如，相应的野生型多肽)活性的至少50%，例如，至少60%、70%、80%、90%、95%、100%或甚至更高(即，相比于野生型， 变体或衍生物具有更高的活性)，例如，110^^120%以上，包括端值。
[0095]当用于描述核酸分子时，术语“重组体”意味着基因组、cDNA、病毒、半合成和/或合成来源的多核苷酸，所述多核苷酸借助于其来源或操作与其在自然界中是相关的多核苷酸序列的全部或部分不相关。关于肽、多肽、蛋白或重组融合蛋白所使用的术语重组体是指由重组多核苷酸表达而产生的多肽。关于宿主细胞所使用的术语重组体意味着其中引入有重组多核苷酸的宿主细胞。就材料(例如，细胞、核酸、蛋白质、或载体)而言，重组体在本文中还用于指所述材料已通过引入异源材料(例如，细胞、核酸、蛋白质、或载体)进行修饰。
[0096]术语“载体”是指能够将异源核酸运送至宿主细胞或在宿主细胞中介导异源核酸表达的核酸分子，所述异源核酸已连接至所述核酸分子；质粒为术语“载体”所涵盖的种类中的一种形式。术语“载体”通常是指含有在宿主细胞中进行复制和/或维持所必需的复制起点和其它实体的核酸序列。在本文中，能够指导与其可操作地连接的基因和/或核酸序列的表达的载体被称为“表达载体”。通常情况下，实用的表达载体往往处于“质粒”的形式(指环状双链DNA分子(所述环状双链DNA分子在其载体形式中并不结合至染色体))，并且通常包含用于稳定表达或瞬时表达的实体或编码DNA。可用于本文公开的方法中的其它表达载体包括但不限于，质粒、附加体(episomes)、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体，并且此类载体可整合进宿主的基因组或在特定细胞中自主复制。载体可以是DNA载体或RNA载体。也可使用本领域技术人员所公知的具有等同功能的其它形式的表达载体，例如自我复制的染色体外载体或整合至宿主基因组的载体。优选的载体为能够自主复制和/或表达与它们相连的核酸的载体。[0097]本文使用的术语“减少/降低(reduced / reduce / decrease) ”通常意味着相对于参比而言降低了统计学显著的量。为避免疑问，如本文所定义的术语，“减少”意味着相对于参比水平而言至少10%的统计学显著性降低，例如，降低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、至少90%以上、上至并包括降低100% (即，相对于参比样品为缺失水平(absent level))，或者相对于参比水平而言降低在10% -100%之间的任意量。
[0098]本文使用的术语“低”通常意味着低了统计学显著的量；为避免疑问，“低”意味着相比参比水平而言低了至少10%的统计学显著值，例如低于参比水平至少20%、低于参比水平至少30%、低于参比水平至少40%、低于参比水平至少50%、低于参比水平至少60%、低于参比水平至少70%、低于参比水平至少80%、低于参比水平至少90%、上至并包括低于参比水平100 %的值(即，相对于参比样品为缺失水平)。
[0099]本文使用的术语“增加/提高(increased / increase) ”通常意味着增加了统计学显著的量；例如，如在本文中所定义的术语，相对于参比水平而言至少10%的统计学显著性增加，包括增加至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80%、至少90%、至少100%或以上，包括端值；包括例如相对于参比水平增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或更多。
[0100]本文使用的术语“高”通常意味着相对于参比而言高了统计学显著的量；例如，相比于参比水平而言高了至少10%的统计学显著值，例如，与参比水平相比高至少20%、高至少30%、高至少40%、高至少50%、高至少60%、高至少70%、高至少80%、高至少90%、高至少100%，包括端值；例如，与参比水平相比高至少2倍、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少10倍或更高。
[0101]本文使用的术语“包含/包括(comprising) ”表示除已存在的确定要素外，还可存在其它要素。“包含/包括”的使用表示含有而非限制。
[0102]术语“由...组成”是指本文所述的组合物、方法以及它们各自的组分，排除未在实施方式描述中详述的任何要素。
[0103]本文使用的术语“基本上由...组成”是指对于给定的实施方式而言所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本发明该实施方式的基础和新颖性或功能性特征的要素。
