对生物物种或生化物种取样和分析的装置和方法

对生物物种或生化物种取样和分析的装置和方法
【专利摘要】本发明公开了一种对生物物种或生化物种取样的方法，包括下列步骤：a)布置生物物种或生化物种的捕获表面(SC)与生物组织或生物流体(TB)接触；和b)清洗表面以去除未被吸附的生物物种或生化物种；方法的特征在于捕获表面为纳米多孔材料(MC)的表面。一种分析生物物种或生化物种的方法，其特征在于利用表面作为分析载体。特别地，可利用选自利用激光解吸的质谱分析和荧光成像的方法来实施分析。一种用于对生物物种或生化物种取样的装置，装置包括杆(TM)，材料(MC)被附接至杆，材料具有用于生物物种或生化物种的捕获表面(SC)，布置捕获表面，以便能够与生物组织或生物流体(TB)接触，其特征在于，材料为纳米多孔材料。杆可滑动到导向管中，以方便杆插入人体或动物体中。
【专利说明】对生物物种或生化物种取样和分析的装置和方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种对生物物种或生化物种取样的方法、一种分析生物物种或生化物种的方法、和一种用于实施这些方法的装置。
【背景技术】
[0002]生物医学研究中的一个重点是改进病理解剖学分析、组织学分析和分子分析。常规的组织学方法是基于用于采集生物组织的样品的活组织检查技术。尽管通过所采用的装置的微型化可以做出改进，这些技术仍是相对侵入的。而且，用于准备组织的过程(石蜡固定、冷冻等)与分子学研究中的新方法不是非常兼容。生化物种(如RNA和蛋白质)的脆弱性是解释创新的多组学(“poly-omic”)方法的临床转移的相对失败的预分析因素之一。
[0003]而且，由于它们的实施所需的成本和时间，故当前的过程与临时分析(即，在外科手术期间，在手术室中进行的分析，以便辅助外科医生的决策)的需要相容性很差。此外，利用快速染色的组织学分析不总是可以获得充分相关的信息。
[0004]文献W02006/082344描述了一种用于通过接触来分子取样的装置，该装置包括具有微级别结构化的表面的 载体，例如该微结构是微立柱的网状物或者可填充微珠的微试管的形式。这种优选地被功能化的表面具有相对大的展开面，该展开面能够通过简单的接触捕获和固定在生物组织中包含的感兴趣的分子。表面的功能化的利用对保存期间装置的防腐方面和杀菌方面造成约束(因为常规的杀菌方法会影响功能化)。没有功能化时，捕获的有效性和选择性是不充分的。
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的这些缺点。根据本发明，通过利用尤其是由纳米多孔硅制成的纳米多孔接触面来实现这个结果。即使不存在表面功能化时(然而，在某些实施方式中也可以构思功能化，以进一步提高捕获的选择性和/或有效性)，纳米孔允许化学物种和生物物种的有效且相对选择性的吸附；这是由于孔的吸力效应。文献W02011/025602公开了纳米多孔材料-尤其是纳米多孔硅-用于生物分子的分级、稳定化和保存的用途。

【发明内容】

[0006]因此，本发明的一个目的是对生物物种或生化物种取样的方法，该方法包括下列步骤:
[0007]a)布置用于捕获所述生物物种或生化物种的表面与生物组织或生物流体接触，以此方式使得至少一种生物物种或生化物种被所述表面吸附；和
[0008]b)清洗所述表面以去除未被吸附的生物物种或生化物种；
[0009]其中，所述步骤a)不具有外科手术的性质；
[0010]所述方法的特征在于，所述捕获表面为纳米多孔材料的表面。
[0011]生物组织可以特别是除了如血液这样的液体组织之外的组织。例如，生物组织可以是上皮细胞，特别是内皮细胞或结缔组织。生物流体(特别是液体)可尤其是全血、血浆、脑脊液、唾液等。生物流体可以是人类、动物(非人类)和/或植物的组织或流体。
[0012]“纳米多孔材料”指整个的晶体材料或无定形材料，优选具有均一的构成，具有平均直径小于I微米、特别是小于或等于10nm的孔。在纳米多孔材料之中，特别地，在微孔(孔的平均直径在0.2nm和2nm之间)、介孔(孔的平均直径在2nm和50nm之间)和大孔(孔的平均直径在50nm和100nm之间)的材料之间存在区别。孔隙率(孔体积与总体积的比率)将优选大于或等于10%。
