抗淀粉样蛋白的ɑ-螺旋阻断超小肽疗法
【专利摘要】本发明提供了能够阻止淀粉样蛋白形成/淀粉样变性的超小肽抑制剂。
【专利说明】抗淀粉样蛋白的α-螺旋阻断超小肽疗法
[0001]本发明提供了能够阻止淀粉样蛋白形成(amyloid formation)/淀粉样变性(amyloidosis)的超小肽抑制剂。
[0002]发明人最近发现一种系统性设计的超小肽可以逐步形成淀粉样结构。该启动步骤通过关键的α-螺旋中间结构发生，而该α-螺旋中间结构在最终的β_型淀粉样蛋白结构形成前建立。抗淀粉样蛋白肽疗法的基本原理因此是基于使用阻止α-螺旋中间结构形成的抑制性肽这样的理念。
[0003]淀粉样蛋白是不可溶的、富含交叉折叠片结构的蛋白质原纤维的组织沉积物。淀粉样原纤维的形成过程在多种多样且与结构上无关的病理过程中均为关键事件。这包括许多慢性的、衰竭性的及日渐流行的疾病，可以大致分为:1)神经退行性疾病，例如:阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏病；2)非神经性的局限性淀粉样变性，例如2型糖尿病；以及3)发生在多种组织中的系统性淀粉样变性。尽管与这些蛋白质错折叠疾病(PMDs)相关的症状和蛋白质单体存在差异，似乎存在一种分子水平上蛋白质聚集的共同机制。淀粉样原纤维的形成是通过分子识别和自组装过程，该自组装过程通常肇始于一段热力学意义上不利的停滞期，目的是为了形成“核或种子”。随之而来的则是一段热力学意义上有利的指数生长期，在此期间单体/寡聚物被加到成长的核上。蛋白质的构象转变从可溶的无规卷曲形式经由具α-螺旋的中间物形成为不可溶的交叉β-折叠纤维聚合物，这被认为是淀粉样蛋白生成(amyloidogenesis)的重要事件。
[0004]为了抑制这一过程，最近的科学研究集中在更深入地了解淀粉样变性的分子识别和自组装的机制，尚没有针对上述任一种疾病的有效的预防和治疗。因此急需可安全地拮抗和阻止淀粉样蛋白生成的小分子作为治疗药物。抗淀粉样蛋白候选物也需能够满足严格的要求，例如高效和易于摄取，在体内有足够长的半衰期和循环时间，无毒性，且具有治疗神经退行性疾病所需的通过血脑屏障(BBB)的通透性。此外，由于新增证据表明前原纤维寡聚中间物可能比成熟的淀粉样纤维毒性更高，所以在早期阻断或逆转自组装过程变得非常重要。
[0005]因此，本发明的目的是提供一种具有上述特性的新型化合物。
[0006]本发明的目的是通过分离的α -螺旋阻断肽来解决，该分离的α _螺旋阻断肽具有通式
[0007]Z-(X)m-Proline-(X)n,
[0008]其中
[0009]Z为N端保护基团；
[0010]X在每次出现时为独立地选自氨基酸和氨基酸衍生物；以及
[0011]m和η表示氨基酸和氨基酸衍生物的数量，并为独立地选自I到5之间的整数，且m+n ^ 6。
[0012]脯氨酸使用三字母 密码子(Pro)或单字母密码子(P)来缩写。
[0013]在一个实施方案中，m+n ( 5,优选地< 4,更优选地< 3。
[0014]“氨基酸和氨基酸衍生物”包括:天然和非天然存在的L-型和D-型氨基酸和氨基酸衍生物、模拟肽氨基酸和非标准氨基酸；该非标准氨基酸不是由标准细胞内机制产生的，是仅存在于经翻译后修饰的蛋白质中，或是代谢中间产物，例如羟脯氨酸、硒代甲硫氨酸、肉毒碱、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、羊毛硫氨酸、GABA和β -丙氨酸。
[0015]在一个实施方案中，X在每次出现时均独立地选自天然氨基酸。
[0016]在一个实施方案中，至少一个X为D-型氨基酸或模拟肽氨基酸。
[0017]在一个实施方案中，X在每次出现时均独立地选自非芳香族氨基酸和氨基酸衍生物。
[0018]在一个实施方案中，所述非芳香族氨基酸选自异亮氨酸(He，I)、亮氨酸(1^11，0、缬氨酸(￥&1，￥)、丙氨酸(41&^)、甘氨酸(617，6)、天冬氨酸(4邓，0)、天冬酰胺(八811，幻、谷氨酸(61113)、谷氨酰胺(6111，0)、丝氨酸(5#，5)、苏氨酸(1111.，!')和赖氨酸(Lys, K)。