[0104]本发明提供灵活且通用的组合物，所述组合物可被设计并制造用于引发特定、广谱、或多种抗原性靶标。表1提供了用于设想MAPS实施方式的灵活性的简单示例指南:
[0105]表1.MAPS平台的通用性
[0106]
【权利要求】
1.一种免疫原性组合物，所述组合物包含聚合物、至少一种抗原以及至少一种互补亲和分子对，所述互补亲和分子对包含: 与所述聚合物缔合的第一亲和分子；和 与所述抗原缔合的互补亲和分子， 其中，所述第一亲和分子与所述互补亲和分子缔合，从而连接所述抗原和所述聚合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述聚合物为多糖。
3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述聚合物为聚乙二醇。
4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述第一亲和分子交联至所述聚合物。
5.如权利要求1所述的组合物，其中，使用交联剂将所述第一亲和分子交联至所述聚合物，所述交联剂选自于由以下交联剂所组成的组中的任意交联剂: CDAP (1-氰基-4_ 二甲基氨基吡唳四氟硼酸盐)；EDC (1-乙基-3- [3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)；氰基硼氢化钠；溴化氰；以及碳酸氢铵/碘乙酸。
6.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述第一亲和分子交联至所述聚合物的羧基、羟基、氨基、苯氧基、半缩醛和巯基官能团。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述第一亲和分子共价键合至所述聚合物。
8.如权利要求1所述的组合物，其中，所述互补亲和分子对选自于由以下互补亲和分子对所组成的组: 生物素/生物素结合蛋白、抗体/抗原、酶/底物、受体/配体、金属/金属结合蛋白、碳水化合物/碳水化合物结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、His标签/His标签结合物。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，所述第一亲和分子为生物素或其衍生物或模拟分子。
10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述生物素衍生物为胺-PEG3-生物素((+)-生物素酸_3，6, 9- 二氧代十一烧二胺)。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中，所述抗原为融合蛋白，所述融合蛋白含有融合至蛋白亲和结合分子的抗原。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，所述抗原非共价连接至所述互补亲和分子。
13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中，所述抗原作为融合蛋白共价连接至所述互补亲和分子。
14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中，所述互补亲和分子为生物素结合蛋白或其衍生物或功能部分。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中，所述互补亲和分子为亲和素样蛋白或其衍生物。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物,其中，所述亲和素样蛋白为rhizavidin或其衍生物。
17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中，所述亲和素样蛋白为亲和素或链霉亲和素或它们的衍生物。
18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中，分泌信号肽位于所述亲和素样蛋白的N端。
19.如权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中，所述分泌信号序列为MKKIffLALAGLVLAFSASA(SEQ ID NO:1)或其衍生物。
20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中，所述聚合物或多糖由活生物体纯化得到，或者为合成聚合物或合成多糖。
21.如权利要求1-20中任一项所述的组合物，其中，所述活生物体选自于由以下生物体所组成的组: 细菌、古生菌、真核细胞、真菌、昆虫、植物、动物，或上述生物体的嵌合体。
