具有氢氧化铝纳米颗粒的疫苗组合物的制作方法
【专利摘要】本发明包含至少一种抗原和一种佐剂的疫苗组合物，其特征在于该佐剂包含能够无菌过滤的、包含假勃姆石和聚丙烯酸盐的纳米颗粒。
【专利说明】具有氢氧化铝纳米颗粒的疫苗组合物
[0001]本发明涉及疫苗领域，并且更具体地涉及包含至少一种佐剂的疫苗组合物。具体而言，本发明涉及疫苗组合物，其包含能够无菌过滤的、包含假勃姆石(pseudo-boehmite)和聚丙烯酸盐(polyacrylate) (PAA)的纳米颗粒。
[0002]本领域中长期以来已知晓用铝将疫苗佐剂化是有利的。许多市售疫苗包含铝，或以氢氧化物形式或以磷酸盐形式；然而，这些名称无法准确反映对应产品的化学组成:氢氧化铝更应是羟基氧化物，并且磷酸铝则很少是纯磷酸盐，而更常见的是包含其他离子，尤其是硫酸盐还有氢氧化物。尽管这些还已知为铝凝胶的基于铝的佐剂已经显示出它们在提高由抗原诱导的免疫应答中的所有优点，但是，它们的确具有某些缺点。从工业的观点来看，由于颗粒大小过大，因此氢氧化铝或磷酸铝的常规悬浮液无法在生产结束时通过过滤来进行灭菌，并因此需要依靠在无菌条件下进行生产过程。此外，在某些施用方式(尤其是皮内施用)的情况下，已经指责了铝会导致施用部位处的纹身效应。因此，期望拥有有效的包含铝的疫苗组合物，以从它的佐剂能力中受益而同时又避免其缺点。为此目的，本发明提出包含至少一种抗原和佐剂的疫苗组合物，其特征在于所述佐剂包含能够无菌过滤的、包含假勃姆石和聚丙烯酸盐的纳米颗粒。
[0003]本发明的主题还是能够无菌过滤的、包含假勃姆石和聚丙烯酸盐的纳米颗粒用于制备包含至少一种抗原的疫苗组合物的用途。
[0004]具体而言，本发明具有此类纳米颗粒的用途，所述纳米颗粒可以增加在施用所述疫苗组合物的过程中诱导的免疫应答。
[0005]本发明的主题还是包含至少一种抗原和佐剂的疫苗组合物的制备方法，根据所述方法:
O制备能够无菌过滤的、包含假勃姆石和聚丙烯酸盐的纳米颗粒，
O利用灭菌滤器将所述纳米颗粒过滤，
O将至少一种疫苗抗原加入所述纳米颗粒中，
O并且，任选地，如需要，进行额外的过滤。
[0006]通过本发明的主题，可以拥有这样的疫苗佐剂，其较常规使用的铝悬浮液诱导较低的反应原性反应，尤其在皮内(ID)施用后更是如此，并且其可以在制造过程结束时经过滤进行灭菌。
[0007]本发明的其他 优点将在以下描述过程中显示。
[0008]在本发明的术语中，纳米颗粒是其大小允许它们经过灭菌滤器的颗粒，所述灭菌滤器的孔具有220 nm的直径。因此，所述颗粒具有小于300 nm的大小，这是由于此类颗粒能够通过变形而经过更小尺寸的孔。然而，优选地，所述颗粒具有小于220 nm的大小，并且甚至小于200 nm。此类颗粒形成透明的胶悬液。有利地，使用其中大部分颗粒直径为30-200 nm的悬浮液，其允许用截 止阈值为220 nm的灭菌滤器将它们过滤，而不会过度损失材料。颗粒的直径是流体力学直径，其可以经不同技术来测量:例如，可以使用准弹性光散射(la diffusion quas1-elastique de la lumiere)0该技术可以测量胶悬液中半径从I纳米至几微米的颗粒的大小。液体中悬浮的颗粒会进行布朗运动(热搅动和液体分子和固体颗粒之间的碰撞)。光散射测量的原理在于用激光类型的连贯的和单色辐射轰击胶悬液中的颗粒，并随后利用雪崩光电二极管(photodiode ? avalanche)(用于对光子数记数的设备)记录由这些颗粒散射的光强中的波动。
[0009]这些实验通常在完全稀释的对于眼为透明的介质中进行。在本发明的情况下，在去矿质水中稀释(通常1/10)后测定纳米颗粒的直径。所用机器模型为Malvern ZetaSizerNano ZS0