[0013]所吸附的生物物种可以为细胞(直径在约Ιμπι和50μπι之间)、细菌、病毒和循环囊泡(如外来体，直径在约20nm和200nm之间)。所吸附的生化物种可以为分子或大分子，如蛋白质(直径从几纳米至几十纳米)、肽(尺寸约为纳米)和代谢物。这些分子的“尺寸”应理解为它们的最大尺寸。
[0014]人们认为，当手术不是侵入式时，该手术不具有外科手术的性质，或无论何时手术不表现对身体的大量物理介入，该手术不需要专业的医学专业知识，且不造成大量健康风险。通常，任何包括将捕获表面与上皮(通过天然通道或开口(直肠、口腔、尿道、膀胱等)可进入的组织)接触、或者通过简单的上皮的渗透、甚至通过静脉内导管的手术不具有外科手术的性质。捕获表面与通过先前的外科手术(例如，当该手术具有外科手术的性质时，引入导管)可进入的组织或是伴随的但独立实施的组织接触，也不具有外科手术的性质。
[0015]该方法还可具有包括分析被所述捕获表面吸附的生物物种或生化物种的步骤c)，所述捕获表面用作分析载体。特别地，通过选自利用激光解吸的质谱分析和成像技术(如荧光成像)的方法可实施所述步骤c)。显然，通过利用MALDI (基质辅助激光解吸/电离)型或SELDI (表面增强激光解吸/电离)型激光解吸的质谱分析方法可实施所述步骤c)，在所述清洗步骤b)之后 ，有机基质被直接沉积在捕获表面上。作为变型，通过拉曼散射光谱法，也可实施步骤C)。
[0016]捕获材料可充当分析载体的事实构成了本发明的特别有利的特征。事实上，从捕获表面转移到单独的分析载体会损坏所捕获的常常是非常脆弱的生化物种或生物物种。而且，这种转移将是复杂性、成本、和污染风险或误差的来源。通过比较，对于前述文献W02011/025602而言，为了能够分析所捕获的稳定的分子，洗脱步骤是必要的。
[0017]根据本发明的优选实施方式，所述纳米多孔材料可以为纳米多孔硅。有利地，所述纳米多孔硅可具有下列性质中的至少一种(优选具有所有这些性质):
[0018]-具有树枝状结构的孔；
[0019]-平均直径在Inm和10nm之间的孔；和
[0020]-对于1nm和100μ m之间的深度，孔隙率在40%和65%之间。
[0021 ] 优选地，所述捕获表面没有被功能化。
[0022]对先前取自人类、动物或植物的生物组织或生物流体的样品可体外实施所述步骤a);优选地，该样品可以是“新鲜的”组织，即未受到冷冻或固定处理的组织。作为变型，可体内实施所述步骤a)，只要不涉及在身体上的需要医学专业知识和对患者造成实质性健康风险的大量物理介入-即只要不涉及外科手术性质的介入。
[0023]本发明的另一个目的是一种分析先前吸附在具有纳米多孔材料的表面上的生物物种或生化物种的方法，特征在于，利用所述表面作为分析载体。特别地，通过选自利用激光解吸的质谱分析和成像技术(例如，荧光成像)的方法可实施所述分析。显然，通过利用MALDI (基质辅助激光解吸/电离)型或SELDI (表面增强激光解吸/电离)型的激光解吸的质谱分析方法，使用被直接沉积在纳米多孔材料的表面上的有机基质，可实施所述分析。该方法也可以是成像技术，如荧光成像或比色分析，这些分析可以预先向介质中加入适当的标记物。这些分析也可以是通过拉曼散射光谱法的分析。
[0024]根据本发明的优选实施方式，所述纳米多孔材料可以为纳米多孔硅。有利地，所述纳米多孔硅可具有下列性质中的至少一种(优选具有所有这些性质):
[0025]-具有树枝状结构的孔；
[0026]-平均直径在Inm和10nm之间的孔；和
[0027]-对于在1nm和100μ m之间的深度，孔隙率在40%和65%之间。
[0028]优选地，所述捕获表面未被功能化。
[0029]本发明的又一目的是一种用于对生物物种或生化物种取样的装置，所述装置包括杆，材料被固定在所述杆上，所述材料具有用于所述生物物种或生化物种的捕获表面，所述装置被布置成使得捕获表面可以与生物组织或生物流体接触，其特征在于，所述材料为纳米多孔材料。
