抗哮喘的mtb-c疫苗的制作方法

抗哮喘的mtb-c疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于治疗或预防哺乳动物的变应性病症例如哮喘的药剂。所述药剂包含结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis-complex，MTB-C)菌株的片断。这些具体的片断可来源于有毒力的MTB-C菌株和/或以脂质体组合物的形式存在。所述药剂可包含其他组分，例如脂质体形成剂和/或来源于MTB-C菌株的具体蛋白。可利用本发明所述的药剂治疗的具体变态反应是变应性哮喘。本发明还提供了包含所述药剂的药物组合物。施用本文中所述的药剂显著减弱了敏化动物气道中的气道过度反应性、嗜曙红细胞增多和淋巴细胞增多。所述药剂在所有的经评估参数方面的有效性都超过了商业化的疫苗BCG丹麦1331菌株。NCTC 1353620101203
【专利说明】抗哮喘的MTB-C疫苗
[0001] 引言
[0002] 本发明涉及用于治疗或预防哺乳动物（例如人）的变应性病症（例如哮喘）的药 齐LU所述药剂包含结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuberculosis-complex，MTB-C) 菌株的片断（fragment)。
[0003] -般而言，许多物质可引发变态反应，这些物质包括但不局限于环境因素例如花 粉、灰尘、霉菌，植物（像草或树），动物皮屑，食物，药物或化学品。变态反应的症状包括但 不局限于发痒、肿胀、流鼻涕、流眼泪、咳嗽、气喘、呼吸困难、荨麻疹、疹子、产生黏液或者甚 至是作为更严重反应的过敏反应。变态反应及其严重程度在任何给定物种的个体之间都存 在巨大差异。
[0004] 人们普遍认为：变态反应的分子基础存在于旨在保护机体免受潜在危害的哺乳动 物免疫系统中。在显示变态反应的个体中，免疫系统对变应原（即引发免疫反应的物质） 做出反应。典型的变应原包括例如花粉、螨虫（mites)或霉菌，并且这些变应原通常是可吸 入的，这使它们成为呼吸道变态反应的重要触发物。因此，变态反应是对这样的物质过度敏 感的免疫反应，该物质在健康的（不受影响的）个体中是无害的，但可在被影响的个体中引 起有害的症状。
[0005] 对变应原的固定的过度敏感性也被称为特应性。尽管在过度敏感性反应可发生之 前必须发生与变应原的接触，但特应性可以具有遗传成分。最常见的一种呼吸道变应性疾 病是变应性哮喘，它是最常见的变态反应之一。由此，可以理解变应性哮喘是最常见的哮喘 类型。约90%患有儿童期哮喘的儿童患有（其它）变态反应，而在成年人中这个比例约为 50%。吸入特定的变应原可引起与变应性哮喘有关的哮喘症状的发生。当在冷空气中锻炼 或者吸入任何类型的烟雾、灰尘、烟气和有时的强烈气味之后，几乎每个患有哮喘（变应性 的或非变应性的）的个体都会情况变差。
[0006] 哮喘是阻塞性肺病，并且是临床医学上遇到的最常见的疾病之一。哮喘的典型特 征在于多种程度的气流阻塞、气道炎症反应和支气管过度反应性。一些哮喘患者还表现出 对常见吸入物（例如花粉）的过度敏感性。哮喘是慢性的呼吸系统炎症性疾病，它导致气 道上皮的破坏、炎性细胞的浸润以及平滑肌的紧张。哮喘是慢性的呼吸系统炎症性疾病，其 特征在于可逆性气道阻塞以及气管和支气管的过度反应性，导致气道变窄。哮喘的临床特 征为气喘、呼吸困难和咳嗽。虽然哮喘的最常见形式是变应性哮喘，但其它引起哮喘的因素 包括感染、锻炼、空气污染和可能的情绪因素。在患有哮喘的对象中，从肺到鼻子和嘴的气 道变窄，从而导致呼吸困难。这些症状长期存在或急性发作，或者是慢性疾病的急性发作症 状；它们通常响应环境变化例如天气变化、变应原的存在和/或呼吸道感染而多次出现。哮 喘还被定义为由肺病引起的突发性或慢性呼吸困难。
[0007] 不希望受任何特定理论的束缚，哮喘和其它变态反应经常牵涉遗传易感性。虽然 一些患者的确显示出哮喘或其它变态反应的家族史，但大量患者没有个人史或家族史。
[0008] 支气管哮喘的特征在于复现性平滑肌收缩，并且作为慢性或阵发性病症或者慢性 疾病的阵发性症状发生。支气管哮喘的临床特征为：阵发性或慢性气喘、咳嗽和胸闷感；肺 功能检测中气流受限；支气管扩张治疗后阻塞性功能紊乱的完全或部分可逆性。
[0009] 哮喘的基本症状是慢性炎症，患者的肺通常显示过度炎症。哮喘的标志是支气管 过度反应性（支气管过度响应性）。支气管过度响应性（或与气道的其它结合或过度反应 性）是特征为易于引发支气管痉挛（细支气管或小气道的收缩）的状态。哮喘患者显示出 的主要症状是气道过度响应性（airwayhyperresponsiveness，AHR)，即对非特异性支气管 收缩剂如乙酰甲胆碱起反应的支气管肌肉的过度收缩反应。乙酰甲胆碱（氯乙酰甲胆碱） 是一种合成的胆碱酯，它在副交感神经系统中起非选择性毒蕈碱受体激动剂的作用。可使 用乙酰甲胆碱通过支气管激发试验诊断支气管过度反应性/过度敏感性/过度响应性（这 三个术语可交换使用）。对此，化学物质（像乙酰甲胆碱或组胺）在正常个体中也引发支气 管痉挛，但支气管过度响应性的个体的阈值更低。
[0010] 20世纪中期以来，哮喘和其它特应性/变应性反应的普遍性和严重性显著增加。 一些研究已经指出：特应性疾病（包括哮喘）的普遍性与早年抗原暴露相关。在农场长大 的儿童、有更多哥哥姐姐的儿童以及早年参加幼教中心的儿童似乎在很大程度上避免了哮 喘和其它特应性病症。这导致了 "卫生假说"的形成，根据该假说，特应性疾病的风险与儿童 期较少的微生物暴露相关（Strachan，BMJ.，1989, 299 :1259-1260 ;和Rook等人，Springer Semin.Immunopathol.，2004. 25 :237-255)。目前人们认为在被暴露的个体（儿童）中固 有免疫系统被抗原激活可能是这种现象的分子原因。固有免疫系统基于识别"外来"模式 (与病原体/微生物相关的模式（PAMP/MAMP))，并且对潜在病原体提供快速但非特异地应 答（需要之前没有暴露至特定的病原体）。
[0011] 已知T-辅助2 (Th2)细胞因子在变应性哮喘和其它变应性/特应性反应中起重 要作用。这些Th2细胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13等，它们诱导许多特应性反应和炎症 的临床表现，例如B细胞同种型转变成IgE产生、嗜曙红细胞趋化和激活以及气道的特异 性反应例如支气管的过度反应性（Kline，Proc.Am.Thor.Soc.，4(3) :283-8,2007)。嗜曙 红粒细胞（eosinophilgranulocyte)(通常被称为嗜曙红细胞（eosinophil)或嗜酸细胞 (acidophils))是免疫系统组分中的一种白血细胞，它负责与多细胞寄生生物和脊椎动物 中的某些感染斗争。嗜曙红粒细胞还同肥大细胞一起控制与变应反应和哮喘相关的机制。 嗜曙红粒细胞是在造血过程中形成于骨髓的粒细胞，然后其迁移至血液。在变应性哮喘中， 嗜曙红细胞通常发现于支气管周围区域，因此它们被称为支气管周嗜曙红细胞。