[0010]根据本发明，纳米颗粒为基本上由在它们的表面上具有聚丙烯酸盐的假勃姆石组成，以防止通过透析洗涤纳米颗粒后纳米颗粒的聚集。根据本发明的具体方式，经静电类型的相互作用使聚丙烯酸盐与假勃姆石结合。根据本发明的一种方式，聚丙烯酸盐的量表示少于纳米颗粒质量的10%的质量，更具体而言，为少于9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%的质量。根据本发明的一种方式，聚丙烯酸盐的量表示至少等于纳米颗粒质量的1%的质量，更具体而言，为大于2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%的质量。
[0011]在鉴定本发明的纳米颗粒的基本成分中，作为假勃姆石可以通过X射线衍射分析进行，其产生假勃姆石的X射线衍射图特征为在14、28.1,32.4,49.3,55.5和65° 2 Θ(λ=0.15406 nm)处观察到的主线(020)、(021)、(130)、(150)、(151)和(132)。
[0012]使用聚丙烯酸盐，这是由于所用的聚合物必须是生物相容的，即它们必须对于它们所施用的生物没有毒性。此外，在合成纳米颗粒过程中，所用的聚合物必须在所用的温度是稳定的。所用的聚丙烯酸盐可以是多种分子量的；尤其它可以是聚丙烯酸钠或适合于药学用途的任何其他盐的聚丙烯酸盐。用由Fl uka公司提供的聚丙烯酸盐PAA 2100以及用来自Polysciences的PAA-60 000获得了良好结果。
[0013]按照由S.Musi 等(^Materials Chemistry and Physics, 1999，59, 12-19题为 Chemical and mi cros true tural properties of A1-oxide phases obtained fromAlCl3 solutions in alkaline中描述的方法启发而产生的方法制备颗粒。按照S.Musi等，通过加入碱(NaOH)使铝盐水溶液的pH在5分钟的时期内升高到略高于11的值(使用PH计控制)。随后，将混合物剧烈搅拌10分钟，并随后转移至高压灭菌器中并加热至160°C保持24小时。将产物(均匀的发白溶液(whitish solution))通过Biichner过滤回收，洗涤并随后在65°C在烘箱中干燥过夜。在本发明的合成的情况下，并且如Y.Mathieu等在 Langmuir 2007, 23, 9435-9442 中的 Control of the morphology and particlesize of boehmi te nanoparticles synthesized under hydro thermal conditions 中所描述，该合成在聚丙烯酸钠存在的情况下进行，在开始时将所述聚丙烯酸钠加入铝盐的水溶液中。聚合物的存在防止所形成颗粒的聚集。选择聚丙烯酸盐和铝盐的相对量，从而能够将聚丙烯酸盐溶解于铝盐溶液中，并获得适合用作疫苗佐剂的可过滤的纳米颗粒。因此，指出用PAA 2100时，使用聚丙烯酸钠与铝的摩尔比为0.43-0.57是有利的。
[0014]在加入碱之前，使聚丙烯酸钠和铝盐的混合物进入成熟期，在该过程中将其搅拌。在室温将该成熟期有利地进行约24小时。从工业的观点来看，于室温在短时期内(如需要，可以将其例如延长至数周)进行，这是非常有利的。
[0015]用于生产纳米颗粒的铝盐可以是多种性质:它们尤其可以是氯化铝AlCl3、硝酸铝Al (NO3) 3或硫酸铝Al2 (SO4) 3 ;优选选用氯化铝A1C13。
[0016]可用于增加混合物的pH的碱是多种类型的，并且尤其可以选自NaOH、KOH或NH4OH。有利地，使用氢氧化钠NaOH进行纳米颗粒的合成。
[0017]根据本发明，在操作过程中在5-10分钟内，使用氢氧化钠来增加pH直至约10-11的值。在该PH增加期内，存在的多种的铝种类经历变化(诸如离解和重排)以导致形成不同程度的晶相。