[0030]根据该装置的 优选实施方式，所述纳米多孔材料可以为纳米多孔硅。
[0031]有利地，所述纳米多孔硅可具有下列性质中的至少一种(优选具有所有这些性质):
[0032]-具有树枝状结构的孔；
[0033]-平均直径在Inm和10nm之间的孔；和
[0034]-对于在1nm和100μ m之间的深度，孔隙率在40%和65%之间。
[0035]优选地，所述捕获表面没有被功能化。
[0036]所述杆可放置在具有侧向开口或轴向开口的导向管的内部，并且所述杆在所述导向管内可移动，以便使所述捕获表面对应所述开口。特别地，所述杆可具有平坦的表面，所述材料固定在所述平坦的表面上，所述导向管可具有侧向开口，通过在导向管内旋转杆，以使捕获表面与所述开口相对。
【专利附图】

【附图说明】
[0037]参照附图，当阅读作为实施例给出的描述时，本发明的其他特征、细节和优点将变得清楚，其中:
[0038]图1A至图1D示意性地示出根据本发明的装置和方法；
[0039]图2A至图2C和图3A、图3B分别示出通过电子显微镜的可适用于实施本发明的纳米多孔硅的各种样品的切片和表面的视图；
[0040]图4、图5和图6分别地示出通过应用根据用于研究人类血浆、人类脑脊液和小鼠脑组织的本发明的一个实施方式的方法所获得的蛋白质的质谱；
[0041]图7示出说明利用根据本发明的装置而捕获来自小鼠脑组织的细胞的荧光图像；和
[0042]图8示出根据本发明的一个实施方式的装置。
【具体实施方式】[0043]图1A示意性地示出根据本发明的一个实施方式的装置，该装置包括纳米多孔型的捕获材料的板MC，该板MC优选可拆卸地固定在操作杆TM上。捕获材料的板具有与用于固定至杆TM的表面相对的纳米多孔的捕获表面SC，该捕获表面SC的尺寸通常在0.5cm2和5cm2之间。捕获材料可以是纳米多孔硅，更具体地，是介孔硅。
[0044]如图1B所示，杆TM用于使捕获表面SC与生物组织TB接触。生物组织TB可以是先前从人类或动物体、或甚至从植物(体外)、或者从体内的组织中获取的组织的样品。接触可以通过简单的放在一起来实现，而不必要摩擦组织或施加增大的压力。这尤其对于体内应用是重要的。
[0045]作为变型，捕获材料可浸在生物流体中，或者所述流体的液滴可沉积在捕获表面上。
[0046]纳米多孔硅的捕获表面摸起来是光滑的，不具有明显的粗糙度。因此，组织损害的风险被降低到最小，这对于体内应用是非常有利的。因此，生物物种或生化物种的取样不是通过微摩擦，也不是通过化学功能化来实现，而是通过由于纳米孔引起的吸力效应而实现。该效应引起肽和尺寸约为Inm至5nm和/或质量在约5000Da和20000Da之间的“小的”蛋白质的优先固定。因为这些“小的”蛋白质作为标记物通常比更大的分子更有用，故这是有利的。吸力效应也解释了细胞的粘附，细胞太大以至于不能进入孔中。
[0047]接下来(图1C)，使装置与组织分离，捕获表面例如通过沉浸在水中、或利用缓冲溶液而被清洗，这样可以去除未被表面吸附的且因此必定未粘附至表面的生物物种或生化物种。该清洗可以展现通过纳米多孔表面吸附的选择性。
[0048]最后，具有捕获材料的板MC与杆分离(然而这不总是必要的)，然后被引入到用于分析被捕获表面吸附的生物物种或生化物种的分析仪AA中。通常，可通过利用MALDI型或SELDI型激光解吸的质谱分析进行分析。在这种情况下，必须在捕获表面上沉积适当的有机基质。作为变型或此外，将可以通过荧光成像进行分析。在任何情况下，捕获材料MC直接充当分析载体。对于通过激光解吸和离子化的分析，捕获材料必须是导电的-在该情况下是掺杂的纳米多孔硅。
[0049]如上所述，所用的捕获材料优选是纳米多孔硅，然而完全可以使用其他的纳米多孔材料。