[0019]在一个实施方案中，所述肽的N端氨基酸的疏水性比所述肽的C端氨基酸更强。在一个实施方案中，疏水性由N端向C端减弱。
[0020]在一个实施方案中，m和η是1，即，所述肽具有通式
[0021]Z~K_Proline~K。
[0022]在一个实施方案中，所述N端保护基团具有通式-C(O) -R，其中R选自氢、烷基和取代烷基。在一个实施方案中，R选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基。
[0023]在一个优选实施方案中，所述N端保护基团为乙酰基(R为甲基)。
[0024]在一个实施方案中，所述肽的C末端酰胺化或酯化，其中，优选地，C末端具有通式-C0NHR，且R选自氢、烷基和取代烷基，或通式-C00R，其中R选自烷基和取代烷基。
[0025]在一个实施方案中，在水溶液中准备所述肽，所述水溶液可选择地包括生理缓冲液。
[0026]在一个实施方案中，所述肽基于下述肽发展而来:Z-LIVAGDD (SEQ ID N0:1)、Z-LIVAGEE (SEQ ID NO:2),Z-LIVAGD (SEQ ID NO:3),Z-1LVAGD (SEQ ID NO:4),Z-LIVAAD(SEQ ID NO:5)、Z-LAVAGD (SEQ ID NO:6)、Z-AIVAGD (SEQ ID NO:7)、Z-LIVAGE (SEQ IDNO:8)、Z-LIVAGK (SEQ ID NO:9)、Z-LIVAGS (SEQ ID NO:10),Z-1LVAGS (SEQ ID NO:11)、Z-AIVAGS (SEQ ID NO: 12),Z-LIVAGT (SEQ ID NO: 13),Z-AIVAGT (SEQ ID NO: 14),Z-LIVAD(SEQ ID NO: 15)、Z-LIVGD (SEQ ID NO: 16), Z-1VAD (SEQ ID NO: 17), Z-1IID (SEQ IDNO: 18)、Z-1IIK (SEQ ID NO: 19)和 Z-1VD (SEQ ID NO:20);这些作为基础的肽中，除了 N端或C端之外的一个氨基酸被替换为脯氨酸(Pro, P)。例如，根据本发明的分离α-螺旋阻断肽可能以上述列表中的肽Z-LIVAGD (SEQ ID NO:3)为基础，因此从Z-LPVAGD (SEQID NO:21)、Z-LIPAGD (SEQ ID NO:22)、Z-LIVPGD (SEQ ID NO:23)和 Z-LIVAPD (SEQ IDNO:24)中选择。
[0027]在一个实施方案中，所述肽选自Z-LPVAGD (SEQ ID NO:21), Z-LIPAGD (SEQ IDNO:22)、Z-LIVP⑶(SEQ ID NO:23)、Z-LIVAPD (SEQ ID NO:24), Z-1PD (SEQ ID NO:25)、Z-NPI (SEQ ID NO:26), Z-1PN (SEQ ID N0:27)、Z_IPI (SEQ ID NO:28), Z-APA (SEQ IDNO:29), Z-LPI (SEQ ID NO:30), Z-1PL (SEQ ID NO:31), Z-LPL (SEQ ID NO:32), Z-APF(SEQ ID NO:33)、Z-KPA-CONH2 (SEQ ID NO:34), Z-LPD (SEQ ID NO:35), Z-LPE (SEQ IDNO:36)、Z-1PK-CONH2 (SEQ ID NO:37), Z-APD (SEQ ID NO:38), Z-1PF (SEQ ID NO:39)、Z-1PS (SEQ ID NO:40)、Z-1PW (SEQ ID NO:41),Z-APS (SEQ ID NO:42)、Z-NPK-CONH2 (SEQID N0:43)和Z-LPG (SEQ ID N0:44)。SEQ ID N0s45至60代表上述序列的具体实施例。
[0028]本发明的目的也通过如上定义的用作为药物的分离α -螺旋阻断肽来解决。
[0029]本发明的目的还通过如上定义的用于治疗与淀粉样变性相关的疾病的分离α -螺旋阻断肽来解决。