[0012] 由于Thl反应和Th2反应是相反调控的，因此人们提出诱导Thl反应可避免不想 要的Th2反应（例如特应性病症，像变应性哮喘）并且对Thl反应的这种诱导可提供对特 应性哮喘的易感性增加。然而，肠虫侵袭的儿童（具有强烈的Th2炎症）中变应性疾病降 低以及伴随哮喘流行的Thl依赖性疾病（例如1型糖尿病、炎症性肠病和多发性硬化病） 的普遍性增加暗示，诱导Thl驱动的免疫并不能充分解释卫生假说所述的保护。最近的工 作集中于通过与病原体相关的分子模式来促进已知抑制Thl类型和Th2类型两种炎症的调 控类型的响应（Treg细胞）（Kline等人，JallergyClinTmmunol2005;116:1202-5)。
[0013] 变应性哮喘是目前日益流行的气道疾病，对其治疗集中于控制症状，但并不总是 成功的。
[0014] 这种治疗可涉及吸入皮质类固醇或者施用β激动剂、甲基黄嘌呤、胆碱能药或白 三烯激动剂。然而这些药剂通常不仅针对哮喘，而是伴随大量的副作用。因此期望使用根 据病症定制的药剂；从这种意义上来说，研究用于调节哮喘和特应性疾病中的炎症的微生 物产品的应用是目前研究中有成果的领域。为此，现有技术中使用在临床试验中已被检测 过的下述药剂：（1)具有CpG基序的核酸；（2)BCG(卡介苗（Bacille-CalmetteGuerin),牛 分枝杆菌（M.bovis))，其是活的预防性结核病疫苗，来源于牛分枝杆菌的减毒菌株；（3)目 前正处于临床开发的包括加热灭活的母牛分枝杆菌（M.vaccae)的药剂。
[0015] LCdG二核苷酸：细菌DNA区别于哺乳动物DNA之处在于其中存在胞嘧啶-鸟嘌 呤（CpG)二核苷酸未被甲基化的序列模式，细菌DNA的许多效应都可以被在特定的碱基序 列基序（CpG0DNS)中含这些CpGs的寡脱氧核苷酸（ODNs)再现。有假说认为CpGODNS通 过引起Thl/Th2平衡的调控防止特应性哮喘。例如，Kline等人，JallergyClinImmunol 2005 ;116 :1202-5中综述了Cp⑶NA作为可能的免疫调节剂在哮喘患者中的作用。
[0016] 2.BCG肺结核疫苗：if如一 @研究所提出的，发汰国家中细菌感染(例如肺 结核）的下降是造成特应性疾病的普遍性和严重性上升的因素，在哮喘的预防性疗法 中，已检验了基于减毒的牛分枝杆菌活菌株的抗结核分枝杆菌（M.tuberculosis)的 BCG(Bacille-CalmetteGuerin)预防性疫苗。然而，由于不同的流行病学研究显示出相反 的结果，所以关于BCG接种和哮喘之间的逆相关仍然存在相冲突的观点。BCG作为抑制变态 反应的药剂的生物学解释一般地基于其刺激Thl细胞因子产生的能力。Zhang等人，Chin. Med.J.，2009,122 (5) :577-583 综述了BCG在哮喘中的作用。
[0017] 3.母牛分枝杆菌：第三种途径基于下述假说:最初研发以治疗肺结核的母牛分枝 杆菌（Evaccae)疫苗能够减弱变应原激发后发生的哮喘反应。母牛分枝杆菌疫苗基于 加热灭活的母牛分枝杆菌菌株。有人提出加热灭活的母牛分枝杆菌可调节Thl/Th2的平 衡。在一些临床试验中已检测到母牛分枝杆菌的作用的阳性结果（Camporota等人，Eur. Respir.J.，2003,21 :287-293)。
[0018] 鉴于上述途径（1)至（3)中每个的缺点，有必要研发可改善普遍情况且能够被用 作预防性和/或治疗性药剂的新型化合物和组合物。
[0019] 待解决的问是页
[0020] 本发明的目标是提供用于治疗和预防人类和其它哺乳动物的变应性病症（包括 哮喘和鼻炎）的改进的药剂。
[0021] 发明简沭
[0022] 本发明涉及用于预防或治疗人类或动物的变应性反应的药剂，其包含结核分枝杆 菌复合群（MTB-C)菌株的片断。在一些具体的实施方式中，所述药剂进一步具有至少一种 下述特征：
[0023] 1.所述片断来源于有毒力的结核分枝杆菌复合群（MTB-C);
[0024] 2.所述药剂可通过如下获得：培养MTB-C菌株，然后在优选的非离子型表面活性 剂的存在下均化细胞培养物；
[0025] 3.所述药剂是包含脂质体形成剂和蔗糖的脂质体制剂；
[0026] 4.所述药剂是包含脂质体形成剂且微粒的Z-平均粒径（z-averagesize)为 150nm或更小的脂质体制剂。
[0027] 虽然可以单独满足以上特征1-4中的一个，但也可以联合满足它们的任意一个或 更多个。因此，例如，在特征1和特征2的情况下，所述药剂还可以是脂质体制剂的形式；在 特征1-3的情况下，脂质体微粒的z-平均粒径还可以是150nm或更小。在一个具体的实施 方式中，脂质体微粒的Z-平均粒径可以是40-135nm，更优选的是55-125nm;或者，本发明的 脂质体制剂可以是乳剂，从而微粒的Z-平均粒径可以小于40nm。优选地，粒径均匀分布以 使微粒的多分散指数为〇. 4或更小，优选0. 3或更小。
[0028] 而且，根据任何上述特征2-4的微粒还可以具有以下特征：所述结核分枝杆菌复 合群（MTB-C)菌株是有毒力的结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株。在本发明的一个具体实 施方案中，结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株是于2010年12月3日保藏于伦敦NCTC的 MTB-C菌株NCTC13536。
[0029] 本发明的药剂可以是脂质体制剂，其可以额外地包含表面张力活性剂（d)。本发 明的药剂还可以额外地包含一种或更多种非离子型表面活性剂（e)。优选地，所述非离 子型表面活性剂选自烧基酚乙氧基化物（alkylphenolethoxylates)和山梨醇酐酯乙氧 基化物（sorbitanesterethoxylates)以及更优选的辛基酌·乙氧基化物（octylphenol ethoxylate)〇
[0030] 本发明药剂的MTB-C片断还可以是或者包含细胞壁片断。
[0031] 本发明的药剂可进一步具有一种或更多种下述特征：（i)所述脂质体形成剂可以 是氢化的、部分氢化的或者未氢化的磷脂，优选的是卵磷脂，最优选的是大豆卵磷脂。（ii) 所述表面张力活性剂选自胆酸盐/酯、脱氧胆酸盐/酯、胆固醇和胆固醇半琥珀酸酯。（iii) 所述片断是或者包含MTB-C的蛋白片断。在一个其【具体实施方式】中，所述药剂可包含至少 两种，优选三种，更优选四种，最优选所有的下述物质：
[0032] (i)分子量约为70kDa的第一个多肽，其质量指纹图谱（massfingerprint)与结核 分枝杆菌（M.tuberculosis)HSP70蛋白（Rv0350)的质量指纹图谱相似，
[0033] (ii)分子量约为38kDa的第二个多肽，其质量指纹图谱与结核分枝杆菌38kDa蛋 白（Rv0934)的质量指纹图谱相似，
[0034] (iii)分子量约为30kDa的第三个多肽，其质量指纹图谱与结核分枝杆菌Ag85B蛋 白（Rv1866c)的质量指纹图谱相似，和
[0035] (iv)分子量约为IOkDa的第四个多肽，其质量指纹图谱与结核分枝杆菌CFP10蛋 白（Rv3874)的质量指纹图谱相似，和