[0018]根据本发明，随后将该混合物进行水热处理一段时期，其范围可以为1-17小时；有利地，对于所获的颗粒的大小以及它们的可过滤性，选用3小时的持续时间。在900C -200°C的温度，更具体而言在160°C，以静置方式或搅拌进行该处理。
[0019]根据本发明，所获的纳米颗粒能够无菌过滤，其表示它们具有能使它们经过孔径为220 nm的灭菌滤器的大小；在这样的过滤过程中观察到的损失与工业约束是一致的。具体而言，在0.22 Mm PTFE (聚四氟乙烯)滤器上进行的检测显示所发生的聚合物和铝少于5%的损失，该5%的值可能对应于测定技术的误差界限。
[0020]根据本发明，纳米颗粒可以悬浮于盐水溶液或生物缓冲液中。尤其是，在PBS(磷酸缓冲液盐溶液)缓冲液中、TRIS (三(羟甲基)氨基甲烷)缓冲液中或在包含90 g/Ι的NaCl、
0.12 g/1的Na2HPO4和0.6 g/Ι的KH2PO4的盐水溶液中进行检测。
[0021]根据本发明的具体特征，包含假勃姆石和聚丙烯酸盐的纳米颗粒的悬浮液还包含表面活性剂，尤其是中性表面活性剂诸如Brij ? 58,Pluronic ? 123或Tween? 60、或者阴离子表面活性剂诸如SDS (十二烷基硫酸钠)、或者聚合物诸如PEG (聚乙二醇)。因此，所形成的纳米颗粒的稳定可以经位阻效应或经静电排斥来增加。
[0022]根据本发明，疫苗组 合物包含至少一种抗原。
[0023]为了开发本发明的目的,使用纯化的破伤风蛋白(tetanus protein)作为模型抗原。随后用其他抗原，尤其是流感抗原(influenza antigens)、痕疾抗原LSA3 (malariaantigen LSA3)、或者ETEC (肠毒性大肠杆菌(AscAericAia coJ7))重组抗原进行检测。然而，本发明的疫苗组合物可以包含可用于疫苗中的任何抗原，无论它是否是完整的微生物、亚基抗原，其不考虑它的性质可以是天然的、重组的、杂合等；所述抗原实际上可以是肽、蛋白、糖蛋白、多糖、糖脂、脂妝、VLP (病毒样颗粒)等。
[0024]这些抗原是这样的抗原，其已被使用或者可以被使用用于治疗或预防易于影响动物界并且具体是人的多种疾病，尤其为:白喉(diphtheria)、破伤风(tetanus)、脊髓灰质炎(polio)、狂犬病(rabies)、百日咳(whooping cough)、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎(hepatitis A, B or C)、黄热病(yellow fever)、伤寒(typhoid fever)、水痘(chickenpox)、麻疫(measles)、腿腺炎(mumps)、德国麻疫(German measles)、乙型脑炎(Japaneseencephalitis)、流感(influenza)、脑膜炎(meningitis)、霍乱(cholera)、由以下病毒介导的传染:轮状病毒(Rotavirus)、诺如病毒(Norovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)、单纯疱疫病毒(/ferpes Simplex Virus)、乳头状瘤病毒(Papilloma Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)、西尼罗河病毒(West NileVirus)、登革热病毒(Dengue Virus)、基孔肯雅病毒(Chykungunya Virus)、HIV (AIDS),由以下引起的细菌性疾病:链球菌(streptococci)、沙眼衣原体和肺炎衣原体焊trachomatis and pneumoniae、、淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌{Neisseriagonorrheae and粘膜炎莫拉氏菌(iforax<977a caiarrAaJis)、金黄色葡萄球菌<3?<9?5.)或 B 型流感嗜血菌influenza type B),李斯特菌病(listeriosis)、志贺氏菌病(shigellosis)、沙门氏菌病(salmonellosis)、结核病(tuberculosis)、莱姆病(Lyme，s disease)、癌症、寄生虫疾病(parasitic complaints)诸如痕疾(malaria)、利什曼病(leishmaniasis)等。