[0030]在一个实施方案中，所述与淀粉样变性相关的疾病选自下列疾病:神经退行性疾病例如阿尔海默茨病、帕金森病、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS),朊病毒相关或海绵状脑病例如克雅二氏病(Creutzfeld-Jacob)、路易体痴呆(Dementia with Lewy bodies)、伴有帕金森病的额颞叶痴呆、脊髓小脑共济失调、17型脊髓小脑共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症(Hereditary dentatorubral-pallidoluysian atrophy)、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆，非神经性局限性疾病(Non-neuropathic localizeddiseases)例如II型糖尿病、甲状腺髓样癌、心房性淀粉样变性、遗传性淀粉样变性脑溢血、垂体泌乳素瘤、注射局部淀粉样变性(injection-localized amyloidosis)、主动脉中膜淀粉样变性、遗传性格子状角膜营养不良、与倒睫相关的角膜淀粉样变性、白内障、牙源性钙化上皮瘤、肺泡蛋白沉积症、包涵体肌炎、皮肤淀粉样变性苔藓，非神经性系统性淀粉样变性例如AL型淀粉样变性、AA型淀粉样变性、家族性地中海热、老年系统性淀粉样变性、家族性淀粉样多神经病、血透相关的淀粉样变性、ApoAI淀粉样变性、ApoAII淀粉样变性、ApoAIV淀粉样变性、芬兰遗传性淀粉样变性、溶菌酶淀粉样变性、纤维蛋白原淀粉样变性、冰岛遗传性脑淀粉样血管病、家族性淀粉样变性，以及发生在多种组织中的系统性淀粉样变性例如轻链淀粉样变性。 [0031 ] 在一个实施方案中，所述肽为口服施用。
[0032]本发明的目的还通过包含了如上定义的分离α -螺旋阻断肽的药物组合物来解决。
[0033]在一个实施方案中，所述药物组合物还包括至少一种药学上可以接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
[0034]在一个实施方案中，所述药物组合物还包括一价或二价金属盐，优选地为二价金属盐。
[0035]在一个实施方案中,所述金属选自钠、镁、和锌。
[0036]本发明的目的还通过如上定义的分离α -螺旋阻断肽在制备治疗与淀粉样变性相关的疾病的药物中的用途来解决。
[0037]本发明的目的还通过治疗与淀粉样蛋白变性相关疾病的方法来解决，所述方法包括将如上定义的分离α-螺旋阻断肽或如上定义的药物组合物给药于所需要的人的步骤。优选地，所述分离α-螺旋阻断肽或所述药物组合物为口服施用。
[0038]本发明的目的还通过解聚淀粉样蛋白斑或阻止其形成的方法来解决，所述方法包括将如上定义的分离α -螺旋阻断肽与所述淀粉样蛋白斑接触，从而解聚所述淀粉样蛋白斑或阻止其形成。
[0039]在一个实施方案中，该方法还包括将所述淀粉样蛋白斑与一价或二价金属盐接触，优选为二价金属盐，其中，优选地，所述金属选自钠、镁、钙和锌。[0040]发明人令人惊讶地发现特异性的、合理设计的超小肽可以抑制淀粉样蛋白形成。这些抑制肽由可以干扰和阻止α-螺旋中间结构的3-7个天然氨基酸组成。这些中间结构被认为在驱动淀粉样蛋白聚集并因此导致淀粉样蛋白形成的构象转变阶段中非常重要。特别地，发明人相信蛋白质从无规卷曲到α-螺旋的构象改变在分子自我识别中起到了重要的作用。通过阻断或抑制到α-螺旋的转变，可以在极早期(g卩，立刻或在几分钟内)中止/逆转淀粉样蛋白聚集过程。因此，这些抗淀粉样蛋白肽也可以被视为α-螺旋阻断物。抗淀粉样蛋白肽能够识别错误折叠蛋白质的短淀粉样蛋白识别基序并与所述基序相互作用，而其自身具有非常低的自组装成为有序超分子结构的倾向。由于抗淀粉样蛋白肽的长度短，特别是3聚体(3-mers)，其在有利于口服送药和血脑屏障通透性的同时，有可能避开蛋白酶识别和分解。另外，由于该些超小肽由无毒的氨基酸和氨基酸衍生物制成，优选地天然氨基酸，因此所述超小肽是无毒的。此外，为了帮助已存在的淀粉样蛋白的解聚，优选存在一价或二价金属盐。