[0036] (V)分子量约为6kDa的第五个多肽，其质量指纹图谱与结核分枝杆菌ESAT-6蛋白 (Rv3875)的质量指纹图谱相似。
[0037] 更进一步，本发明的药剂中可以存在下列结核分枝杆菌抗原或其片断中的至少一 种：HSP70、38kDa蛋白和Ag85B。所述药剂中还可以包含一种或更多种霉菌酸和/或糖缀合 霉菌酸酯，优选海藻糖二霉菌酸酯和/或糖脂，优选脂阿拉伯甘露聚糖。本发明所述的药剂 可额外包含一种或更多种盐或者其溶液，其中所述盐优选地是氯化钠。
[0038] 特别在所述药剂满足上述特征2的情况下（即，所述药剂可通过如下获得：培养 MTB-C菌株，然后在优选的非离子型表面活性剂的存在下均化细胞培养物），可获得所述药 剂的方式可进一步具有如下特征：(a)培养MTB-C菌株等于或大于3周的时间，然后（b)在 非离子型表面活性剂的存在下均化细胞培养物。在一个优选的实施方式中，可获得所述药 剂的方法进一步包括以下步骤：
[0039] a.通过离心的方式分离未片断化的细胞和溶解的组分，
[0040] b.使细胞壁片断的级分经受化学处理或物理处理以使其最终所含的最终有毒力 菌株细胞失活，和
[0041] c.通过冷冻干燥法干燥所述药剂。
[0042] 可以根据本领域已知的任何方法保藏根据本发明所述的药剂；然而，对于根据本 发明所述的脂质体制剂的情况，优选地通过冻干保藏。
[0043] 本发明还涉及用于预防或治疗人或动物的变态反应的药物组合物，其包含本发明 所述药剂（脂质体制剂）和药学上可接受的载体。
[0044] 在一个【具体实施方式】中，可利用本发明所述的药剂（例如脂质体制剂）治疗的变 态反应是由IgE介导的。所述反应可以是特应性。所述变态反应可以是呼吸功能障碍和/ 或支气管炎症。优选地，所述反应选自哮喘、花粉热、鼻炎和湿疹。不希望受任何特定理论 的束缚，目前认为哮喘、花粉热、鼻炎和湿疹可涉及变应产生性（allergenic)反应。然而， 本发明涉及本文中所述的药剂和药物组合物用于预防或治疗哮喘、花粉热、鼻炎和湿疹中 的任意一种或更多种的所有用途，而不考虑在特定个体中哮喘、花粉热、鼻炎和湿疹是否涉 及变态反应。然而，优选地，在一个实施方式中，哮喘是变应性哮喘，鼻炎是变应性鼻炎。在 一个【具体实施方式】中，哮喘是支气管哮喘。
[0045] 施用途径本身没有特别的限制，除非药剂或组合物的特征需要有限制。然而，优 选地提供用于注射（优选的是皮下注射或肌内注射）或者用于舌下施用、吸入施用、经皮 (percutaneous)施用或皮内（intradermal)施用的本发明所述的药剂或组合物。在一个具 体实施方式中，本发明所述的药剂或药物组合物施用每剂量200μg或更低，优选地每剂量 多至50μg，例如最优选每剂量25μg。
[0046] 在一个【具体实施方式】中，本发明所述的药剂或药物组合物被用于预防变态反应。 在一个替代性的【具体实施方式】中，本发明所述的药剂或药物组合物被用于治疗变态反应。
[0047] 可以施用根据本发明所述的药剂一次或几次，在预防的情况下，优选施用至少两 次，优选地施用多于两次。本发明所述的药剂或药物组合物可被提供用于重复施用，优选地 以一周或者更久为间隔，更优选地以两周或者四周为间隔。
[0048] 附图简沭
[0049] 图1 :流程图，其显示了药物FCMtb的上游工序，包括工序中涉及的材料和试剂以 及适合的工序中控制。
[0050] 图2 :流程图，其显示了药物FCMtb的下游工序，包括工序中涉及的材料和试剂以 及适合的工序中控制。
[0051] 图3 :蛋白表征的流程图。
[0052] 图4:通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色方法鉴定抗原。显示了参考抗原 ESAT6(6kDa) (7)、CFP10(10kDa) (6)、Ag85B(30kDa) (I)、38kDa(2)、HSP70(70kDa) (4)以及分 子量标记MW(5)。
[0053] 图5 :蛋白表征。图5a:蛋白图谱：SDSpage之后进行考马斯壳监染色，参考标 准品FCMtb-52. 1 (1-6)在终浓度为 15. 6μgFCMtb/mL(l、2)、6· 25μgFCMtb/mL(3、4)和 1.56ygFCMtb/mL(5、6)时的蛋白图谱。分子量的单位为kDa。图5b:SDSpage之后进行银 染鉴定19kDa的条带。图5c:蛋白图谱：通过SDS-PAGE和银染方法鉴定指定FCMtb批次中 的条带（IOkDa和6kDa)以及平行进行的来自Lionex的ESAT-6标准品。不同的FCMtb批次 (1、2、3、9、10、11、（FCMtb-52. 1批次在泳道9))，不同浓度的来自Lionex的ESAT-6标准品 (4-8) ;5d:通过Western印迹使用特定抗体与结核分枝杆菌HSP70标准品平行地Western 印迹鉴定FCMtb批次中的抗原结核分枝杆菌HSP70(Rv0350)。不同的FCMtb批次（1、2、3、 4、7、8、9)，HSP70标准品（5、6) ;5e:通过Western印迹法使用特异性抗体鉴定FCMtb批次 中的抗原结核分枝杆菌38kDa(Rv0934)和平行进行的来自Lionex的结核分枝杆菌38kDa 标准品。使用Odyssey系统进行荧光检测。不同的FCMtb批次（1、2、3、6、7)，381^)&标准品 (4、5)。5f:通过Western印迹法使用特异性抗体鉴定FCMtb批次中的抗原Ag85B(Rvl886c) 和平行进行的来自Lionex的结核分枝杆菌Ag85B标准品。使用Odyssey系统进行突光检 测。FCMtb批次（1、2、3、5、6、7)，六8858标准品（4)。
[0054] 图6 :用基于本发明所述的药物疫苗组合物的脂质体制剂接种小鼠2次后，利用 Western印迹法分析不同FCMtb批次（50μg/泳道）的指定蛋白条带与从被感染的小鼠中 得到的经1/8000稀释的血清的相互作用。
[0055] 图7 :脂质分析。7a:利用TLC方法鉴定参考菌株（H37Rv(2)和NCTC13536(1)和 不同FCMtb批次（3-9)以及TDM标准品（10)中的聚酰基海藻糖（polyacyltrehalose，PT)、 海藻糖6,6' -二霉菌酸酯（TDM)和二酰基海藻糖（DAT)。7b:利用TLC法鉴定FCMtb批次 中的海藻糖6,6' -二霉菌酸酯（TDM)。图（A)和（B)代表两个独立的试验。（A)TDM标准 品为（11)和（12)，其它泳道是不同的FCMtb批次。B=(I)TDM标准品为（1)，其它通道是不 同的FCMtb批次。7c:利用TLC法分析FCMtb批次中霉菌酸I、III和IV的模式。图（A)、 (B)和（C)代表三个独立的试验。（A)FCMtb批次（1-6 (FCMtb-51. 2标准品6))。（B)用于 说明/参考，（C)批次FCMtb-47b(l)，与霉菌酸标准品（2)比较。7d:LAM的鉴定（左边的 泳道是参照物，其余的通道中是来源于本发明所述的脂质体的样品）。
[0056] 图8 :冷冻断裂制备的脂质体浓缩液（LCS)本体（bulk)(电子显微镜）。
[0057] 图9 :根据本发明的优选实施方式的方法的流程图。
[0058] 图10显示了方案的示意性概要：诱导哮喘、用制剂A处理（参见实施例11)、测量 被处理的动物和对照中的那些变量。