22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中，所述聚合物为支链多糖。
23.如权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中，所述聚合物为直链多糖。
24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中，所述多糖为葡聚糖。
25.如权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中，所述葡聚糖为平均分子量为100kDa-500kDa的葡聚糖，包括端值。
26.如权利要求1-25中任一项所述的组合物，其中，所述葡聚糖为平均分子量为50kDa-300kDa的葡聚糖，包括端值。
27.如权利要求1-26中任一项所述的组合物，其中，所述至少两种抗原为不同的抗原。
28.如权利要求1-27中任一项所述的组合物，其中，所述至少两种抗原为相同抗原的不同变体。
29.如权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中，所述至少两种抗原为相同抗原的不同结构域或不同部分。
30.如权利要求1-29中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含连接至所述抗原的柔性接头肽，其中，所述柔性接头肽将所述抗原连接至所述互补亲和分子。
31.如权利要求1-30中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少2种抗原。
32.如权利要求1-31中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少3种抗原。
33.如权利要求1-32中任一项所述的组合物，所述组合物包含至少5种抗原。
34.如权利要求1-30中任一项所述的组合物，所述组合物包含2-10种抗原。
35.如权利要求1-33中任一项所述的组合物，所述组合物包含10-15种抗原。
36.如权利要求1-33中任一项所述的组合物，所述组合物包含15-20种抗原。
37.如权利要求1-33中任一项所述的组合物，所述组合物包含20-50种抗原。
38.如权利要求1-33中任一项所述的组合物，所述组合物包含50-100种抗原。
39.如权利要求1-33中任一项所述的组合物，所述组合物包含超过100种抗原。
40.如权利要求1-39中任一项所述的组合物，其中，所述抗原来自病原性生物体。
41.如权利要求1-40中任一项所述的组合物，其中，所述抗原来自肿瘤。
42.如权利要求1-41中任一项所述的组合物，其中，所述抗原选自于由以下抗原所组成的组: 肺炎球菌抗原、结核抗原、炭疽抗原、HIV抗原、季节性流感抗原或流行性流感抗原、流感抗原、百日咳抗原、金黄色葡萄球菌抗原、脑膜炎球菌抗原、嗜血杆菌抗原、HPV抗原，或上述抗原的组合。
43.如权利要求1-42中任一项所述的组合物，其中，所述多糖选自于由以下多糖所组成的组:Vi多糖、肺炎球菌荚膜多糖、肺炎球菌细胞壁多糖、b型流感嗜血杆菌多糖、脑膜炎球菌多糖、以及其它细菌荚膜多糖或细胞壁多糖。
44.如权利要求1-43中任一项所述的组合物,所述组合物进一步包含与所述聚合物或多糖缔合的至少一种共刺激因子。
45.如权利要求1-44中任一项所述的组合物，其中，所述共刺激因子选自于由以下共刺激因子所组成的组: Toll样受体配体或激动剂、NOD配体或激动剂、或者炎性小体激活剂/激动剂。
46.如权利要求44所述的组合物，其中，所述共刺激因子直接连接至聚合物，或通过互补亲和分子对连接至聚合物，所述互补亲和分子对包含: 第一亲和分子，所述第一亲和分子与所述聚合物缔合；以及 互补亲和分子，所述互补亲和分子与所述共刺激因子缔合， 其中，所述第一亲和分子与所述互补亲和分子缔合，从而将所述共刺激因子连接至所述聚合物。
47.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物用于在受试者中引发免疫应答。
48.如权利要求47所述的组合物，其中，所述免疫应答为抗体应答/B细胞应答。
49.如权利要求48所述的组合物，其中，所述免疫应答为针对所述聚合物的抗体应答/ B细胞应答。
50.如权利要求48所述的组合物，其中，所述免疫应答为针对与所述聚合物缔合的所述抗原的抗体应答/B细胞应答。
51.如权利要求48所述的组合物，其中，所述免疫应答为CD4+T细胞应答，所述CD4+T细胞应答包括Thl应答、Th2应答和Th 17应答。
52.如权利要求51所述的组合物，其中，所述免疫应答为特异性针对所述聚合物或多糖的⑶4+T细胞应答。
