表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途

表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途
【专利摘要】本发明提供了包含并表达禽类病原体的抗原的火鸡(HVT)载体的重组疱疹病毒、包含重组HVT载体的组合物、包含重组HVT载体和一种或多种野生型病毒或重组载体的多价疫苗。本发明还提供了接种抗多种禽类病原体的疫苗的方法和制备重组HVT载体的方法。
【专利说明】表达禽类病原体的抗原的重组HVT载体及其用途
[0001] 交叉参考相关申请
[0002] 本申请要求2011年11月30日提交的美国临时申请61/564, 877和2012年8月 30日提交的美国临时申请61/694, 957的优先权。 发明领域
[0003] 本发明涉及用于插入和表达外来基因以用作保护免受多种病原体体感染的安全 免疫媒介物的重组病毒载体。其还涉及包含一种或多种重组病毒载体以用于保护免受多种 病原体感染的多价组合物或疫苗。本发明涉及制备和使用重组病毒载体的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 家禽接种被广泛用于保护家禽群体免受破坏性疾病，包括新城疫疾病（ND)、传染 性法氏囊病（IBD)、马立克氏病（MD)、传染性支气管炎（IB)、传染性喉气管炎（ILT)和禽流 感（AI)。ND由属于副粘病毒科的禽副粘病毒1型（APMV-1)(也称为ND病毒（NDV))引发。 MD由也称为MD病毒血清型1 (MDV1)的鸡疱疹病毒2型（疱疹病毒科）引发。IB由属于冠 状病毒科的IB病毒（IBV)引发，ILT由也称为ILT病毒（ILTV)的鸡疱疹病毒1 (疱疹病毒 科）引发，AI由属于正粘病毒科的AI病毒（AIV)引发。
[0006] 许多重组禽病毒载体已被提出用于接种鸡以抗这些禽类病原体。使用的病毒载体 包含禽痘病毒，特别地鸡痘病毒（ΕΡ-Α-0, 517, 292)、马立克氏病毒例如血清型2和3(HVT) (W0-A-87/04463)或可选择地ITLV、NDV和禽腺病毒。当这些重组禽病毒载体中的一些用 于接种时，它们显示可见水平的保护作用。
[0007] 已开发和许可了表达来自不同病原体（美国专利No. 5, 980, 906, 5, 853, 733, 6, 18 3, 753, 5, 187, 087)(包括IBDV、NDV、ILTV和AIV)的抗原的几种火鸡重组疱疹病毒（HVT， 也称为吐绶鸡疱疹病毒1或MDV血清型3)载体。特别吸引人的是表达IBDV VP2保护 基因的HVT载体，其已显示明确的优于经典IBD疫苗（Bublot等人J. Comp. Path. 2007， 第137卷，S81-S84 ;US5, 980, 906)的有利方面。其它目标HVT载体是表达NDV (Morgan 等人 l"2, Avian dis.36,858_7〇 ;US6,866, 852 ;US5,65〇，l53)或 ILTV (Johnson 等 人，2010Avian Dis54, 1251-1259 ;US6, 299, 882 ;US5, 853, 733)保护性基因的载体。一 起使用若干基于HVT的重组疫苗的实际问题之一是它们的干扰。当将两种表达不同抗 原的HVT重组体混合时针对至少一种疾病诱导更低的保护作用（Rudolf Heine2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines ;2011 年 8 月 14 日-18 日 在Cancan，Mexico的第XVII届世界家畜兽医协会（WVPA)会议提供的论文；Slacum G, Hein R.和 Lynch P. , 2009,The compatibility of HVT recombinants with other Marek' s disease vaccines，第 58 届西方家禽疾病会议（Western Poultry Disease Conference)，Sacramento, CA，USA，3 月 23-25 日，p84)。
[0008] HVT和SB-1、鸡疱疹病毒3 (MDV血清型2或MDV-2)疫苗株的组合已显示对MD保 护作用的协同效果（Witter和Lee，1984, Avian Pathologyl3, 75-92)。为了说明干扰问题， 有益地评估HVT病毒作为表达抗多种禽类病原体的一种或多种保护性抗原的疫苗载体。
[0009] 克隆SB-ι基因组，在细菌人工染色体（BAC)中进行表征（Petherbridge， 等人，J. Virol. Methodsl58，ll-17,2009;Singh 等人，Research in Veterinary Science89, 140-145, 2010)。最近获得了 MDV2SB-1序列，并分析所述序列（Spatz和 Schat, Virus Gene42, 331-338, 2011)。SB-1 病毒的糖蛋白 E 缺失由 Petherbridge,等人 (J. Virol. Methodsl58, 11-17,2009)进行了描述。然而，未报导使用SB-1作为表达外来保 护性基因的病毒载体的研究。
[0010] 鉴于动物病原体例如NDV和IBDV对兽医公共健康和经济的潜在影响，需要有预防 感染和保护动物的高效方法。存在对用于制备可缓解在两种基于HVT的载体疫苗之间观察 到的干扰问题的组合的有效载体疫苗和适当方法的解决方案的需要。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明显示了当包含单一或双重HVT载体的多价组合物或疫苗有效地保护动物 免受多种禽类病原体感染而无干扰的令人惊讶的结果。当启动子、密码子最优化的基因、 polyA尾和插入位点的不同组合对一个或多个异源基因的体内表达赋予不同水平的效力和 稳定性时也观察到令人惊讶的结果。
[0013] 本发明涉及包含编码和表达禽类病原体的至少一种抗原的一个或多个异源多核 苷酸的重组HVT载体。
[0014] 本发明提供了包含一种或多种重组HVT载体的组合物或疫苗，所述载体包含编码 和表达禽类病原体的至少一个抗原的一个或多个异源多核苷酸。