[0041]总而言之，这些超短肽的小尺寸使其易于且有效地口服吸收，这是在给药方面的核心优势。此外，这些超短肽的小尺寸保证了以低成本来简单批量合成。在一个优选实施例中，因为基于肽的疗法是由天然氨基酸制成，所以其是无毒性的、无免疫原性的且有生物相容性的。长度上仅为3个氨基酸的超短肽还能够跨越血脑屏障，这是靶向抗神经退行性疾病治疗的核心要求。最后，该短肽基序有可能逃避内源性蛋白酶的识别和分解，因此提供了在生物体液和组织中更长的半衰期和生物有效性。
[0042]开发一种抑制淀粉样蛋白生成的有效小分子药物具有巨大且有吸引力的市场潜力，特别是由于存在 表明在大范围的疾病中存在淀粉样蛋白聚集的共同分子基础的大量证据。例如，仅仅是与淀粉样变性相关的众多疾病中的一种的阿尔茨海默病，是发达国家中老年痴呆(50-70%)最常见的成因和导致死亡的主要原因。在2010年，估计有3560万人患有痴呆，这一数字预期将在2030年近乎翻倍达到6570万以及在2050年达到11540万。另一个实例是11型糖尿病，这占了成人确诊糖尿病病例总数的90-95%。因为现有可用的口服药物旨在维持血糖达标，所以存在开发阻止引起胰脏细胞死亡的胰岛淀粉样蛋白形成的口服治疗的需求。一些现有药物还具有严重的副作用将被使用天然生物大分子所克服。就此，根据本发明的超小抑制肽在尝试克服现有药物的问题和局限性的同时，有望解决现有治疗需求。
[0043]对附图做出说明，其中
[0044]图1示出肽Ac-LD6, Ac-NL6和Ac-1D3在溶液形式(以较低浓度)和水凝胶形式(以较高浓度)中的圆二色性(CD)波谱；
[0045]图2示出硫黄素T (ThT)结合到阿尔茨海默病的核心序列KE7随着时间推移与荧光增强的相关联(=阳性对照；100 μ M)。在每个时间点测量9个独立样品(实验增益值设定:55)；
[0046]图3到17示出硫黄素T (ThT)结合到阿尔茨海默病的核心序列KE7在不存在和存在抑制肽I至5和7至16的情况。在每个时间点测量9个独立样品(实验增益值设定:55)；
[0047]图18示出对照值的分布(水加ThT染料)；
[0048]图19和20示出抑制肽自身没有增强ThT荧光；[0049]图21概述了用于本发明的抑制肽的筛选步骤；
[0050]图22示出使用场发射扫描电镜(FESEM)对本发明的抑制肽进行形态学研究；
[0051]图23示出溶血实验测试本发明的抑制肽的生物相容性；
[0052]图24示出在不同的NaCl浓度下，来源自10mg/mL Ac-LD6 (L)的水凝胶的作为角频率(rad/sec)的函数的储能模量G V机械强度；
[0053]图25示出肽Ac-NL6在三种不同浓度的圆二色性(⑶)波谱(A)和肽Ac_NL6&Ac-LD6的水凝胶(B)；
[0054]图26示出由1.5mM的Ac-KE7 (绿色)形成的水凝胶和1.5mM的Ac-KE7按1:20的摩尔比例与Ac-LPE (酒红色)和Ac-LPG (红色)相混合时的肽抑制剂溶液(非凝胶化)的流变学数据。图表显示储能模量(G’以Pa表示)(A)在1%应变(strain)时作为角频率(rad/sec)的函数,和(B)在室温25°C角频率为lrad/sec时的振荡应变(oscillation strain)；
[0055]图27示出使用U87人类胶质母细胞瘤细胞在不同浓度及存在或不存在抑制剂溶液中和的情况下抑制肽Ac-LG3和Ac-LE3的活/死细胞毒性检测的结果；
[0056]图28示出抑制肽Ac-LG3和Ac-LE3在不同浓度及存在或不存在抑制剂溶液中和的情况下WST-1检测的结果；
[0057]图29示出使用HeLa和SHSY5Y神经母细胞瘤细胞在不同浓度及存在或不存在抑制剂溶液中和的情况下对本发明的抑制肽进行活/死细胞毒性检测的结果。以mg/ml表示的数值指示在96孔板的每个孔中抑制剂的终浓度；
[0058]图30示出抑制肽Ac-LPG和Ac-LPE的IC5tlS型曲线；
[0059]图31示出用于制备本发明抑制肽的固相肽合成示意图及用1H NMR和LC-MS描述其特性的实例；以及
[0060]图32示出在不存在和存在抑制肽I和2的情况下对肽Ac-KE7和Ac-NL6的凝胶化研究的结果(A)和根据本发明的抑制剂的FESEM图像。