[0059] 图11 :显示所有个体值的平均值的条线图中的结果显示图。
[0060] 图12通过比较敏化动物相对于未敏化动物的肺功能和嗜曙红细胞募集，显示暴 露于OVA对未被处理的动物的影响。如数据所示，与未敏化动物相比，暴露于OVA的那些动 物对乙酰甲胆碱显示气道反应明显和显著（P< 0. 001，二因素AN0VA)增强（图12a)，因此 敏化过程是有效的。此外，未敏化动物的气道中含有极其少量的嗜曙红细胞，但发明人在那 些对OVA敏化的动物的气道中发现肺部嗜曙红细胞增多显著增加（p< 0. 001，t检验）（图 12b)。因此，本模型有利于评估试验处理引起的潜在效果。
[0061] 图13显示了 7组小鼠响应于剂量增加的乙酰甲胆碱的支气管反应性，而图14显 示了 4个不同的处理组（a、b、c和d)。为了简化整体的数据表示，仅在图14中指出了统计 显著性。
[0062] 图14显示了每个动物相对于其自身在基线时的响应的归一化的剂量-响应曲线。 用BCG或制剂A处理（P)的未敏化动物显示出比未被处理的对照组中的未敏化动物更高 的反应性（14a)。将比较用BCG疫苗处理的动物时，没有观察到敏化和未敏化动物之间支 气管反应性的差异（14b)。就用制剂A疫苗处理而言，在敏化动物中预防性施用（P)导致 的反应性比用同样的疫苗处理未敏化动物所展示的反应性低（14c)。并且，其还低于在敏 化动物和用BCG处理的那些这二者中观察到的反应性（14d)。与未被处理的敏化小鼠的曲 线相比，虽然没有达到在未敏化小鼠中观察到的基线反应值，但反应性的抑制变得非常明 显（p< 0. 001，二因素ANOVA)。治疗性处理方案略微减弱了对乙酰甲胆碱的响应（剂量从 2. 50mg/ml开始），但从未达到统计显著性（14d)。
[0063] 图15用图表表示出不同组中嗜曙红细胞增多的统计显著性。更多细节请参见正 文。
[0064] 定义
[0065] 如果没有另行指明，"粒径"指的是微粒的直径。当无法精确测量粒径时，指的是近 似粒径。
[0066] "z-平均值"是平均粒径，可根据材料和方法部分所述进行测定。
[0067]
[0068] BAL 支气管肺泡灌洗
[0069] BCG 卡介苗
[0070] CFU 集落形成单位
[0071] CpG 胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸
[0072] DP 药品
[0073] DS 药物
[0074] ELISA 酶联免疫吸附试验
[0075] ELISP0T酶联免疫印迹试验
[0076] EMDA 欧洲药品管理局
[0077] FCMtb 结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株的片断
[0078] IFN- y 干扰素Y
[0079] IgE 免疫球蛋白E
[0080] IGTIP德国TriasiPujolCiSnces研究所（InstitutperalaRecerca enCiencesdelaSalutGermansTriasiPujol)
[0081] IL 白介素
[0082] IMP 研究药品
[0083] i.p. 腹腔内
[0084] IPC 艺中控制
[0085] LCS 脂质体浓缩悬液
[0086] LPS 脂多糖
[0087] Mtb 结核分枝杆菌
[0088] Mtb-C 结核分枝杆菌复合群
[0089] NCTC 国家典型菌种保藏中心（伦敦）
[0090] OVA 卵清蛋白
[0091] PPD 蛋白纯化衍生物
[0092] q.s. 足量
[0093] s.c. 皮下
[0094] TB 肺结核
[0095] ThlT辅助细胞I
[0096] Th2 T辅助细胞2
[0097] w/v 重量/体积
[0098] w/w 重量/重量
[0099] Form. A 制剂A
[0100] 发明详沭
[0101] 本发明涉及用于预防或治疗人类或动物的变应性反应的药剂，其包含结核分枝杆 菌复合群（MTB-C)菌株的片断。
[0102] 除非另有明确说明，本申请的上下文中使用的术语"包含"表示除通过"包含"引 入的列表中的成员外还可任选地存在其他成员。然而涉及本发明所述的一个【具体实施方式】 时，术语"包含"涵盖不存在其他成员的可能性，即为了该实施方式的目的，"包含"应被理解 为具有"由……组成"的含义。
[0103] 详细的描述公开了本发明单个特征的特定和/或优选的变化形式。本发明还考虑 了作为特别优选的实施方式的通过将对本发明两个或更多个特征描述的两个或更多个特 定和/或优选的变化形式组合而产生的那些实施方式。
[0104] 所述药剂可进一步具有至少一种下述特征：
[0105] 1.所述片断来源于有毒力的结核分枝杆菌复合群（MTB-C);
[0106] 2.所述药剂可通过以下获得：培养MTB-C菌株，然后在优选的非离子型表面活性 剂的存在下均化细胞培养物。
[0107] 3.所述药剂是脂质体制剂，其包含来源于结核分枝杆菌复合群（MTB-C)的片断， 脂质体形成剂和蔗糖，
[0108] 4.所述药剂是脂质体制剂，其包含来源于结核分枝杆菌复合群（MTB-C)的片断， 脂质体形成剂并且微粒的Z-平均粒径为150nm或更低。
[0109] 贯穿本说明书，"有毒力（virulent)的结核分枝杆菌复合群（MTB-C) "表示对（至 少）人类有毒力的结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株。已知BCG(牛分枝杆菌）和加热灭活 的药剂（例如加热灭活的不属于MTB-C的母牛分枝杆菌）对具有免疫力的人是无毒力的。 在具有上述特征1的实施方式中，所述片断不来源于牛分枝杆菌或者（加热失活的）母牛 分枝杆菌。在一个具体的实施方式中，所述片断不来源于BCG，尤其不来源于BCG丹麦1331 菌株。为避免生疑，肺结核并非变态反应。优选地，在本发明的限定中，不施用所提供的药 剂用于预防或治疗肺结核。
[0110] 特别地，可通过包括下述步骤的方法得到根据上述特征2所述的药剂：（a)培养 MTB-C菌株等于或多于3周的时间，然后（b)在非离子型表面活性剂的存在下均化细胞培养 物。
[0111] 可以看出上述特征3和特征4的共同之处在于：所述药剂是包含来源于结核分枝 杆菌复合群（MTB-C)的片断和脂质体形成剂的脂质体制剂。
[0112] 虽然可以单独满足上述特征1-4中的一个，但也可以联合满足它们之中的任意一 个或更多个。因此，例如，在特征1和特征2的情况下，所述药剂还可以是脂质体制剂的形 式；在特征1-3的情况下，脂质体微粒的Z-平均粒径还可以是150nm或更小等。2、3或者 所有特征1-4的任意组合都是可行的。人们通常认为脂质体化（liposomation)过程产生 脂质环境，从而促进溶解并产生物质（例如FCMtb)的悬液。本发明意义上的脂质体可以是 单层的、多层的或其组合。