[0050]通过具有1m Ω.cm至20m Ω.cm的导电率的P+掺杂的硅在约15%的氢氟酸的溶液中的电化学阳极化，可获得纳米多孔(更确切地说，介孔)硅。为此，已知的方法是，材料被浸入氢氟酸浴中，进行电解。以此方式，获得具有树枝状结构的多孔性材料；这意味着，孔不具有直线的轴线；孔在不连续的方向上延伸到材料的深处，并且可以相交。该树枝状结构增大了吸力。孔隙率(孔体积与总体积的比率)在40%和65%之间。该孔隙率延伸至约6μπι的深度。除此之外，存在块状的硅。通常，在本发明中，材料的孔隙率可延伸到1nm和100 μ m之间的深度。
[0051]通过改变制造参数(HF的浓度、阳极化的时间、电流密度、硅的类型)，可容易地改变这些特征。
[0052]作为变型，可以通过电子光刻的方法生产具有有序结构的纳米多孔硅。
[0053]图2A、图2B和图2C示出通过上述电化学阳极化方法获得的纳米多孔硅的样品的切片的电子显微镜图像。附图具有不同的放大倍率；特别地，图2B表明了块状硅和纳米多孔硅之间的清晰的转变，而图2C示出了孔的树枝状结构。
[0054]图3A和图3B示出在不同条件下纳米多孔硅的两个样品的表面通过电化学阳极化获得的电子显微镜图像。
[0055]通过三个体外测试，来测试本发明的装置和方法。
[0056]在第一测试中，将5 μ I的人类血浆直接沉积在由纳米多孔硅制成的捕获表面上。然后，利用酸性缓冲液(醋酸钠lOOmM，pH值4.0)，将表面清洗两次，持续lmin。由于硅具有略带负电的表面电荷，故通过调节缓冲溶液的PH值，以促进希望采集的样品的蛋白质的正电荷，来利用缓冲溶液。换句话说，相对于感兴趣的蛋白质的等电点，调节PH值。应该注意，蛋白质的等电点对应所述蛋白质的电荷为零时的PH值。这种清洗可以去除未粘附至捕获表面的物种或杂质(组织、血液等的残留物)。然后，再一次在水中清洗表面，接着，在空气中干燥该表面。将有机基质(芥子酸)沉积在捕获表面上，然后，该表面利用市售的MALDI质谱仪(Bruker Autoflex)进行MALDI分析。基于规则分布的5400激光冲击,对于每个样品进行光谱的自动获取。以线性模式进行分析(这意味着，蛋白质在质谱仪中描绘出线性轨迹)，强度为55 (仪器的设置)，在100Da处基质信号衰减。
[0057]结果示于图4中，其中，m/z 为质量/电荷比(以道尔顿/电荷的基本单位表示)，横坐标示出质谱分析信号的强度(任意单位)。下图对应根据本发明的纳米多孔材料的使用；上图充当参照，利用通常用在质谱分析中的类型的底物架(光滑的金属条，在该金属条上沉积有聚合物)而获得，该底物架的参照为B1rad CM10。根据与在纳米多孔硅的表面上相同的方案，进行参照载体上的测量。
[0058]可以观测到，当利用具有纳米多孔娃的捕获表面时,通过比率m/z>10000表征的物种-尤其是白蛋白(对于建立诊断很少关注的大量的成分)未被检测到，这点证明了捕获的选择性。相反地，观测到对应低分子质量的蛋白质的峰的强化；在光滑的载体的情况下，相比之下，这些蛋白质通过清洗被大量地去除。
[0059]还可以观测到，在对应低分子质量的蛋白质的峰上的光谱是更多的，这证实了尽管清洗操作，然而小的蛋白质在纳米多孔表面上的良好的粘附性。在光滑的对照载体上，小的蛋白质通过清洗被大量地去除。
[0060]在第二测试中，将10μ I人类脑脊液直接沉积在与用于第一测试相同类型的纳米多孔硅的捕获表面上。然后，利用酸性缓冲液(醋酸钠100禮，？!1值4.0)将表面清洗两次，持续lmin。这种清洗可以去除未粘附至捕获表面的物种或杂质(组织、血液等的残留物)。然后，再一次在水中清洗表面，接着，在空气中干燥该表面。将有机基质(用于分析蛋白质的芥子酸、CHCA，即用于分析肽的α-氰基-4-羟基肉桂酸)沉积在捕获表面上，然后，该表面利用市售的SELDI质谱仪(B1rad PCS4000)进行分析。
[0061]根据待检测的物种的质量的范围，调整读取参数。基于规则分布的583激光冲击，在对于每个样品启动自动获取之前，在某些点上，手动确定最佳条件:
[0062]对肽(低分子量)采用100nJ的强度和在500Da处的基质信号的衰减。
[0063]对蛋白质(高分子量)采用2200nJ的强度和在100Da处的基质信号的衰减。