[0015] 本发明提供了包含一种或多种重组HVT载体和一种或多种重组SB1载体的多价组 合物或疫苗，所述重组HVT载体包含编码和表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷 酸，所述重组SB1载体包含编码和表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸。
[0016] 本发明涉及接种动物或诱导动物的免疫原性或保护性反应的方法，其包括本发明 组合物或载体的至少一次施用。
[0017] 附图概述
[0018] 通过实例给出的并且无意将本发明限定于描述的特定实施方案的下列详细描述， 可结合附图（通过引用并入本文）来理解，其中：
[0019] 图1是显示被赋予每一个DNA和蛋白质序列的SEQ ID N0的表。
[0020] 图2描述HVT的基因组结构及其插入位点。
[0021] 图3描述pHM103的质粒图谱。
[0022] 图4描述VHVT114的PCR分析结果。
[0023] 图5描述双重免疫荧光测定结果。
[0024] 图6描述vHVT114的Southern印迹结果。
[0025] 图7描述vHVTl 14的免疫沉淀和Western印迹分析结果。
[0026] 图8描述来自VHVT306感染细胞的免疫沉淀样品的Western印迹分析。
[0027] 图9描述来自vSBl-009感染细胞的免疫沉淀样品的Western印迹分析。
[0028] 图10描述vHVT304和VHVT114抗NDV ZJ1和CA02的攻击研究的结果。
[0029] 图11描述NDV CA02和ZJ1攻击后的病毒脱落结果。
[0030] 图12描述NDV Chimalhuacan攻击后的病毒脱落结果。
[0031] 图13显示序列比对和百分比同一性。
[0032] 图14显不DNA和蛋白质序列。
[0033] 发明详述
[0034] 应指出在本公开内容中，特别地在权利要求中，术语例如"包含"、"包括"、"含有" 等可具有美国专利法中的含义；例如，可意指"包括"、"包含的"、"含有"等；术语例如"基本 上由……组成"和"基本上由……组成"具有它们在美国专利法中的含义，例如，它们允许包 括未明确引述的元素，但不包括在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新型特征的元 素。
[0035] 除非另外指出，否则根据常规惯用法使用技术术语。分子生物学中的一 般术语的定义可见于 Benjamin Lewin, Genes V.由 Oxford University Press 出 版，1994(ISBN0-19-854287-9) ;Kendrew 等人（编辑·），The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (编辑),Molecular Biology and Biotechnology ：a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。
[0036] 除非上下文明确地另有所指，否则单数术语"一个/ 一种（a) "、"一个/ 一种（an) " 和"所指物（the)"包括复数形式。类似地，除非明确地另有所指，否则单词"或"意欲包括 "和"。单词"或"意指特定列表的任一个成员，并且还包括该列表的成员的任意组合。
[0037] 术语"动物"在本文中用于包括所有哺乳动物、鸟类和鱼。本文中使用的动物可选 自马科动物（例如，马）、犬科动物（例如，狗、狼、狐狸、草原狼、豺）、猫科动物（例如，狮子、 老虎、家猫、野猫、其它大型猫，和其它猫科动物包括猎豹和山猫）、牛族动物（例如，牛）、猪 类（例如，猪）、羊类（例如，绵羊、山羊、羊驼、野牛）、禽类（例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌_、雉 鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、驼鸟、鸸鹋和鹤鸵）、灵长类动物（例如，狐猴、跗猴、猴子、长臂猿、人 猿）、人和鱼。术语"动物"还包括处于所有发育阶段包括胚胎期和胎儿期中的个体动物。 [0038] 术语"多肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，表示连续氨基酸残基的多聚体。
[0039] 术语"核酸"、"核苷酸"和"多核苷酸"可互换使用，并且意指RNA、DNA、cDNA或cRNA 及其衍生物，例如包含修饰主链的那些核酸。应当理解，本发明提供了包含与本文中描述的 序列互补的序列的多核苷酸。本发明中涉及的"多核苷酸"包括正向链（5'至3'）和反向 互补链（3'至5'）。根据本发明的多核苷酸可以以不同的方式（例如通过化学合成，通过 基因克隆等）来制备，并且可采取不同的形式（例如，线性的或分支的、单链或双链的，或其 杂合体、引物、探针等）。
[0040] 术语"基因组DNA"或"基因组"可互换使用，意指宿主生物的可遗传的遗传信息。 基因组DNA包括细胞核的DNA (也称为染色体DNA)，还包括质体（例如，叶绿体）以及其它 细胞器（例如，线粒体）的DNA。本发明中涉及的基因组DNA或基因组还指病毒的RNA。RNA 可以是正链或负链RNA。本发明中涉及的术语"基因组DNA"包括包含与本文中描述的序列 互补的序列的基因组DNA。术语"基因组DNA"还指信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)和互补 RNA(cRNA)。
[0041] 术语"基因"被广泛用于指与生物功能相关的多核苷酸的任意区段。因此，基因或 多核苷酸包括内含子和外显子（如在基因组序列中）或仅编码序列（如在CDNA中），例如开 放阅读框架（0RF)，其始于起始密码子（甲硫氨酸密码子）并终于终止信号（终止密码子）。 基因和多核苷酸还可包括调节它们的表达例如转录起始、翻译和转录终止的区域。因此，还 包括的是启动子和核糖体结合区域（一般地，这些调控元件位于编码序列或基因的起始密 码子上游约60至250个核苷酸处；Doree S Μ等人；Pandher K等人；Chung J Y等人）、转 录终止子（一般地，终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游约50个核苷酸内；Ward C K等人）。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段， 其包括调控序列。