[0061]现在借助于下述实施例对本发明进行进一步地描述，下述实施例是为了说明，而不是为了限制本发明。
[0062]实验步骤
[0063]基于肽的水凝胶制备。所有肽(纯度≥95%)均购自American PeptideCompany, Sunnyvale ;伴有严格的质量控制措施和氨基酸分析。所有肽在N末端处乙酰化以抑制末端电荷的影响。所述肽通过漩涡振荡5分钟来溶于热的milliQ水(60-70°C)中，并在室温静置以形成水凝胶。依据肽的浓度，在几小时内或甚至几天内(凝胶化的实验时间框架)，自组装过程立即发生。
[0064]圆二色性(⑶)研究。用装配有Peltier控温仪的Aviv410⑶分光光度计采集⑶波谱，使用有配套盖子的矩形石英比色杯和对肽样品浓度来说的最佳光程(例如0.1_)。对高的肽浓度(10-20mg/ml)来说，使用光程为0.01mm的石英比色杯。用光谱带宽1.0nm以
0.5nm或1.0nm在波长范围180_260nm进行数据采集。为了确保⑶光谱的再现性，分别测量每种肽的3个样品，但光谱没有取平均。所有光谱用milliQ水作为参照进行基线校准。
[0065]场发射扫描电镜(FESEM)研究。水凝胶样品在_20°C或更好_80°C冷冻。然后冻干冷冻样品。冻干样品用导电胶带固定在样品架上，并用JEOL JFC-1600高精度镀膜仪从顶部和边侧两方溅射钼金。使用的镀膜电流为30mA，且过程持续60秒。然后使用JEOLJSM-7400F场发射扫描电镜系统以5-10kV的加速电压对感兴趣的表面进行检测。
[0066]流变学。为了测定粘弹性质/行为，使用ARES-G2流变仪(TAInstrume nts, Piscataway, NJ)以直径为25.0mm的不锈钢或钛的平行板几何工具(parallel plate geometry)和0.8mm或l_2mm的间隙距离对基于肽的水凝胶进行了动态时间(dynamic time)、应变和频率扫描实验。为了确保完全凝胶化和考虑到不同肽在不同浓度下的不同凝胶化速率，在制备样品两个月后进行流变学测量。在0.l-100rad/s和1%应变下进行振荡频率扫描研究(测量储能模量(G’ )对角速率(ω ))。在0.01-100%应变及恒定角频率为lrad/s下进行振荡幅度扫描研究(测量储能模量(G’)对振荡应变％ ( Y ))。所有测量都在25°C下进行。
[0067]生物相容性:细胞毒性/存活检测。对哺乳动物细胞的抑制肽溶液的生物相容性不仅定性也定量地进行了测定。关于定性检测，采用活/死细胞毒性检测对在该肽溶液中孵育48-96小时后的存活和死亡细胞进行染色。采用Roche的WST-1试剂对细胞存活的定量测定。特意选用诸如U87胶质母细胞瘤细胞和SHSY5Y神经母细胞瘤细胞的细胞系，因为其为与设计用来治疗阿尔海默茨病淀粉样蛋白斑块药物候选者更为相关的神经元细胞系。WST-1是一种稳定的四唑盐，其通过复杂的细胞机制来切割成可溶的甲腊(有色产物)。由于在活细胞中WST-1的减少主要取决于生成NAD (P)H的糖酵解，在培养体系中甲腊染料形成的数量与代谢活跃细胞的数量直接相关。关于定量检测，将5，000细胞/孔的HeLa和U87细胞及20，000细胞/孔的SHSY5Y神经母细胞瘤细胞接种到96孔板。在抑制肽中孵育48或72小时后，进行活/死细胞毒性检测。所有抑制剂溶液在无血清或其他添加剂/生长因子的普通培养基中准备。使用5M的NaOH直到pH达到中性范围进行抑制剂溶液的中和。
[0068]生物相容性:溶血检测。取Iml新鲜兔血，并用冷PBS (pH~7.3)溶液清洗3遍。最终丸状(pelleted)红细胞(RBCs)在4ml冷PBS中重悬并用于检测。Ix PBS (pH~7.3)用作阴性对照，并加入l%Triton-X的PBS用作阳性对照。160 μ I的抑制肽溶液与40 μ I新鲜RBC溶液混合并在37°C下孵育I小时。每个样品进行5次重复。然后，样品离心以使完整的RBCs沉降在底部处，用酶标仪测量100 μ I上清567nm下的吸光度。