[0113] 来源于结核分枝杆菌复合群（MTB-C)的片断也被称为FCMtb15FCMtb可以是来源于 MTB-C菌株或者MTB-C菌株的任意混合物的任何类型的物质，优选地，所述片断是或者来源 于蛋白质和/或脂质。本申请意义上的FCMtb通常是可来源于MTB-C细胞的不同的蛋白抗 原和脂质的混合物。可利用本领域技术人员已知的任何适于片断化微生物或细菌细胞（特 别地，例如MTB-C细胞）的方法（例如均化）得到细胞片断。在一个具体的实施方式中，可 以按照W02008053055和EP2090318A1中所述得到细胞片断，尽管并不一定限于有毒力菌株 (如上所述）。
[0114] 可通过超声处理的方法或者通过联合使用直径约为0.Imm的小珠（例如二氧化 硅或者氧化锆/二氧化硅珠）和机械匀浆器的方法进行均化。可用的机械匀浆器例如是 BioSpecBeadBeater?型。通过这种均化方法破碎MTB-C细胞以得到通常包含小的细胞 壁片断的小的细胞片断。在一个具体的实施方式中，可以按照W02008053055和EP2090318 Al中所述得到细胞片断，尽管并不一定限于有毒力菌株（如上所述）。
[0115] 如本领域技术人员所公知，制造细胞片断的典型相关特征是通过部分去脂对细 胞壁片断"脱毒（detoxification) "，该过程允许除去类内毒素分子，像脂阿拉伯甘露聚糖 (Iipoarabinomanann)。因此，优选地对FCMtb进行脱毒和巴氏消毒，因而所获得的脂质体 制剂是无菌且不含内毒素的。任选地，可冷冻干燥缓冲液中的细胞片断分散体以利于其存 储。为此，可将分散体分装至小瓶并且在-15°C至-120°C的温度，例如，-45°C并且真空，例 如在 0· 1-0. 5mbar。
[0116] 当药剂是脂质体制剂时，脂质体通常的粒径分布为：其中至少99. 9% (根据数量） 小于lym。在一个具体的实施方式中，微粒的Z-平均粒径（可通过动态光散射测定）为 150或更小，优选地135nm或更小，更优选地125nm或更小。（也可以是145nm或更小、140nm 或更小、130nm或更小、120nm或更小、IlOnm或更小、IOOnm或更小、95nm或更小、90nm或更 小、85nm或更小、80nm或更小）。在动态光散射中，Z-平均参数被认为是可通过技术得到的 稳定且重要的数值，尺寸数值被优选地用于控制质量目的。优选地，根据本发明所述的制剂 中的脂质体是单型（monomodal)的，即在动态光散射测定中它们仅显示一个峰。更优选地， 如利用电子显微镜对用冷冻断裂制备的脂质体制剂可检测的，根据本发明所述的制剂的脂 质体是球形的（如图8所示）。球形意味着对于至少90%的脂质体微粒（根据数目）而言， 单个微粒的所有表面点到脂质体中心的距离相似或相同，即这种微粒的最小半径相对同一 微粒的最大半径的比率为〇. 6或更大、0. 7或更大、0. 8或更大或者0. 9或更大。根据本发 明所述的脂质体制剂可包括多层或单层脂质体或其混合物。与本领域技术人员的标准知识 相符，应该在合适的缓冲液（即其本身不会破坏、分解或融合脂质体或者以任意其它方式 使脂质体显著地物理不稳定的缓冲液）中进行动态光散射测定。根据经验，只要离子强度 和PH值都能够比得上其中已形成脂质体的缓冲液，则任何这样的缓冲液都可以是合适的。 优选地，使用与其中已形成脂质体的缓冲液具有相似或相同构成的缓冲液。
[0117] 在上述实施方式3的情况下，脂质体制剂优选地包含1-20% (重量/体积）的蔗 糖，优选地是1-12% (重量/体积）的蔗糖，更优选地是3-8% (重量/体积）的蔗糖，最 优选地是4-6% (重量/体积）的蔗糖。特别优选的是约5%的蔗糖。
[0118] 在一个具体的实施方式中，上述脂质体制剂的Z-平均粒径为40_150nm，优选地为 50-135nm，更优选地为55-125nm。（也可以是与之前句子中的任意较低值组合的145nm或更 小、140nm或更小、130nm或更小、120nm或更小、IlOnm或更小、IOOnm或更小、95nm或更小、 90nm或更小、85nm或更小、80nm或更小）。因此，如上文所大体描述以及"材料和方法"部 分所详细描述的，优选地通过动态光散射测定Z-平均粒径（和在本说明书的全文中一般所 述的尺寸值）。
[0119] 在一个替代性的【具体实施方式】中，上述脂质体制剂的Z-平均粒径可以更小，以 使得所述脂质体制剂为乳剂，即在该具体的实施方式中，微粒的Z-平均粒径优选地低于 40nm〇
[0120] 优选地，粒径均匀分布以使微粒的多分散指数为0. 4或更低，优选地0. 3或更低。
[0121] 此外，根据任意上述特征2-4所述的微粒可进一步具有如下特征：结核分枝杆菌 复合群（MTB-C)菌株是有毒力的结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株。在本发明的一个具体 实施方式中，用于根据本发明所述的制剂的结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株是于2010年 12月3日保藏在伦敦的NCTC的MTB-C菌株NCTC13536。
[0122] 在任意一个或更多个上述实施方式的一个优选实施方式中，根据本发明所述的制 剂的脂质体还是单分散（monodisperse)的，这表示没有观察到显著的尺寸分布的宽度。在 技术上，这是通过低的多分散指数（PDI)(如利用动态光散射所测定的）例如0. 4或更低、 优选地0. 3或更低而被检测的。因此，脂质体制剂是这样的脂质体制剂，其中微粒的多分散 指数（如可通过动态光散射测定的）为0. 4或更低，优选0. 3或更低，最优选0. 25或更低。
[0123] 利用包括上游工序和下游工序的方法可获得来源于结核分枝杆菌复合群（MTB-C) 菌株的片断。在一个具体的实施方式中，可以按照W02008053055和EP2090318Al中所述 得到细胞片断，尽管并不一定限于有毒力菌株（如上所述）。为了说明目的，此处简要描述 了 5个主要的步骤，下述的实施例2和3给出了实施所述方法的具体模式。
[0124] 上游工序（实施例2):
[0125] 步骤1 :培养结核分枝杆菌
[0126] 步骤2 :收集结核分枝杆菌并冷冻粗提取物
[0127] 下游工序（实施例3):
[0128] 步骤 3 :使细胞片断化（fragmentation)并去脂（delipidation)
[0129] 步骤4:巴氏灭菌
[0130] 步骤5:冻干（任选的）
[0131] 在任意上述实施方式的一个更优选的实施方式中，结核分枝杆菌复合群（MTB-C) 菌株是有毒力的分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株。有毒力（virulent)指的是依情况的致 病性和/或杆菌入侵（人）宿主组织并引起活性疾病的能力。有毒力菌株可以是属于 MTB-C的任何物种的任何有毒力菌株，但优选的是属于结核分枝杆菌的菌株。根据本发明 所述的MTB-C菌株可被接种至本领域技术人员公知的培养基例如Middlebrook7H10或 7H11琼脂、Sauton's培养基或者Proskauer-Beck培养基而进行培养。优选地，经延长的 时间（例如等于或多于3周，优选地为3-4周）进行有毒力菌株的培养。优选地，培养温 度维持在34°C-38°C。培养结束后，收集细胞并利用本领域公知的技术（例如在专利申请 ES2231037-A1中所述的那些技术）分离细胞。