[0025]本发明的药物组合物可以是针对单一病原体或癌症的免疫的组合物，即它包含一种或多种单一病原体或癌症的抗原，或者可以是针对几种病原体或癌症的免疫的组合物(在这种情况下，将它称为疫苗组合)。本发明的组合物还可以包含对单一疾病(但属于该疾病原因的不同类别(根据原因的性质，可以是几种菌株或血清型、或进化枝))特异的几种抗原。它还可以是包含过敏原的疫苗组合物，尤其是旨在治疗过敏反应的领域中用于脱敏时。
[0026]本发明的疫苗组合物可以经任何通常用于施用疫苗的途径来施用；然而，皮内(intra-dermique)途径是特别有利的。具体而言，尽管它对于诱导良好的免疫反应是非常有效的，但皮内途径具有经常导致局部的反应原性反应的缺点，这会妨碍它的使用。由于本发明的纳米颗粒，可以进行具有非常低的或没有反应原性反应的皮内免疫，并且尤其是没有纹身效应，而其已经是本领域的铝悬浮液的情况。
[0027]根据本发明，通过将包含假勃姆石和聚丙烯酸盐的纳米颗粒的悬浮液和抗原悬浮液简单混合来制备疫苗组合物。该操作可以通过向包含纳米颗粒的胶悬液中加入抗原或者通过向已包含抗原的悬浮液中加入纳米颗粒来进行。此外，在期望拥有包含几种类型抗原的疫苗组合物的情况下，可以优选来优先进行某些抗原相对于其他的吸附。具体而言，在疫苗组合物包含抗原的混合物(其中的一些由于稳定性或免疫原性的原因，不应该被吸附)的情况下，可以优选来以以下方式进行:在引入不应该被吸附的抗原`之前，首先用需要吸附的抗原或用存在于缓冲物质中的离子或赋形剂使基于铝的颗`粒饱和。
[0028]在制备本发明的纳米颗粒过程中，可能会存在过量的聚合物。为了去除这些可能的过量聚合物，可以在制备纳米颗粒阶段之后直接进行额外步骤，或者在与抗原混合的阶段之后进行额外步骤。可以通过针对去矿质水(Milli Q, Millipore)、盐水溶液或生物缓冲液经合适孔隙度(根据纳米颗粒的大小为30-100 kDa)的膜透析(dialyse)或渗滤(diafiltration)来进行该去除阶段。
[0029]以下实施例说明本发明的实施方案。
[0030]实施例1:合成假勃姆石纳米颗粒的胶悬液
使用由Fluka提供的分子量2100的聚丙烯酸钠(NaPa)和由Avocado提供的氯化招六水合物(AlCl3.6H20)。
[0031]将9 g的NaPa溶于75 ml 0.1 M的AlClyK溶液。于室温将所获混合物剧烈搅拌24小时。随后混合物的pH为5.5-5.9。随后逐滴加入5 M氢氧化钠NaOH直至获得10.5的pH，并且随后将混合物进一步搅拌10分钟。当pH升高达到9.0-9.5时，溶液变得轻微混浊，这是由于假勃姆石纳米颗粒的沉淀。为了获得最终的纳米颗粒，将在PH 10.5处获得的悬浮液转移入高压灭菌器中，并于160° C轻柔搅拌(15 rpm)加热3小时。随后,通过使用装有30 kDa聚醚聚砜膜的Sartorius Slice 200台式机对5L的蒸懼水透析来洗漆胶悬液。所获的胶悬液储存于聚丙烯瓶中。所进行的大小测量显示存在纳米颗粒的单个群，其大小范围为15-40 nm (数值分布)，具有0.19的多分散性指数(强度分析)。为了物理化学分析目的，通过在25 000 rpm离心I小时并于80° C干燥过夜来获得固体材料的样品。