[0069]测定IC50数值。含有ThT的溶液，自组装肽和抑制剂(总体积为100 μ L/孔)加入到Greiner96孔板(GRE96ft)的孔中，并用荧光酶标仪(Tecan Safire2)以I分钟间隔测定荧光强度。优化的测定参数为:激发波长为452nm ;激发带宽为9nm;发射波长为485nm ;发射带宽为20nm ;增益值为45 ;温度为26到28°C。将不同摩尔的过量抑制剂加入到100 μ MKE7中。IC5tl的S型曲线由5个独立检测的结果绘制且每个检测至少有5个重复。在特定的时间点(在差异最大处)测定的ThT荧光强度比抑制剂浓度的对数值来绘制S型曲线。
[0070]凝胶化研究。天然核心淀粉样蛋白序列NL6 (来自人源胰淀素)和KE7 (来自阿尔茨海默病淀粉样蛋白)与抑制肽混合。1.5mM的核心序列(终浓度)与10和20摩尔的过量抑制剂混合。在室温下将Mill1-Q水用于溶解这些肽，之后静置3个月。
[0071]抑制剂:合成和表征。根据Kirin等人(2007)J.Chem.Educ.84:108-111来进行固相肽合成。所有反应在手持注射器上完成。合成产物(原材料~Ig树脂；粗肽的毛重量~170mg)在水中高度可溶，通过标准质谱(MS)和核磁共振(在D2O中1H NMR)技术进行表征(见图31)。
[0072]结果[0073]三肽和六肽(hexapeptides)形成的水凝胶的⑶波谱及流变学数据
[0074]Ac-LD6 是指六肽 Ac-LIVA⑶(参见 SEQ ID NO: 3), Ac-NL6 是指六肽 Ac_NFGAIL(SEQID NO:61)，以及Ac-1D3是指三肽Ac-1VD(见SEQ ID NO: 20)。肽NFGAIL是与II型糖尿病相关的的人源胰淀素的天然核心序列，而肽LIVAGD和IVD为合理设计的肽。
[0075]图1 不出 1.2mg/ml Ac-LD6 (Α)、0.5mg/ml Ac-NL6 (C)和 5mg/ml Ac-1D3 (E)的CD波谱，其演示了超小肽从无规卷曲构象到亚稳定、暂时的α -螺旋状态(最小值在222nm)的转变过程。在 2.5mg/ml Ac-LD6 (B)、L2mg/ml Ac-NL6 (D)和 7.5mg/ml Ac-1D3 (F)的较高浓度下，观察到了 β_型结构(最小值大约在220nm;因为芳香族肽序列有轻微地蓝移)。在室温25°C的条件下测量所有波谱。在(F)中，观察到了从α-螺旋中间物到β-型结构的平衡转变过程(肩为208nm)。
[0076]图25A还示出了天然核心序列NL6显示出α -螺旋中间物。天然核心序列NL6和设计的肽LD6两者都在不同浓度下形成了水凝胶(参见图25Β)。
[0077]图26示出了由1.5mM的Ac-KE7形成的水凝胶(绿色)和当1.5mM的Ac-KE7与Ac-LPE (酒红色)和Ac-LPG (红色)按1:20的摩尔比混合的肽抑制剂溶液(非凝胶化)的流变学数据。图表显示了室温25°C时作为(A) 1%应变下的角频率(rad/sec)和(B) lrad/sec角频率下的振荡应变(％)的函数的储能模量(G’以Pa表示)。Ac-KE7对照没有添加形成水凝胶的抑制剂表示出振幅扫描的线性粘弹性范围和频率扫描测量的线性图谱；这是该类自组装肽的特性。然而，同样浓度的Ac-KE7当与抑制剂按1:20摩尔比混合时不形成水凝胶。这可从流变学数据中看出，肽抑制剂溶液在振幅和频率扫描测量中均表现出高波动曲线，因为它们是溶液形式而不是凝胶形式。
[0078]抗淀粉样蛋白肽疗法(用于口服吸收的超小肽抑制剂)
[0079]硫黄素T(Basic Yellowl或CI49005)是一种苯并噻唑盐，由脱氢硫甲苯胺与甲醇在盐酸条件下甲基化来获得(参见图21B)。该染料在体外和体内均被广泛用于显现及量化称为淀粉样蛋白的错误折叠的蛋白质聚合物的存在(例如由在阿尔茨海默病患者的的脑中发现的由淀粉样蛋白β组成的斑块)。当其结合到富含β折叠的结构，例如淀粉样蛋白聚合物中的这些，该染料显示出增强的荧光。在下述实验中，肽KE7，一种形成淀粉样蛋白聚合物的淀粉样蛋白β的天然核心序列(1-42)，被用作模式系统和阳性对照(参见图2和18)。