[0042] 如本文中所用，术语"异源DNA"是指来源于不同生物，例如不同细胞类型或与受体 不同的物种的DNA。该术语还指宿主DNA的相同基因组上的DNA或其片段，其中异源DNA被 插入基因组内与其原始位置不同的区域中。
[0043] 如本文中所用，术语"抗原"或"免疫原"意指诱导宿主动物的特异性免疫反应的 物质。抗原可包括完整生物体（杀死的、减毒的或活的）；生物体的亚单位或部分；包含具 有免疫原性性质的插入物的重组载体；能够在呈递至宿主动物后诱导免疫反应的DNA碎片 或片段；多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒素。
[0044] 如本文中所用，术语"免疫原性蛋白或肽"包括在一旦给宿主施用后，其能够引发 针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上具有免疫活性的多肽。优选，蛋 白质片段是这样的片段，该片段具有与整个蛋白质大体上相同的免疫活性。因此，根据本发 明的蛋白质片段包括至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本文中 所用，"免疫原性"蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。" 免疫原性片段"意指包括一个或多个表位，从而引发上述免疫反应的蛋白质片段。这样的 片段可使用本领域内已知的许多表位作图技术来鉴定。例如，线性表位可通过例如在固体 载体上同时合成大量肽（所述肽对应于该蛋白质分子的部分），并且使肽与抗体反应（同时 肽仍然连接于载体上）来测定。类似地，构象表位可通过测定氨基酸的空间构象（例如通 过例如X射线晶体学和二维核磁共振）来容易地鉴定。
[0045] 术语"免疫原性蛋白或肽"还涉及序列的缺失、添加和置换，只要多肽能够产生本 文中定义的免疫反应即可。术语"保守改变"意指用另一个生物学上相似的残基进行氨基 酸残基的替换或核酸序列中核苷酸的替换使得编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物 学上相似的残基。在这一点上，特别优选的置换通常是性质上保守的，即在氨基酸的家族内 发生的那些置换。例如，氨基酸通常被分成4个家族：（1)酸性一天冬氨酸和谷氨酸；（2)碱 性一赖氨酸、精氨酸、组氨酸；（3)非极性一丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和（4)不带电荷的极性一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨 酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守 改变的实例包括一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个疏水残 基的置换或一个极性残基对另一个极性残基的置换，例如精氨酸对赖氨酸的置换、谷氨酸 对天冬氨酸或谷氨酰胺对天冬酰胺的置换等；或对生物活性不会具有主要影响的结构上相 关的氨基酸对氨基酸的相似保守替换。因此，具有与参照序列大体上相同的氨基酸序列但 具有大体上不影响蛋白质的免疫原性的少数氨基酸置换的蛋白质在参考多肽的定义之内。 所有由这些修饰产生的多肽包括在本文中。术语〃保守改变〃还包括使用取代的氨基酸替 代未取代的亲代氨基酸，只要针对被取代的多肽产生的抗体也与未被取代的多肽发生免疫 反应。
[0046] 术语〃表位〃是指特异性B细胞和/或T细胞对其反应的抗原或半抗原上的部位。 该术语还可与〃抗原决定簇〃或〃抗原决定部位〃互换使用。识别相同表位的抗体可在显 示一种抗体阻断另一种抗体对靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中被鉴定。
[0047] 对组合物或疫苗的〃免疫反应〃是宿主中针对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗 体介导的免疫反应的发展。通常地，"免疫反应〃包括但不限于下列效应中的一个或多个： 特异性针对目标组合物或疫苗中包含的抗原的抗体、Β细胞、辅助Τ细胞和/或细胞毒性Τ 细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，从而对新感染的抗性得到增强 和/或疾病的临床严重性减轻。这样的保护作用可通过通常由被感染宿主显示的症状的减 轻或不存在、被感染宿主的更快恢复时间和/或更低病毒滴度来显示。
[0048] 术语"重组的"和"遗传修饰的"可互换使用，意指多核苷酸或蛋白质在其天然形 式或结构上的任何修饰、改变或工程化，或多核苷酸或蛋白质在其天然环境或周围事物上 的任何修饰、改变或工程化。多核苷酸或蛋白质的修饰、改变或工程化可包括但不限于一 个或多个核苷酸或氨基酸的缺失、整个基因的缺失、基因的密码子最优化、氨基酸的保守置 换、一个或多个异源多核苷酸的插入。
[0049] 术语"双重HVT构建体"或"双重HVT载体"是指包含两种异源多核苷酸的HVT病 毒载体。
[0050] 术语"多价疫苗或组合物"、"组合或复合（combo)疫苗或组合物"和"多价疫苗或 组合物"可互换用于指包含超过一种组合物或疫苗的组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可 包含2、3、4或更多种组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可包含重组病毒载体、活性或减毒 或杀死的野生型病毒，或重组病毒载体与以活性或减毒的或杀死的形式存在的野生型病毒 的混合物。
[0051] 本发明的一个实施方案提供了重组HVT病毒载体，其包含编码并表达禽 类病原体的至少一个抗原或多肽的一个或多个异源多核苷酸。用于重组病毒载体 的HVT株可以是任何HVT株，包括但不限于HVT株FC126 (Igarashi T.等人，J. Gen. Virol.70, 1789-1804, 1989)〇
[0052] 本发明的另一个实施方案提供了重组SB-1病毒载体，其包含一个或多个 编码并表达禽类病原体的至少一个抗原或多肽的异源多核苷酸。SB-1株可以是 任意SB-1株，包括但不限于商业化马立克氏病疫苗（SB-1疫苗）（Merial Select Inc.，Gainesville, GA30503, USA)、具有如由 GenBank 登录号 HQ840738. 1 定义的基因组序 列的SB-1株。