[0032]利用Stoe-Stad1-P衍射仪使用铜的K α I线(λ =1.5406Α)通过X射线衍射来分析样品。由于存在由锗晶体组成的前单色仪，因此辐射完全是单色的。对于该分析，将预先磨碎的样品置于Lindemann管中(直径为0.3 mm)。使置于测角头(goniometric head)上的毛细管旋转，并在Debye-Scherrer模式中使用能够覆盖11° (2 Θ )的角方位的PSD型短线性检测器(位置敏感检测器)记录衍射图。
[0033]干燥样品的X射线衍射分析产生了假勃姆石的特征结果。
[0034]所获的纳米颗粒能够经0.2 Mm Millipore PVDF膜无菌过滤,具有通过原子吸收测定的最小材料损失(3.1%)。
[0035]实施例2:使用分子暈60 000的聚丙烯酸钠溶液合成假勃姆石和聚丙烯酸盐.的纳米颗粒
使用由Polysciences提供的以35% (w/w)水溶液形式的分子量60 000的聚丙烯酸钠(NaPa)和由Fluka提供的氯化铝六水合物(AlCl3.6H20)。
[0036]为了获得36 g的聚合物，取用包含66.86 g水的102.86 g的聚合物水溶液。
[0037]将7.2429 g的AlCl3置于烧杯中，并向其加入225.89 g的水。
[0038]向聚合物溶液中加入该铝溶液，从而获得300 ml的0.1 M AlCl3溶液。
[0039]所获的混合物为白色的。
[0040]将该混合物剧烈搅拌24小时。
[0041]24小时后，混合物的pH为6.1。随后逐滴加入5 M氢氧化钠NaOH，直至pH为10.2。
[0042]将该混合物搅拌均化I小时，并随后置于高压灭菌器中搅拌(1400 rpm)并于160° C加热3小时。
[0043]所获的溶液为轻微乳白色的，并且X射线衍射分析显示它由具有假勃姆石的峰特征的纳米颗粒组成 ，并且所述纳米颗粒具有约100 nm的平均大小,符合灭菌过滤。
[0044]该溶液能够储存超过I年，同时保持纳米颗粒的完整性，其不会再聚集。
[0045]实施例3:制备包含氢氧化铝的纳米颗粒和纯化的破伤风蛋白的疫苗组合物，及过滤检测
通过向按照实施例1制备的4.5 ml假勃姆石纳米颗粒悬浮液中加入10 μ?的测定浓度为1200絮凝单位/ml盐水溶液的纯化的破伤风蛋白制剂来制备疫苗组合物。
[0046]将该混合物温和地搅拌并随后经过固定于5 ml塑料注射器上的PVDF膜(由Millipore 提供)。
[0047]在向纳米颗粒中加入破伤风蛋白之前和之后均进行纳米颗粒大小的测量；无论是否存在蛋白，均获得相同的大小概况，其证明破伤风蛋白没有导致纳米颗粒的聚集。
[0048]类似地，测定过滤导致铝3%的损失，其从工业的观点来看是完全可接受的。
[0049]因此，可以下结论本发明的疫苗组合物可以在0.22 Mffl灭菌滤器上过滤，而不会过度损失材料。
[0050]实施例4:对皮内施用包含纳米颗粒和流感抗原的本发明组合物的小鼠的反应原性检测
使用雌性BALB/c小鼠作为用于该检测的动物模型，以评价本发明的组合物相比于标准铝悬浮液的局部反应原性。
[0051]在该检测中，抗原由已知为Flu ID原液的三价流感疫苗组成，其以每毒株150 μδ/πι1的HA的比例包含灭活的片段化的毒株A/Solomon/3/2006 (HlNl)、A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)和 B/Malaysia/2506/2004。
[0052]四组的10只小鼠以3周的时间间隔向耳的内表面内皮内接受亚最适剂量的30 μ?(即0.3 μg的HA/毒株)的(存在佐剂或不存在佐剂的)疫苗。
[0053]按以下方式制备所施用的组合物:
-A组:单独Flu ID ;将54 μ?的Flu ID原液在756 μ?的PBS缓冲液中稀释。
[0054]- B组:Flu ID + A100H ;连续加入以下组分:
O 54 μ? 的 Flu ID 原液
O 604 μ?的PBS缓冲液
O 152 μ? 的包含 8.01 mg/ml 招的 Α100Η 市售悬浮液(Alhydrogel?)