[0080]关于抑制研究，KE7与抑制肽按1:10的摩尔比混合(参见图21C)。加入的染料的浓度与阳性对照相同，并对荧光信号进行一小时的监测。
[0081]图3到17以及图21Ε和F清楚地示出了通过抑制肽I到5及7到16的例证，本发明的抑制肽抑制了 KE7聚集。而不含抑制肽的ΚΕ7由于形成了淀粉样纤维而显示出荧光增强，当添加了抑制肽后荧光信号显著减少。抑制剂I到16对应于附加序列表中SEQ IDNOs: 21到44的各个抑制肽。
[0082]此外，肽Ac-KE7和Ac-NL6在不存在和存在抑制肽I和2时的凝胶化研究表现了与抑制肽混合阻止/抑制了肽Ac-KE7和Ac-NL6水凝胶的形成(图32Α)。
[0083]半抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentraiton) (IC5tl)用以测量抑制特定生物学过程中 化合物的有效性。该定量测量指示为了有效地阻止给出的过程需要多少特定的药物或其它底物(抑制剂)，在这里是淀粉样蛋白聚集。肽Ac-LPE和Ac-LPG (抑制肽3和5，对应于SEQ ID NOs:47和49;也被称为Ac-LE3和Ac-LG3)的IC50S型曲线在图30中示出。
[0084]图19、20和21D示出当抑制肽单独(浓度为8 μ m和100 μ m)与染料混合，不存在荧光增强(使用PMT增益为131的与由水+染料获得的阴性对照范围相似的数值)。
[0085]图21A中所描绘的小瓶示出根据本发明的包含脯氨酸的抑制肽溶于水。对于药物开发应用而言；在水溶液中有良好溶解度是一个优点，特别是当与芳香族化合物相比时，后者需要有机溶剂以完全溶解。
[0086]图22A和B示出根据本发明的抑制肽使用场发射扫描电镜(FESEM)在不同的放大倍数下的典型形态。将抑制妝在水中完全溶解，制备10mg/ml妝溶液。然后将溶液冲击冷冻、冻干及镀层有钼金薄层以使样品具有用于电子显微镜的导电性。通常，淀粉样纤维甚至在正常光学显微镜下可被观测到，在淀粉样蛋白核心序列形成水凝胶的情况下，纤维结构在从~3000x的放大倍数下清晰可见。对于抑制肽1，甚至在高达37，OOOx以上的放大倍数下没有观测到纤维(也参见图32B)。为了用作对淀粉样蛋白有效的抑制药物的肽，有必要确保抑制剂可以有效的识别和结合天然淀粉样蛋白/生长的淀粉样纤维，而自身不形成纤维。
[0087]图23示出测试了抑制剂生物相容的溶血检测的结果。任一药物候选者必须首先用血液和生物组织测试生物相容性。在此，进行溶血检测来测定抑制肽是否对红细胞有任何副作用。使用了在水中的浓度为2.5、5和10mg/ml的3种抑制肽。测量了这些溶液的pH值，发现较高肽浓度的样品呈酸性(pH < 4)。因此，制备了一组同样浓度的中性肽溶液(用l%w/v NaOH中和)作为对比。在有抑制肽的中性溶液和低肽浓度(2.5mg/ml)下没有观测到细胞裂解，表明了 在5和10mg/ml的高浓度下观测到的25%细胞裂解是由于酸性pH而不是由于肽本身。
[0088]在WST-1检测和活/死细胞毒性检测中使用不同的细胞系获得了相似的结果(参见图27至29)。
[0089]盐浓度影响肽来源的水凝胶的机械稳定性
[0090]图24示出增加NaCl的浓度减少源自10mg/mL的Ac-LD6 (L)的水凝胶的储能模量G ‘/机械强度。
[0091]本发明的在说明书、权利要求和/或在附图中公开的特征，单独地和其任意组合地，是以各种形式实现本发明的材料。
【权利要求】
1.一种分离的α螺旋阻断肽，其具有通式
Z-(X)m-Proline-(X)n, 其中 Z为N端保护基团； X在每次出现时均为独立地选自氨基酸和氨基酸衍生物；以及 m和η表示氨基酸和氨基酸衍生物的数量，并为独立地选自I到5之间的整数，且m+n ^ 60
2.根据权利要求1中所述的分离α螺旋阻断肽，其中，X在每次出现时均为独立地选自天然氨基酸。
3.根据权利要求1或2中所述的分离α螺旋阻断肽，其中，至少一个X为D-氨基酸或模拟肽氨基酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离α螺旋阻断肽，其中，X在每次出现时均为独立地选自非芳香族氨基酸和氨基酸衍生物。