[0053] 编码抗原或多肽的基因可以是编码如下蛋白的那些基因：新城疫病毒融合蛋白 (NDV-F)、新城疫病毒血细胞凝集素神经氨酸酶（NDV-HN)、马立克氏病病毒糖蛋白C(gC)、 马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)、马立克氏病病毒糖蛋白E(gE)、马立克氏病病毒糖蛋白 I (gl)、马立克氏病病毒糖蛋白H(gH)或马立克氏病病毒糖蛋白L(gL)、传染性法氏囊病病 毒（IBDV)VP2、IBDV VPX、IBDV VP3、IBDV VP4、ILTV糖蛋白 B、ILTV糖蛋白 I、ILTV UL32、ILTV 糖蛋白D、ILTV糖蛋白E、ILTV糖蛋白C、流感血凝素（HA)、流感神经氨酸酶（ΝΑ)、来源于鸡 败血支原体（Mycoplasma gallisepticum) (MG)或滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae) (MS)的保护性基因或其组合。抗原或多肽可以是来自家禽病原体的任何抗原，所述病原体 选自禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡 痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、鸡贫血病毒、禽星状病毒、禽细小病毒、球虫病病毒（艾 美球虫属的一个种（Eimeria sp.))、弯曲杆菌属的种（Campylobacter sp.)、沙门菌属的 种（Salmonella sp·)、巴斯德菌属的种（Pasteurella sp·)、禽杆菌属的种（Avibacterium sp·)、鸡败血支原体、滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae)、梭菌属的种（Clostridium sp)和大肠杆菌（E. coli)。
[0054] 此外，上述抗原或多核苷酸的同源物意欲在本发明的范围内。如本文中所用，术语 "同源物"包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语"类似物"是指具有相同或相似功能， 但已在无关生物中分开进化的两个多核苷酸或多肽。术语"直系同源物"是指来自不同物 种、但已通过物种形成从共同祖先基因进化而来的两个多核苷酸或多肽。通常地，直系同源 物编码具有相同或相似功能的多肽。术语"旁系同源物"是指通过基因组内的复制而相关的 两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同功能，但这些功能可以相关。野生型多肽 的类似物、直系同源物和旁系同源物可与野生型多肽在翻译后修饰、氨基酸序列差异或两 者方面有差异。具体地，本发明的同源物通常显示与上述抗原的多核苷酸或多肽序列的全 部或部分有至少 80-85%、85-90%、90-95%或95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性， 并且可显示相似的功能。
[0055] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码和表达NDV-F抗原或多肽的一个或多 个异源多核苷酸的重组HVT或SB-1病毒载体。在该实施方案的一个方面，NDV-F抗原或多 肽与具有SEQ ID勵:2、4、6、33、35或37所示的序列的多肽或这些多肽之一的保守变体、 等位基因变体、同源物或包含所述多肽的至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片 段或这些多肽的组合具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99% 的序列同一'I"生。在该实施方案的另一个方面，异源多核苷酸编码与具有SEQ ID N0:2、4、6、 33、35 或 37 所示序列的多肽具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%的序列同一'丨生的NDV-F抗原或多肽。在该实施方案的另一个方面，异源多核苷酸与 具有SEQ ID勵：1、3、5、32、34或36所示序列的多核苷酸具有至少70%、75%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%或 99% 的序列同一性。
[0056] 变体包括等位基因变体。术语〃等位基因变体〃是指包含导致蛋白质的氨基酸序 列的变化并且存在于天然群体（例如，病毒的种或变种）内的多态性的多核苷酸或多肽。这 样的天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽内1-5%的变异。等位基因变体可通过 对许多不同物种的目标核酸序列进行测序来鉴定，这可通过使用杂交探针鉴定那些物种中 相同基因的基因座来容易地进行。作为天然等位基因变异的结果并且不改变目标基因的功 能活性的任何和所有这样的核酸变异和所得的氨基酸多态性或变异意欲包括在本发明的 范围内。
[0057] 关于序列的术语"同一性"可指例如具有相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以 两个序列中更短序列内的核苷酸或氨基酸数目，其中两个序列的比对可按照Wilbur和 Lipman的算法（Wilbur和Lipman)来测定。两个氨基酸序列的序列同一丨生或序列相似性或 者两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包（Invitrogen, 1600Faraday Ave.，Carlsbad，CA)来测定。当RNA序列被认为是与DNA序列相似的或与其具有一定程度 的序列同一性或同源性时，该DNA序列中的胸腺嘧啶（T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧 啶（U)。因此，RNA序列包括在本发明的范围内并且可来源于DNA序列，其中DNA序列中的 胸腺嘧啶⑴被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶（U)。