[0132] 优选地，脂质体制剂的脂质体形成剂是氢化的、部分氢化的或者未被氢化的磷脂。 所用的磷脂可以是或者包括例如：磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇。最典型的是可 合成或者从多种天然来源分离的磷脂酰胆碱。优选地，脂质体形成剂是或者包括选自蛋卵 磷脂和大豆卵磷脂的卵磷脂。大豆卵磷脂是包括磷脂酰胆碱等的磷脂的复杂混合物并且是 特别优选的。制剂中还可以包括作为脂质体形成剂本身或者额外组分的下述典型脂质：磷 酸二鲸蜡脂（dicetylphosphate，DCP)、二肉豆蘧酰基磷脂酰胆碱（DMPC)、二肉豆蘧酰基 磷脂酰甘油（DMPG)、二油酰基磷脂酰胆碱（DOPc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)、二油酰 基磷脂酰丝氨酸（DOPS)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱（DPPC)、二棕榈酰基磷脂酰甘油（DPPG)、 磷脂酰胆碱（PC)和/或磷脂酰丝氨酸（PS)，其中各脂质可以是氢化的、部分氢化的或者未 被氢化的。可以使用常规的辅助脂质和本领域技术人员公知的技术（例如那些在专利申请 ES2231037-A1中所述的技术）形成脂质体。
[0133] 进一步优选地，在任意上述实施方式中，（a)来源于结核分枝杆菌复合群（MTB-C) 菌株的片断与（b)脂质体形成剂的比例在0.01 : 1至I: 1之间，优选地在0.06 : 1至 0. 1 : 1之间。
[0134] 在任意上述实施方式的一个更优选的实施方式中，脂质体制剂额外包含：（d)表 面张力活性剂（tensioactiveagent)。通常，可以使用能够改变表面张力值的所有类型的 试剂作为本发明意义上的表面张力活性剂，但属于上述脂质体形成剂的定义下的化合物被 排除在外。多种类型的表面张力活性剂是本领域的技术人员已知的，它们可被用于根据本 发明所述的脂质体制剂中。如技术人员所知，表面张力活性剂通常是具有极性-非极性结 构的化学品。不希望受任何特定理论的束缚，表面张力活性剂通常倾向于定位在微粒的表 面，从而在界面上产生单分子层以降低表面张力值。表面张力活性剂也被称为表面活性剂 或活性表面剂。在含有表面活性剂的脂质体制剂的一个优选实施方式中，表面张力活性剂 选自固醇和其衍生物例如胆固醇和/或胆汁盐或其衍生物（例如胆酸盐/酯）。一些特别 优选的实施方式中，表面张力活性剂选自胆酸盐/酯、脱氧胆酸盐/酯、胆固醇和胆固醇半 琥珀酸酯。实施本发明的一个优良但非限制性的模式中，制剂的脂质体包含来源于大豆的 卵磷脂和胆酸钠二者。
[0135] 在一个甚至更优选的实施方式中，包含（d)表面张力活性剂的脂质体制剂是这样 的脂质体制剂，其中（a)与（d)的比率在0.05 : 1至3 : 5之间（重量/重量）。可以使 用本领域技术人员公知的多种类型的脂质体形成剂。
[0136] 所述药剂可任选地含有改善稳定性的添加剂，例如：维生素E，其被认为起着脂质 抗氧化剂的作用，因此在脂质体的情况下特别有用。
[0137] 在一个更优选的实施方式中，上述脂质体制剂是这样的脂质体制剂，其中MTB-C 细胞的片断是或者包含细胞壁片断。可以使用属于MTB-C的任何菌株，优选地使用属于结 核分枝杆菌的任何菌株。在另一个更优选的实施方式中，上述脂质体制剂包含MTB-C菌株 NCTC13536的片断，该菌株于2010年12月3日保藏在位于伦敦的NCTC(实施例1)。可以 使用的另一个菌株（因此脂质体制剂中可以包含其片断）被称为H37Rv，该菌株可从例如位 于英国伦敦的国家典型菌种保藏中心（NCTC)获得（保藏编号：NC007416)，其经常被本领域 的研究人员使用。还可以使用多于一种的菌株，即脂质体制剂包含多种（例如2种、3种或 多于3种）菌株的片断。
[0138] 本发明的药剂还可以另外地包含一种或更多种非离子型表面活性剂（e)。所述非 离子型表面活性剂可以优选地选自烷基酚乙氧基化物、山梨醇酐酯乙氧基化物和更优选的 辛基酚乙氧基化物。该表面活性剂还可以在上述特征2的情况下使用。
[0139] 本发明所述药剂的MTB-C的片断还可以是或者包含细胞壁片断。
[0140] 优选地，脂质体制剂的脂质体形成剂是氢化的、部分氢化的或者未被氢化的磷脂。 所用的磷脂可以是或者包括例如：磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇。最典型的是可 合成或者从多种天然来源分离的磷脂酰胆碱。优选地，脂质体形成剂是或者包括选自蛋卵 磷脂和大豆卵磷脂的卵磷脂。大豆卵磷脂是包含磷脂酰胆碱等的磷脂的复杂混合物并且是 特别优选的。制剂中还可以包含作为脂质体形成剂本身或者额外组分的下述典型脂质：磷 酸二鲸蜡脂（dicetylphosphate，DCP)、二肉豆蘧酰基磷脂酰胆碱（DMPC)、二肉豆蘧酰基 磷脂酰甘油（DMPG)、二油酰基磷脂酰胆碱（DOPc)、二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE)、二油酰 基磷脂酰丝氨酸（DOPS)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱（DPPC)、二棕榈酰基磷脂酰甘油（DPPG)、 磷脂酰胆碱（PC)和/或磷脂酰丝氨酸（PS)，其中各脂质可以是氢化的、部分氢化的或者未 被氢化的。可以使用常规的辅助脂质和本领域技术人员公知的技术（例如那些在专利申请 ES2231037-A1中所述的技术）形成脂质体。
[0141] 进一步优选地，在任意上述实施方式中，（a)来源于结核分枝杆菌复合群（MTB-C) 菌株的片断与（b)脂质体形成剂的比例在0.01 : 1至I: 1之间，优选地在0.06 : 1至 0. 1 : 1之间。
[0142] 在任意上述实施方式的一个更优选的实施方式中，脂质体制剂额外包含：（d)表 面张力活性剂（tensioactiveagent)。通常，可以使用能够改变表面张力值的所有类型的 试剂作为本发明意义上的表面张力活性剂，但属于上述脂质体形成剂的定义下的化合物被 排除在外。多种类型的表面张力活性剂是本领域的技术人员已知的，它们可被用于根据本 发明所述的脂质体制剂中。如技术人员所知，表面张力活性剂通常是具有极性-非极性结 构的化学品。不希望受任何特定理论的束缚，表面张力活性剂通常倾向于定位在微粒的表 面，从而在界面上产生单分子层以降低表面张力值。表面张力活性剂也被称为表面活性剂 或活性表面剂。在含有表面活性剂的脂质体制剂的一个优选实施方式中，表面张力活性剂 选自固醇和其衍生物例如胆固醇和/或胆汁盐或其衍生物（例如胆酸盐/酯）。一些特别 优选的实施方式中，表面张力活性剂选自胆酸盐/酯、脱氧胆酸盐/酯、胆固醇和胆固醇半 琥珀酸酯。实施本发明的一个优良但非限制性的模式中，制剂的脂质体包含来源于大豆的 卵磷脂和胆酸钠二者。
[0143] 在一个甚至更优选的实施方式中，包含（d)表面张力活性剂的脂质体制剂是这样 的脂质体制剂，其中（a)与（d)的比率在0.05 : 1至3 : 5之间（重量/重量）。可以使 用本领域技术人员公知的多种类型的脂质体形成剂。