[0064]正如在第一测试中，也利用B1rad CMlO光滑的底物架，进行相同的分析。
[0065]图5中示出结果，其中，上图通过光滑的参照底物而获得，上图通过根据本发明的纳米多孔捕获表面而获得。关于蛋白质，第一测试的结果证实:“小的”蛋白质被有效地固定，然而观测到“大的”蛋白质、尤其是白蛋白的大量去除。在肽的情况下，两个载体之间的差异是更大的:在光滑的载体的情况下，通过清洗，这些肽被大量去除，然而，在纳米多孔载体的情况下，观测到非常丰富的光谱。根据与在纳米多孔硅的表面上相同的方案，进行参照载体上的测量。
[0066]在第三测试中，将新鲜的小鼠脑组织的样品放在与用于第一测试和第二测试相同类型的纳米多孔硅的捕获表面上。然后，利用酸性缓冲液(醋酸钠lOOmM，pH值4.0)将表面清洗两次，持续lmin。这种清洗可以去除未粘附至捕获表面的物种或杂质(组织、血液等的残留物)。然后，再一次在水中清洗表面，然后，在空气中干燥该表面。
[0067]参见图7,由于加入DNA嵌入剂(Hoechst缓冲液),故通过突光成像检测到所捕获的细胞。该附图表明清洗之后在捕获表面上存在细胞。
[0068]将有机基质(芥子酸)沉积在捕获表面上，然后，该表面利用市售的SELDI质谱仪(B1rad PCS4000)进行分析。在图4中示出结果，其中，m/z为质量/电荷比(以道尔顿/电荷的基本单位)，横坐标示出质谱分析信号的强度(任意单位)。再一次，在5000Da至1000Da的范围中，观测到非常多的质谱。
[0069]图8(没有按照比例)示出本发明的特别适用于体内应用的装置的实施方式。
[0070]在该装置中，杆TM是有弹性的，且具有500 μ m的直径和20cm的长度。距其端部大约Icm处，存在长度为2cm的平坦的表面，在该表面上可拆卸地固定有捕获材料MC。杆在由生物相容性材料制成的导向管或导管TG中滑动，该导管TG的外径为1mm，壁的厚度为50 μ m。导向管的远端是封闭的；在距远端约Icm的距离处，在2cm的长度上形成侧向开口OL0如图所示，最初杆被布置成使得捕获表面SC远离开口。导向管和杆一起被引入患者体内，直到开口 OL处于 待分析的组织的对面。杆围绕其轴线在导向管内的180°旋转可以使捕获表面SC与所述开口对应，因此与组织接触。另一个180°的旋转使捕获表面回到其初始位置。然后，导向管组件从患者的身体中撤出，捕获材料与杆分离，然后经过如上文所述的清洗和分析的步骤。作为变型，导向管可提前引入患者体内；在这种情况下，仅需要将杆引入到导向管中，实现双旋转，然后撤出杆。
[0071]作为变型，导向管在其远端可以具有轴向开口。在这种情况下，通过杆的向前运动，捕获表面与组织接触。
[0072]可以理解，其他装置可用于实施根据本发明的体内分析。
【权利要求】
1.一种对生物物种或生化物种取样和分析的方法，所述方法包括下列步骤: a)布置所述生物物种或生化物种的捕获表面(SC)与生物组织或生物流体(TB)接触，以此方式使得至少一种生物物种或生化物种被所述表面吸附，所述捕获表面为纳米多孔材料的表面；和 b)清洗所述表面以去除未被吸附的生物物种或生化物种； 其中，所述步骤a)不具有外科手术的性质； 所述方法的特征在于，该方法还包括下列步骤: c)分析被所述捕获表面吸附的所述生物物种或生化物种，所述捕获表面被用作分析载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过选自以下方法的方法来实施所述步骤c): -利用激光解吸的质谱分析；和 -成像技术，例如，荧光成像。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，通过利用基质辅助激光解吸/电离MALDI型或表面增强激光解吸/电离SELDI型激光解吸的质谱分析方法来实施所述步骤c)，在所述清洗步骤b)之后，有机基质被直接沉积在所述捕获表面上。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米多孔材料为纳米多孔硅。