[0058] 本公开内容的多核苷酸包括作为遗传密码的结果（例如对于特定宿主的最优化 密码子选择）是简并的序列。如本文中所用，"最优化的"是指经遗传工程改造以增加其在 给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码NDV-F多肽的最优化的多核苷酸，NDV-F蛋 白基因的DNA序列可被修饰来1)包含在特定物种中高度表达的基因所偏好的密码子；2) 以与大体上在所述物种中发现的核苷酸碱基组成相似的核苷酸碱基组成包含A+T或G+C含 量；3)形成所述物种的初始序列；或4)消除引起RNA的去稳定作用、不适当的多聚腺苷酸 化、降解和终止或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。NDV F蛋白在所述物种中的增 加表达可通过使用真核生物和原核生物中或特定物种中的密码子用法分布频率来实现。术 语"偏好密码子用法的频率"是指由特定宿主细胞在核苷酸密码子的使用中显示的指定给 定氨基酸的偏好性。存在20种天然氨基酸，其大部分由超过一个密码子指定。因此，所有 简并核苷酸序列包括在本公开内容中，只要由所述核苷酸序列编码的NDV-F多肽的氨基酸 序列在功能上不被改变即可。
[0059] 异源多核苷酸被重组/修饰感染性病毒成功表达需要两个条件。首先，必须将异 源多核苷酸插入或引入病毒基因组的区域以使修饰病毒保持活力。表达插入的异源多核苷 酸的第二个条件是存在允许基因在病毒背景中表达的调控序列（例如：启动子、增强子、供 体和受体剪接位点和内含子、Kozak翻译起始共有序列、多聚腺苷酸化信号、非翻译序列元 件）。
[0060] 插入位点可以是HVT基因组的任何非必需区域，包括但不限于ORF UL55的ATG和 UL与相邻重复区域的连接处之间的区域（US5, 980, 906)、IG1基因座、IG2基因座、IG3基因 座、UL43基因座、US10基因座、S0RF3/US2基因座（参见图2)。
[0061] 一般而言，使用在真核细胞中具有功能的强启动子是有利的。启动子包括但不限 于立即早期巨细胞病毒（CMV)启动子，豚鼠 CMV启动子、SV40启动子、假狂犬病毒启动子 例如糖蛋白X启动子、单纯疱疹病毒-1的启动子例如α 4启动子、马立克氏病病毒（包括 MDV-UMDV-2和HVT)启动子例如驱动糖蛋白gC、gB、gE或gl表达的启动子、感染性喉气管 炎病毒启动子例如糖蛋白gB、gE、gl、gD基因的启动子或其它疱疹病毒启动子。
[0062] 本发明的一个实施方案提供了包含编码并表达NDV-F抗原或多肽的异源多核苷 酸的重组HVT载体。在该实施方案的一个方面，编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于 具有SEQ ID N0:9中所示序列的SV40启动子，从而NDV-F抗原或多肽的表达受SV40启动 子调控。在该实施方案的另一个方面，NDV-F抗原或多肽的表达受具有SEQ ID N0:11所示 序列的SV40polyA信号调控。在该实施方案的另一个方面，编码NDV-F多肽的多核苷酸有 效地连接于具有SEQ ID N0:38所示序列的MDV gB启动子，从而NDV-F抗原或多肽的表达 受MDV gB启动子调控。
[0063] 本发明的另一个实施方案提供了包含编码并表达NDV-F抗原或多肽的第一异源 多核苷酸和编码并表达IBDV VP2抗原或多肽的第二多核苷酸的重组双重HVT载体。在该 实施方案的一个方面，NDV-F抗原或多肽与具有SEQ ID勵:2、4、6、33、35或37所示的序 列的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一 性。在该实施方案的另一个方面，IBDV VP2抗原或多肽与具有SEQ ID N0:8或42所示的序 列的多肽具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一 性。在另一个方面，编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于具有SEQ ID N0:9所示序列的 SV40启动子，从而NDV-F抗原或多肽的表达受SV40启动子调控。在另一个方面，NDV-F抗 原或多肽的表达受具有SEQ ID NO: 11所示的序列的SV40polyA信号或具有SEQ ID NO: 12 所示序列的合成P〇lyA信号调控。在另一个方面，IBDV VP2抗原或多肽的表达受具有SEQ ID NO: 10所示序列的CMV-IE启动子和具有SEQ ID NO: 11所示序列的SV40polyA信号调 控。
[0064] 本发明的另一个实施方案提供了包含两个编码并表达IBDV VP2抗原或多肽的多 核苷酸的重组双重HVT载体。在所述实施方案的一个方面，IBDV VP2抗原或多肽与具有SEQ ID N0:8 或 42 中所示的序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99 %的序列同一性。在一个方面，编码第一 IBDV VP2抗原或多肽的多核苷酸有效地连接 于具有SEQ ID N0:10中所示的序列的CMV-IE启动子，编码第二IBDV VP2抗原或多肽的多 核苷酸有效地连接于具有SEQ ID N0:43中所示的序列的豚鼠 CMV启动子。在另一个方面， 第一 IBDV VP2抗原或多肽的表达受具有SEQ ID N0:10所示的序列的CMV-IE启动子和具 有SEQIDN0:ll所示序列的SV40pOlyA信号调控，第二IBDVVP2抗原或多肽的表达受具 有SEQ ID N0:43所示序列的豚鼠 CMV启动子和具有SEQ ID勵：12所示序列的合成？〇17八 信号调控。在该实施方案的另一个方面，可将编码IBDV VP2抗原或多肽的多核苷酸插入一 个或多个基因座区域，所述基因座区域选自HVT基因组的161、162、旧10、501^3152和 80。 在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物或疫苗，其中包含一种或多种本发明的重组HVT 或SB-1病毒载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。