[0144] 脂质体可任选地含有改善其稳定性的添加剂，例如：维生素E，其被认为起着脂质 抗氧化剂的作用。
[0145] 在一个更优选的实施方式中，上述脂质体制剂是这样的脂质体制剂，其中MTB-C 细胞的片断是或者包含细胞壁片断。
[0146] 可以使用属于MTB-C的任何菌株，优选地使用属于结核分枝杆菌的任何菌株。在 另一个更优选的实施方式中，上述脂质体制剂包含MTB-C菌株NCTC13536的片断，该菌株 于2010年12月3日保藏在位于伦敦的NCTC(实施例1)。可以使用的另一个菌株（因此脂 质体制剂中可以包含其片断）被称为H37Rv，该菌株可从例如位于英国伦敦的国家典型菌 种保藏中心（NCTC)获得（保藏编号：NC007416)，其经常被本领域的研究人员使用。还可以 使用多于一种的菌株，即脂质体制剂包含多种（例如2种、3种或多于3种）菌株的片断。
[0147] 考虑到约有4000种推定的结核分枝杆菌抗原，因此不可能分析所有这些蛋白的 药物。不过，某些MTB-C蛋白已显示出与期望的免疫反应相关。它们是大小约为6kDa、 10kDa、30kDa、38kDa和70kDa的5个蛋白条带（Renshaw，等人，2005，EMB0Journal24(14): 2491-2498 ;Singh，等人，2005,Clin.Diagn.Lab.Immunol. 12 (2)，354-358)。因此，在一个甚 至更优选的实施方式中，上述脂质体制剂包含至少两种，优选三种，更优选四种，最优选所 有下述物质：
[0148] (i)通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为70kDa的 第一多肽，其中该第一多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌HSP70蛋白（Rv0350)的质量指 纹图谱相似，
[0149] (ii)通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为38kDa的 第二多肽，其中该第二多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌38kDa蛋白（Rv0934)的质量 指纹图谱相似，
[0150] (iii)通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为30kDa 的第三多肽，其中该第三多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌Ag85B蛋白（Rv1866c)的质 量指纹图谱相似，和
[0151] (iv)通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为IOkDa的 第四多肽，其中该第四多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌CFPlO蛋白（Rv3874)的质量 指纹图谱相似，和
[0152] (V)通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为6kDa的第 五多肽，其中该第五多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌ESAT-6蛋白（Rv3875)的质量指 纹图谱相似。
[0153] 在其又一更优选的实施方式中，脂质体制剂进一步包含通过十二烷基硫酸钠 (SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为19kDa的脂多肽，其中该脂多肽的质量指纹 图谱与结核分枝杆菌19kDa的脂蛋白抗原前体LpqH(Rv3763)的质量指纹图谱相似。利用 本领域已知的方法例如银染可以使各条带可视化。本发明的研究人员发出乎意料地现：在 接种MTB-C菌株的核分枝杆菌感染的临床前动物模型中，针对这种多肽的总IgG体液应答 在所述制剂的所有抗原中可以是最高的。
[0154] 实施例4中给出了可如何鉴定多肽或脂多肽的非限制性实例。
[0155] 甚至更优选地，上述脂质体制剂进一步具有以下特点：存在下述结核分枝杆菌抗 原或其片断中的至少一种：HSP70、38kDa蛋白和Ag85B;最优选地，存在HSP70、38kDa蛋白 和Ag85B中的至少一种。这种意义上的片断可以是任何这些多肽的任何部分（例如降解产 物）。可以采用获得这种片断的多种方法，例如化学水解或酶促水解，其中片断化是否为特 意产生的、在脂质体形成之前或之后进行并不重要。优选地，各片断可被归属于其各自的来 源,例如通过氨基酸序列（例如至少5个，至少10个，至少20个连续的氨基酸）的基本重 叠。
[0156] 优选地，从在饥饿、低氧和低pH的应激条件下生长的杆菌中获得根据本发明所述 的片断。低氧是由于细菌在生长期（例如21天）在用密封袋密封的平板上汇合生长，从而 导致微需氧的（microaerobiotic)环境。低pH被解释如下：培养开始时的pH值为7. 0-6. 8， 培养结束（通常是培养21天后）时的pH值为6. 4-6. 5。在这些条件下，细菌的代谢较慢， 从而平稳生长（stationarygrowth)。可以理解为这使得杆菌更能抵抗应激。推测在这种 条件下培养的杆菌具有与在LTBI(潜伏结核感染）中体内潜伏的杆菌相似的特征。因此， 预计存在于FCMtb中的抗原将引发针对潜伏杆菌抗原（即所谓的"结构"抗原）的新的免 疫学反应和与应激反应相关的那些。
[0157] 分支杆菌糖脂长期以来就被认为具有免疫调节活性，尤其是诱导肉芽肿反应和发 挥强类佐剂作用。因此，在一个更优选的实施方式中，上述脂质体制剂含有通常发现于结 核分枝杆菌的脂质或其衍生物，例如缀合产物（像缀合糖的脂质）。在结核分枝杆菌样品 中已鉴定出了一些具有免疫原性的脂质组分（Brennan,Tuberculosis(Edinburgh)，2003, 83 (1-3)，91-97)，而且已研发出了测定它们的分析方法（电泳、SDS-PAGE和薄层色谱法）。 分离每种脂质组分需要强力的处理从而很难获得MTB-C提取物或脂质体制剂中可检测到 的每种组分的定量数据或百分比，尽管如此，定性特征将有助于表征本发明的一个进一步 优选的实施方式。根据这个进一步优选的实施方式，一种或更多种霉菌酸，优选地是属于类 型I、III或IV的任何一种或更多种的霉菌酸被包括在内。可选择地或者此外，制剂中可包 含缀合糖的霉菌酯，优选的是海藻糖二霉菌酸酯。可选择地或者此外，制剂中可包含糖脂： 脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)。此外，片断的多抗原属性（多抗原的蛋白混合物加上脂质，而非 单独的纯化的抗原）被认为是一种优势，因此技术人员可调整细胞的片断化方法以得到最 佳的细胞抗原混合物。