5.根据权利要求4所述的分离α螺旋阻断肽，其中，所述非芳香族氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨 酸、甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和赖氨酸。
6.根据上述任一项权利要求所述的分离α螺旋阻断肽，其中，所述肽的N端氨基酸的疏水性比所述肽的C端氨基酸更强。
7.根据上述任一项权利要求所述的分离α螺旋阻断肽，其中，m+n<5，优选地<4，更优选地< 3。
8.根据上述任一项权利要求所述的分离α螺旋阻断肽，其中，m和η是I。
9.根据上述任一项权利要求所述的分离α螺旋阻断肽，其中，所述N端保护基团具有通式-C(O) -R，其中R选自氢、烷基和取代烷基。
10.根据权利要求9所述的分离α螺旋阻断肽，其中，所述N端保护基团为乙酰基。
11.根据上述任一项权利要求所述的分离α螺旋阻断肽，其中，所述肽的C末端酰胺化或酯化，其中，优选地，所述C末端具有通式-C0NHR，且R选自氢、烷基和取代烷基，或通式-C00R，且R选自烷基和取代烷基。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的分离α螺旋阻断肽，其中，所述肽在水溶液中制备，所述水溶液可选择地包括生理缓冲液。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的分离α螺旋阻断肽，用于作为药物。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的分离α螺旋阻断肽，用于治疗与淀粉样变性相关的疾病。
15.根据权利要求14所述的分离α螺旋阻断肽，其中，所述与淀粉样变性相关的疾病选自神经退行性疾病例如阿尔海默茨病、帕金森病、亨廷顿氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)，朊病毒相关或海绵状脑病例如克雅二氏病、路易体痴呆、伴有帕金森病的额颞叶痴呆、脊髓小脑共济失调、17型脊髓小脑共济失调、脊髓延髓肌肉萎缩症、遗传性齿状核红核苍白球路易体萎缩症、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆，非神经性局限性疾病例如11型糖尿病、甲状腺髓样癌、心房性淀粉样变性、遗传性淀粉样变性脑溢血、垂体泌乳素瘤、注射局部淀粉样变性、主动脉中膜淀粉样变性、遗传性格子状角膜营养不良、与倒睫相关的角膜淀粉样变性、白内障、牙源性钙化上皮瘤、肺泡蛋白沉积症、包涵体肌炎、皮肤淀粉样变性苔藓，非神经性系统性淀粉样变性例如AL型淀粉样变性、AA型淀粉样变性、家族性地中海热、老年系统性淀粉样变性、家族性淀粉样多神经病、血透相关的淀粉样变性、ApoAI淀粉样变性、ApoAI I淀粉样变性、ApoAIV淀粉样变性、芬兰遗传性淀粉样变性、溶菌酶淀粉样变性、纤维蛋白原淀粉样变性、冰岛遗传性脑淀粉样血管病、家族性淀粉样变性，以及发生在多种组织中的系统性淀粉样变性例如轻链淀粉样变性。
16.根据权利 要求13-15中任一项所述的分离α螺旋阻断肽，其中，所述肽为口服施用。
17.一种药物组合物，包含根据权利要求1-12中任一项所述的分离α螺旋阻断肽。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，还包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
19.根据权利要求17或18所述的药物组合物，还包含一种一价或二价金属盐。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中，所述金属选自钠、镁、钙和锌。
【文档编号】A61K38/06GK103946232SQ201280043772
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年7月9日 优先权日:2011年7月7日
【发明者】夏洛特·霍瑟, 阿努潘·拉克什曼 申请人:新加坡科技研究局