[0065] 在另一个实施方案中，本发明提供了组合物或疫苗，其包含含有编码NDV-F抗原 的多核苷酸、SV40启动子的HVT病毒载体和任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形 齐U、媒介物或佐剂。在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物或疫苗，其包含含有编 码NDV-F抗原的多核苷酸的第一 HVT载体和含有编码IBDV VP2抗原的多核苷酸的第二HVT 载体以及任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方 案中，本发明提供了药物组合物或疫苗，其包含含有编码NDV-F抗原的多核苷酸的HVT载 体、含有编码NDV-F抗原的多核苷酸的SB-1载体、任选地药学上或兽医学上可接受的载体、 赋形剂、媒介物或佐剂。本发明的药物组合物或疫苗可包含含有编码NDV-F抗原的多核苷 酸的第一 HVT载体、含有编码IBDV VP2抗原的多核苷酸的第二HVT载体、含有编码NDV-F 抗原的多核苷酸的SB-1载体、任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或 佐剂。
[0066] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含双重HVT病毒载体的组合物或疫苗，其 包含：i)编码并表达NDV-F抗原或多肽的第一异源多核苷酸；ii)编码并表达IBDV VP2抗 原或多肽的第二多核苷酸；和iii)任选地药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介 物或佐剂。在另一个实施方案中，本发明提供了组合物或疫苗，其包含含有编码并表达IBDV VP2抗原或多肽的两个多核苷酸的双重HVT病毒载体，和任选地药学上或兽医学上可接受 的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方案中，包含双重HVT病毒载体的组合物还 包含含有编码IBDV VP2抗原的多核苷酸的HVT载体或含有编码NDV-F抗原的多核苷酸的 SB-1载体或其组合。药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂对于本领域 技术人员来说是公知的。例如，药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂 可以是用于MD疫苗的马立克氏病疫苗稀释剂。可用于本发明的方法的其它药学上或兽医 学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂包括但不限于〇. 9 % NaCl (例如，盐水）溶液或 磷酸盐缓冲液、多聚-(L-谷氨酸）或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或 媒介物或赋形剂可以是有利于载体（或从本发明的载体体外表达的蛋白质）的施用或有利 于载体（或蛋白质）的转染或感染和/或改善其保存的任何化合物或化合物的组合。剂量 和剂量体积在本文中在一般描述中进行了论述，其还可由本领域技术人员根据本公开内容 结合本领域的知识来确定，而无需任何过度的实验。
[0067] 任选地可添加其它化合物作为药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒 介物或赋形剂，包括但不限于明矾；CpG寡核苷酸（0DN)，特别地0DN2006、2007、2059 或 2135 (Pontarollo R.A.等人，Vet. Immunol. Immunopath，2002,84 :43-59 ;Wernette C. M.等人，Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84 :223-236 ;Mutwiri G.等人，Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91 :89-103) ;polyA_polyU，二甲基双十八烧基溴化铵（DDA) ( "Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach，'，由 Michael F. Powell 和 Mark J. Newman 编辑的，Pharmaceutical Biotechnology, 6 :p. 03, p. 157) ;N, N-双十八烧基-Ν'，Ν' -双 (2-羟乙基）丙二胺（例如AVMD1NE?)(出处同前，P.148);卡波姆、壳聚糖（参见 例如美国专利系列No. 5, 980. 912)。
[0068] 根据本发明的药物组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由一种或多种 佐剂组成。用于实施本发明的适当佐剂为（1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐 和烯基衍生物的聚合物，（2)免疫刺激序列（ISS)例如具有一个或多个非甲基化CpG单 位的寡脱氧核糖核苷酸序列（Klinman等人，1996 ;W098/16247)，（3)水包油乳剂，例如在 由 M.Powell，M. Newman, Plenum Pressl995 出版的"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"第147页上描述的SPT乳剂，和相同著作第183页上描述的乳剂MF59 ; (4)包含季铵盐例如DDA的阳离子脂质，（5)细胞因子，（6)氢氧化铝或磷酸铝，（7)皂苷或 (8)在引用的和通过引用并入本申请中的任何文献中论述的其它佐剂或（9)其任意组合或 混合物。
[0069] 本发明的另一个方面涉及用于诱导动物中抗一种或多种抗原的免疫反应或者动 物中抗一种或多种禽类病原体的保护性反应的方法，所述方法包括用本发明的疫苗或药物 组合物接种动物至少一次。本发明的另一个方面涉及用于诱导动物中针对一种或多种抗原 的免疫反应或者在初免-加强施用方案中诱导动物中抗一种或多种禽类病原体的保护性 反应的方法，所述方法包括使用至少一种常用多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初始施 用和至少一次加强施用。初始施用中使用的免疫组合物或疫苗可以相同，可在性质上与用 作加强剂的免疫组合物或疫苗不同。