53.如权利要求51所述的组合物，其中，所述免疫应答为特异性针对与所述聚合物或多糖缔合的所述抗原的CD4+T细胞应答。
54.如权利要求47所述的组合物，其中，所述免疫应答为CD8+T细胞应答。
55.如权利要求54所述的组合物，其中，所述免疫应答为特异性针对所述聚合物或多糖的⑶8+T细胞应答。
56.如权利要求54所述的组合物，其中，所述免疫应答为特异性针对与所述聚合物或多糖缔合的所述抗原的CD8+T细胞应答。
57.如权利要求1-56中任一项所述的组合物,所述组合物进一步包含至少一种佐剂。
58.一种用于在受试者中诱导针对至少一种抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述受试者如权利 要求1-57中任一项所述的组合物。
59.一种针对带有至少一种抗原的病原体对哺乳动物进行接种的方法，所述方法包括给予如权利要求1-57中任一项所述的免疫原性组合物。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中，所述受试者为人。
61.如权利要求58或59所述的方法，其中，所述受试者为农业动物或非驯养动物。
62.如权利要求58或59所述的方法，其中，所述受试者为驯养动物。
63.如权利要求58或59所述的方法，其中，经由皮下注射、鼻内注射、皮内注射或肌内注射进行给药，或者经由透皮皮肤贴剂进行给药。
64.如权利要求58所述的方法，其中，所述免疫应答为抗体应答/B细胞应答。
65.如权利要求58所述的方法，其中，所述免疫应答为CD4+T细胞应答，所述CD4+T细胞应答包括Thl应答、Th2应答或Th 17应答。
66.如权利要求58所述的方法，其中，所述免疫应答为CD8+T细胞应答。
67.如权利要求1-57中任一项所述的组合物在对暴露于病原体或免疫威胁进行诊断中的用途。
68.—种试剂盒，所述试剂盒包含: (?)含有多糖的容器，所述多糖与多个第一亲和分子交联；以及(iii)含有互补亲和分子的容器，所述互补亲和分子与所述第一亲和分子缔合，其中，所述互补亲和分子与抗原缔合。
69.如权利要求68所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含将所述互补亲和分子连接至所述抗原的手段。
70.如权利要求68所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含至少一种共刺激因子。
71.如权利要求68-70中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含用于将所述共刺激因子连接至所述多糖的交联剂，所述交联剂选自于由以下交联剂所组成的组: CDAP (1-氰基-4- 二甲基氨基吡卩定四氟硼酸盐)、EDC (1-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)、氰基硼氢化钠、溴化氰、或碳酸氢铵/碘乙酸。
72.—种试剂盒，所述试剂盒包含: (?)含有聚合物的容器； (iii)含有多个第一亲和分子的容器；以及 (iv)含有交联剂的容器，所述交联剂用于将所述第一亲和分子交联至所述聚合物。
73.如权利要求72所述的试剂盒，其中，所述试剂盒为多糖。
74.如权利要求72所述的试剂盒，其中，所述交联剂选自于由以下交联剂所组成的组: CDAP (1-氰基-4- 二甲基氨基吡卩定四氟硼酸盐)、EDC (1-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)、氰基硼氢化钠、溴化氰、碳酸氢铵/碘乙酸，以及上述交联剂的衍生物。
75.如权利要求72所述的试剂盒，所述试剂盒任选包含含有表达载体的容器，所述表达载体用于表达抗原-亲和分子融合蛋白。
76.如权利要求72所述的试剂盒，其中，所述表达载体任选含有接头肽序列，其中，所述表达载体表达含有接头肽的抗原-亲和分子融合蛋白，所述接头肽位于所述抗原和所述未和分子之间。
77.如权利要求72所述的试剂盒，所述试剂盒任选包含含有互补亲和分子的容器，所述互补亲和分子与所述第一亲和分子缔合，其中，所述互补亲和分子与抗原缔合。
78.如权利要求72所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含将所述互补亲和分子连接至所述抗原的手段。
【文档编号】A61K39/39GK103648489SQ201280034406
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年5月11日 优先权日:2011年5月11日
【发明者】理查德·马利, 陆英杰, 张帆 申请人:儿童医疗中心有限公司