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述纳米多孔材料为具有下列性质中的至少一种性质的纳米多孔硅: -具有树枝状结构的孔； -平均直径在Inm和10nm之间的孔；和 -对于在1nm和100 μ m之间的深度，孔隙率在40%和65%之间。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述捕获表面未被功能化。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，对先前取自人类、动物或植物的生物组织或生物流体的样品，在体外实施所述步骤a)。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在体内实施所述步骤a)，而不涉及在身体上的大量物理介入，所述物理介入需要医学专业知识且为患者带来大量健康风险。
9.一种分析先前吸附在纳米多孔材料(MC)的表面(SC)上的生物物种或生化物种的方法，其特征在于，利用所述表面作为分析载体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，通过选自下列方法中的方法来实施所述分析: -利用激光解吸的质谱分析；和 -成像技术，例如，荧光成像。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，通过采用MALDI型或SELDI型激光解吸的质谱分析方法，利用直接沉积在所述纳米多孔材料的表面上的有机基质，来实施所述分析。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中，所述纳米多孔材料为纳米多孔硅。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述纳米多孔材料为具有下列性质中的至少一种性质的纳米多孔硅: -具有树枝状结构的孔； -平均直径在Inm和10nm之间的孔；和-对于在1nm和100 μ m之间的深度，孔隙率在40%和65%之间。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中，所述表面未被功能化。
15.一种用于对生物物种或生化物种取样的装置，所述装置包括杆(TM)，材料(MC)被固定在所述杆(TM)上，所述材料具有所述生物物种或生化物种的捕获表面(SC)，所述装置被布置成使得所述捕获表面可以与生物组织(TB)或生物流体接触，其特征在于，所述材料为纳米多孔材料。
16.根据权利要求15所述的装置，其中，所述纳米多孔材料为纳米多孔硅。
17.根据权利要求16所述的装置，其中，所述纳米多孔材料为具有下列性质中的至少一种性质的纳米多孔硅: -具有树枝状结构的孔； -平均直径在1nm和10nm之间的孔；和 -对于在1nm和100 μ m之间的深度，孔隙率在40%和65%之间。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的装置，其中，所述捕获表面未被功能化。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的装置，其中，所述杆被放置在具有侧向开口(OL)或轴向开口的导向管(TG)的内部，所述杆在所述导向管内是可移动的，以使所述捕获表面对应所述开口。
20.根据权利要求19所述的装置，其中，所述杆具有平坦的表面，所述材料固定在所述平坦的表面上，所述导向管具有侧向开口，通过在所述导向管内旋转所述杆，能够使所述捕获表面与所述开口相对。
【文档编号】A61B10/00GK104039237SQ201280065529
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年12月17日 优先权日:2011年12月29日
【发明者】阿里·布阿姆拉尼, 弗朗索瓦·伯杰, 马里-莱恩·科斯尼尔 申请人:原子能与替代能源委员会