[0070] 禽类病原体可以是新城疫病毒（NDV)、传染性法氏囊病病毒（即，IBDV或禽肾病 病毒）、马立克氏病病毒（MDV)、传染性喉气管炎病毒（ILTV)、禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病 毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、 禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒球虫病（艾美球虫属的种）、弯曲杆菌属的种、沙门 菌属的种、鸡败血支原体、滑液囊支原体、巴斯德菌属的种、禽杆菌属的种、大肠杆菌和梭菌 属的种。
[0071] 通常地，在1日龄时通过皮下或肌内途径进行疫苗的一次施用，或在17-19日龄胚 胎中通过卵内途径进行疫苗的一次施用。第二次施用可在第一个10日龄内进行。动物优 选在第一次施用时为至少17日胚胎或1日龄。
[0072] 在各日龄鸡中可以例如皮下或肌内、皮内、经皮肤地使用多种施用途径。可在羊膜 囊和/或胚胎中进行卵内接种。商购可得的卵内和SC施用装置可用于接种。
[0073] 本发明现通过下列非限定性实施例来进一步描述。 实施例
[0074] 使用由 J. Sambrook 等人（Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)描述的标准 分子生物学技术进行DNA插入物、质粒和重组病毒载体的构建。
[0075] 实施例1表达NDV-F的重组vHVTl 14的构建
[0076] 供体质粒DHM103+F〇Dt的制各
[0077] 利用Notl消化包含HVT FC126的基因间I臂（参见图2)、SV40启动子和SV40poly A的质粒pHM103 (Merial Limited)，将其去磷酸化，通过凝胶提取5. 6kb片段。也对化学合 成的密码子最优化基因型Vlld NDV-F基因 （SEQ ID N0:1，编码SEQ ID N0:2)的侧翼连接 有Notl的1. 7kb片段进行Notl消化，随后凝胶提取该1. 7kb片段。连接5. 6与1. 7kb片 段以产生pHM103+Fopt (图3)。
[0078] 重鉬HVT病毒载体的产牛
[0079] 使用pHM103+Fopt (作为供体质粒）和从HVT株FC126分离的病毒DNA通过次代 鸡胚成纤维细胞（2° CEF细胞）的共电穿孔来进行体外重组（IVR)。使用300ul Opti-MEM 中的lxlO7个2° CEF进行共电穿孔，利用950的电容在150伏于2mm电穿孔杯中进行电休 克。将转染的细胞接种入96孔板，温育5天。随后将96孔板中生长的细胞以一式两份分 入两个96孔板。将一组96孔板用于使用抗NDV-F的鸡多克隆血清的IFA以鉴定包含重组 体的阳性孔，将另一组96孔板用于从阳性孔回收被感染的细胞。
[0080] 首先通过96孔板复制并进行IFA选择来筛选出包含最具IFA阳性的斑和最少量 IFA阴性斑的孔，以进行重组病毒纯化。随后收获符合这些标准的孔，将其在DMEM+2% FBS 中调整至lml。从lml原液取出5-20ul，将其与lxlO7个CEF于10ml DMEM+2%FBS中混 合，随后等分至新的96-孔板中以便每孔具有单个HVT斑。通过PCR测试包含单个斑的孔 的上清液中亲代病毒的不存在。在5轮斑纯化后，分离称为VHVT114的重组病毒，通过IFA 和PCR测试纯度以确认NDV-F表达和亲代病毒的不存在。
[0081] 重鉬 VHVT114 的 PCR 分析
[0082] 通过酚/氯仿提取从VHVT114提取DNA，将DNA进行乙醇沉淀，随后重悬浮于20mM HEPES。PCR引物（表1中显示的）被设计来特异性鉴定密码子最优化的NDV-F、SV40启动 子的存在以及来自FC126CL2亲代病毒的重组病毒的纯度。使用200ng的DNA模板与表1 中所示的指定引物对进行PCR。PCR循环条件如下：在94°C进行2min ;30个循环（在94°C 进行30秒、在55°C进行30秒、在68°C进行3分钟）；在68°C进行5分钟。预期的PCR产物 示于表2中。PCR结果示于图4中。如图4中所示，凝胶电泳后PCR产物的尺寸对应于具有 预期尺寸和条带模式的孔。
[0083] 表 1
[0084]
【权利要求】
1. 一种组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包含含有至少一个或多个编码和表达禽类病 原体的至少一种抗原的异源多核苷酸的一种或多种火鸡重组疱疫病毒（HVT)载体。
2. 权利要求1的组合物或疫苗，其中所述HVT载体包含编码并表达新城疫病毒 F(NDV-F)抗原的异源多核苷酸，所述抗原与SEQ ID勵:2、4、6、33、35或37中所示的氨基酸 序列具有至少80 %的序列同一性。
3. 权利要求2的组合物或疫苗，其中所述编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于选 自SV40启动子、MDV gB启动子和豚鼠 CMV启动子的启动子。
4. 权利要求3的组合物或疫苗，其中所述编码NDV-F多肽的多核苷酸有效地连接于 SV40polyA 信号。
5. 权利要求4的组合物或疫苗，其中将所述编码NDV-F多肽的多核苷酸、有效连接的启 动子和SV40polyA信号插入在HVT基因组的IG1基因座内。
6. 权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含含有编码并表达IBDV VP2抗原的异源 多核苷酸的第二重组HVT载体。
7. 权利要求6的组合物，其中所述第二重组HVT载体为vHVT13。
8. 权利要求1或6的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种重组SB1载体。
9. 权利要求8的组合物，其中所述重组SB1载体包含一个或多个编码并表达新城疫病 毒F(NDV-F)抗原的异源多核苷酸。
10. 权利要求9的组合物，其中所述SB1载体选自vSBl-009、vSBl-010、vSBl-004、 vSBl-006、vSBl-007 和 vSBl-008。