将该混合物温和地搅拌2小时。
[0055]- C组:Flu ID + AlPO4 ;连续加入以下组分:
O 54 μι 的 Flu ID 原液
O 463 μ?的PBS缓冲液
O 293 μ? 的包含 4.15 mg/ml 招的 AlPO4 市售悬浮液(Alhydrogel?)
将该混合物温和地搅拌2小时。
[0056]- D组:Flu ID +纳米A100H ;连续加入以下组分:
O 54 μ? 的 Flu ID 原液
〇5 μ?的H2O
O 76 μ?的10倍浓缩的PBS缓冲液
O 675 μ?的以实施例1中描述的方式制备的且包含1.8 mg的Al/ml的假勃姆石纳米颗粒悬浮液。
[0057]于室温将混合物温和地搅拌2小时。
[0058]每日监测小鼠，并将耳上出现的水肿、红斑和病变按非正式标准进行分级，直至每一注射后2周。
[0059]不考虑所检测的制剂，没有观察到明显的红斑。类似地，没有报道水肿。
[0060]然而，在注射点上发现白色/微红色的小结块，这出现在小鼠接受包含标准铝的组合物的情况下，而无论用氢氧化铝或用磷酸铝均是如此。然而，令人惊讶且非常有趣的是，在接受本发明的组合物的小鼠上没有可见的小结块。
[0061]关于施用包含现有技术的铝的佐剂后出现小结块的小鼠数目的结果显示在下文表1中:
表1
【权利要求】
1.疫苗组合物，其包含至少一种抗原和佐剂，其特征在于所述佐剂包含能够无菌过滤的、包含假勃姆石和聚丙烯酸盐的纳米颗粒。
2.权利要求1的疫苗组合物，其特征在于所述纳米颗粒的核基本上由假勃姆石组成，并且所述聚丙烯酸盐基本上位于所述纳米颗粒的表面。
3.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其特征在于假勃姆石的质量是所述纳米颗粒至少90质量％。
4.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其特征在于所述纳米颗粒的大小小于300nm，并且有利地为小于220 nm。
5.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其特征在于它包含至少一种流感抗原。
6.前述权利要求中任一项的疫苗组合物，其特征在于它包含至少一种破伤风蛋白。
7.纳米颗粒在制备包含至少一种抗原的疫苗组合物中的用途，所述纳米颗粒能够无菌过滤且包含假勃姆石和聚丙烯酸盐。
8.前述权利要求的用途，其特征在于所述疫苗组合物用于皮内施用。
9.权利要求7或8的用途，其特征在于所述疫苗组合物包含至少一种流感抗原。
10.权利要求7-9中任一项的用途，其特征在于所述纳米颗粒能增加在所述疫苗组合物的施用过程中诱导的免疫应答。
11.权利要求1-6中任一项的疫苗组合物的制备方法，根据所述方法: O制备能够无菌过滤的、包含假勃姆石和聚丙烯酸盐的纳米颗粒，` O利用灭菌滤器将所述纳米颗粒过滤， O将至少一种疫苗抗原加入所述纳米颗粒中， O并且，任选地，如需要，进行额外的过滤。
【文档编号】A61K39/39GK103826658SQ201280034602
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年7月12日 优先权日:2011年7月13日
【发明者】Y.马蒂厄, B.勒博, V.瓦尔谢夫, J.帕塔兰, M.加里诺, J.安斯勒, E.索佐 申请人:赛诺菲巴斯德有限公司