11. 权利要求1的组合物或疫苗，其中所述HVT载体包含编码并表达与SEQ ID NO:2、 4、6、33、35或37中所示氨基酸序列具有至少80%序列同一性的新城疫病毒？(冊￥-朽抗原 的第一异源多核苷酸，和编码表达其与SEQ ID NO: 8或42中所示氨基酸序列具有至少80% 序列同一性的传染性法氏囊病病毒（IBDV)VP2抗原的第二异源多核苷酸。
12. 权利要求1的组合物或疫苗，其中所述HVT载体包含编码并表达与SEQ ID N0:8 或42中所不氨基酸序列具有至少80 %序列同一'丨生的两个IBDV VP2抗原的两个异源多核苷 酸。
13. 权利要求11的组合物或疫苗，其中所述编码NDV-F抗原的多核苷酸被有效地连接 于选自SV40启动子、MDV gB启动子和豚鼠 CMV启动子中的启动子，并且其中所述编码IBDV VP2抗原的多核苷酸被有效地连接于CMV启动子。
14. 权利要求13的组合物或疫苗，其中所述编码NDV-F抗原的多核苷酸被有效地连接 于SV40polyA信号，所述编码IBDV VP2抗原的多核苷酸被有效地连接于SV40polyA信号。
15. 权利要求14的组合物或疫苗，其中所述编码NDV-F抗原的多核苷酸、有效连接的启 动子和SV40polyA信号被插入HVT基因组的IG1基因座，并且其中所述编码IBDV VP2抗原 的多核苷酸、有效连接的CMV启动子和SV40polyA信号被插入HVT基因组的IG1基因座或 S0RF3-US2 基因座。
16. 权利要求11的组合物，其中所述组合物还包含含有编码并表达IBDV VP2抗原的异 源多核苷酸的重组HVT载体。
17. 权利要求16的组合物，其中所述重组HVT载体是vHVT13。
18. 权利要求11或12的组合物，其中所述组合物还包含一种或多种重组SB1载体。
19. 权利要求18的组合物，其中所述重组SB1载体包含编码并表达新城疫病毒 F(NDV-F)抗原的一个或多个异源多核苷酸。
20. 权利要求19的组合物，其中所述SB1载体选自vSBl-009、vSBl-004、vSBl-006、 vSBl-007、vSBl-008 和 vSBl-010。
21. -种重组HVT载体，其包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的一个或多个 异源多核苷酸。
22. 权利要求21的重组HVT载体，其中所述载体包含编码并表达与SEQ ID NO:2、4、6、 33、35或37中所示氨基酸序列具有至少80%序列同一性的新城疫病毒F(NDV-F)抗原的异 源多核苷酸。
23. 权利要求22的重组HVT载体，其中所述编码NDV-F多肽的多核苷酸被有效地连接 于选自SV40启动子、MDV gB启动子和豚鼠 CMV启动子之中的启动子。
24. 权利要求23的重组HVT载体，其中所述编码NDV-F多肽的多核苷酸被有效地连接 于 SV40polyA 信号。
25. 权利要求24的重组HVT载体，其中所述编码NDV-F多肽的多核苷酸、有效连接的启 动子和SV40polyA信号被插入选自HVT基因组的IG1、IG2、US10、SORF3-US2和gD的基因 座。
26. 权利要求21的重组HVT载体，其中所述载体包含编码并表达与SEQ ID NO:2、4、6、 33、35或37中所示氨基酸序列具有至少80%序列同一性的新城疫病毒F(NDV-F)抗原的第 一异源多核苷酸，和编码并表达与SEQ ID NO:8或42中所示氨基酸序列具有至少80%序列 同一性的传染性法氏囊病病毒（IBDV)VP2抗原的第二异源多核苷酸。
27. 权利要求21的重组HVT载体，其中所述HVT载体包含编码并表达两个IBDV VP2抗 原的两个异源多核苷酸，所述IBDV VP2抗原与SEQ ID NO:8或42所示的氨基酸序列具有 至少80 %的序列同一性。
28. 权利要求26的重组HVT载体，其中所述编码NDV-F抗原的多核苷酸被有效地连接 于启动子，所述启动子选自SV40启动子、MDV gB启动子和豚鼠 CMV启动子，并且其中所述 编码IBDV VP2抗原的多核苷酸被有效地连接于CMV启动子。
29. 权利要求28的重组HVT载体，其中所述编码NDV-F抗原的多核苷酸被有效地连接 于SV40polyA信号，并且所述编码IBDV VP2抗原的多核苷酸被有效地连接于SV40polyA信 号。
30. 权利要求29的重组HVT载体，其中所述编码NDV-F抗原的多核苷酸、有效连接的启 动子和SV40polyA信号被插入HVT基因组的IG1基因座，以及其中所述编码IBDV VP2抗原 的多核苷酸和有效连接的CMV启动子以及SV40polyA信号被插入HVT基因组的IG1基因座 或S0RF3-US2基因座。
31. -种用于接种动物的方法，其包括施用权利要求1-30中任一项的组合物或载体至 少一次。
32. -种用于诱导动物中抗一种或多种禽类病原体的免疫原性或保护性反应的方法， 其包括施用权利要求1-30中任一项的组合物或载体至少一次。
33. 权利要求32的方法，其中所述禽类病原体选自新城疫病毒（NDV)、传染性法氏囊病 病毒（SMBDV或禽肾病病毒）、马立克氏病病毒（MDV)、传染性喉气管炎病毒（ILTV)、禽脑 脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽 冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒球虫病（艾美球虫属的种）、 弯曲杆菌属的种（Campylobacter sp.)、沙门菌属的种（Salmonella sp.)、鸡败血支原体 (Mycoplasma gallisepticum)、滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae)、巴斯德菌属的种 (Pasteurella sp.)、禽杆菌属的种（Avibacterium sp.)、大肠杆菌（E. coli)和梭菌属的种 (Clostridium sp.) 〇
34.权利要求31或32的方法，其中所述动物为禽类。
【文档编号】A61K39/12GK104159604SQ201280066323
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年11月29日 优先权日:2011年11月30日
【发明者】M·巴布洛特, T·梅巴特森, J·普利特查德, P·林茨 申请人:梅里亚有限公司