[0158] 在一种或更多种表面活性剂（优选的是非离子型表面活性剂）存在时均化MTB-C 细胞。因此，上述脂质体制剂可额外包含一种或更多种这种表面活性剂。本领域技术人员 的标准知识中包括大量这种表面活性剂。优选地，所用的非离子型表面活性剂选自烷基酚 乙氧基化物和山梨醇酐酯乙氧基化物。更优选地，非离子型表面活性剂选自辛基酚乙氧基 化物。甚至更优选地，使用具有7-8摩尔环氧乙烷含量的辛基酚乙氧基化物，在市场上能够 找到名称为TritonX-114?的这种表面活性剂。使含有细胞壁片断的均化物经受常规处 理以分离和丢弃未片断化的细胞及溶解的组分。以不同的速度离心，然后例如可使用专利 申请ES2231037-A1中所述的缓冲液洗涤。进行所述纯化过程后得到含有细胞壁片断的沉 降物。将所述沉降物分散在磷酸盐缓冲盐水（PBS)缓冲液中，然后进行常规处理以确保片 断化和纯化后可能仍然有活性的MTB-C细胞完全失活。上述处理可以是化学方法（例如通 过用甲醛处理的方法）或物理方法（例如通过高压灭菌法或巴氏灭菌法处理的方法）。下 述实施例5中给出了脂质表征的实例。本发明所述的药剂可额外含有一种或更多种盐或者 其溶液，优选地，所述盐是氯化钠。
[0159] 特别的，在药剂满足上述特征2 (即可通过培养MTB-C菌株以及在优选的非离子型 表面活性剂的存在下均化细胞培养物得到）的情况下，可得到其的方法可进一步具有如下 特征：(a)培养MTB-C菌株等于或多于3周的时间，然后（b)在非离子型表面活性剂存在下 均化细胞培养物。在一个优选的实施方式中，可得到其的方法进一步包括下述步骤：
[0160] d.通过离心的方式分离未片断化的细胞和溶解的组分，
[0161] e.使细胞壁片断的级分经受化学处理或物理处理以使其最终所含的最终有毒力 菌株失活，和
[0162] f.通过冷冻干燥干燥所述药剂。
[0163] 可按照EP2090318Al中所述实施该方法。
[0164] 可按照本领域已知的任何方法保藏根据本发明所述的药剂；然而，对于根据本发 明所述的脂质体制剂的情况，优选地通过冻干保藏。
[0165] 在任意上述实施方式的一个甚至更优选的实施方式中，脂质体制剂是冻干的。可 使脂质体经受冷冻干燥以获得冷冻干燥的脂质体形式的免疫治疗剂。为此，可将分散物分 装至小瓶，然后在低温（例如在-15°C至_120°C之间，例如_45°C和真空例如0. 1-0. 5mbar 下冷冻干燥。冷冻干燥后得到的小瓶中含有适合作为免疫治疗剂的脂质体制剂，优选地在 极低的温度（例如_70°C)下存储它们。
[0166] 本发明还提供悬液，其中任意在前权利要求中的脂质体制剂在溶剂中重构。在一 个优选的实施方式中，这种悬液的溶剂是水溶液，更优选地和最优选地，其是或者包含生理 血清。使脂质体制剂悬浮在溶剂中的方法是本领域技术人员公知的。根据本发明的制剂的 特别有利的性能在于：相较于包含MTB-C片断的常规脂质体制剂，该制剂可以被更快地悬 浮（参加实施例9)。
[0167] 本发明进一步的目的是提供用于预防或治疗人或动物的变态反应的包含本发明 药剂的药物组合物，其中所述药剂是或者包含在以上任意所述实施方式或其组合中所述的 药剂。药物的药物制剂/盖仑制剂（galenicformulation)的主要范围是为了获得这样的 悬液，其足够有效和稳定以被细胞充分识别并且具有在人或动物体内引发相关的细胞免疫 反应的能力。为此，本发明还提供包含脂质体制剂或在任意一个或更多个上述实施方式中 所述的悬液以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。多种这些载体、赋形 剂和稀释剂是本领域的技术人员已知的且不以任何方式局限于本公开。而是可以使用适合 作为载体、赋形剂或稀释剂的任何物质。在一个优选的实施方式中，这种药物组合物额外包 含药学上可接受的佐剂。因此，佐剂可被理解为本发明的这个实施方式中包含的一种物质， 其中佐剂是这样的物质，当其被应用于人体或动物体时，能够响应靶抗原刺激免疫系统，而 佐剂自身不赋予免疫性。不希望受任何特定的佐剂物质的束缚，优选的实施方式中的佐剂 是铝盐（例如氯化铝）或矿物油或包含矿物油的组合物（例如不完全弗氏佐剂（IFA)或 完全弗氏佐剂（CFA))或者卤化铵（例如烷基化的溴化铵（例如二甲基双十八烷基-溴化 铵））。
[0168] 用于本发明治疗的一种具体的本发明药剂由ARCHIVELFARMA(西班牙）开发，其 被称为制剂A(FormulationA)。在"实施发明的优选方式"部分描述了其制备。
[0169] 如在以下实施例中所详述，发明人在具有变态反应诱导的哮喘的小鼠模型中获得 的结果支持这些申请。简而言之，通过腹腔内注射卵清蛋白（OVA)使小鼠对OVA敏化，然后 将小鼠局部暴露于雾化的抗原（i.η.)。将敏化的小鼠分成两组：未被处理的组以及用检测 疫苗BCG(正对照）或载剂处理的组，所有均为皮下施用（s.c.)。发明人还在未敏化的小鼠 中建立了上述处理的对照组。在暴露于OVA的动物（但未被处理）中，响应乙酰甲胆碱的支 气管反应性增加且出现支气管周嗜曙红细胞，这表明高效诱导了变应性过程。接种BCG使 炎症的水平（不显著）和支气管的过度反应性（没有回复到基线水平）降低了几乎一半。 作为预防措施施用制剂A疫苗极大地降低了肺部嗜曙红细胞增多，并且使支气管的过度反 应性水平几乎回复到基线。使用制剂A疫苗作为治疗剂显著减少了支气管炎症，同时观察 到响应OVA抗原的支气管过度响应性有降低的趋势。基于这些结果，发明人得出如下结论： 当在激发阶段前施用3次制剂A疫苗时，其对被OVA激发的小鼠的气道产生明显有益的效 果；然而，治疗性施用明显降低了炎症且对支气管的过度响应性有缓和（mild)影响。
[0170] 在一个具体的实施方式中，可以用本发明所述的药剂（脂质体制剂）治疗的变态 反应为由IgE介导的。IgE是由B细胞分泌的与变态反应有关的免疫球蛋白，通常由Th2细 胞因子诱导B细胞转变成IgE产生的。因此，在本发明的一方面，期望不增加朝向IgE的同 种型转换和/或不触发Th2反应。
[0171] 所述反应可以是特应性。变态反应可以是呼吸功能障碍和/或支气管炎症。优选 地，所述反应选自哮喘、花粉热、鼻炎和湿疹。不希望受任何特定理论的束缚，目前认为哮 喘、花粉热、鼻炎和湿疹可涉及引起变应性反应。然而，本发明涉及本文中所述的药剂和药 物组合物用于预防或治疗哮喘、花粉热和湿疹中的任意一种或更多种的所有用途，而不考 虑在具体个体中变态反应是否为哮喘、花粉热、鼻炎和湿疹的基础的问题。但在一个实施方 式中，优选地，哮喘是变应性哮喘。在一个具体的实施方式中，哮喘是支气管哮喘。本发明 的药剂还被用于治疗或预防多重变态反应（multipleallergies)。多重变态反应是这样的 病症，其中多种变态反应（例如哮喘、湿疹和变应性鼻炎中的两种或更多种）同时发生。鼻 炎是鼻内部黏膜的刺激/炎症。鼻炎的症状是鼻塞、流鼻涕和后鼻滴（post-nasaldrip)。 最常见的鼻炎类型是变应性鼻炎，它可引起额外的症状，例如打喷嚏、鼻痒、咳嗽和疲劳。
[0172] 施用途径本身没有特别的限制，除非药剂或组合物的特征要求如此。可以在黏膜 (例如眼睛黏膜、鼻内黏膜、口腔黏膜、胃黏膜、肠黏膜、阴道黏膜或泌尿道黏膜）或者肠胃 夕卜（例如皮下地、皮内地、经皮地、肌内地、静脉内地或腹腔内地）或者通过吸入施用所述药 物。在一些实施方式中，肠胃外施用可以是优选的。在一个具体的实施方式中，本发明提供 用于注射的这种脂质体制剂、悬液或药物组合物。优选地，提供用于注射（优选的是皮下注 射或肌内注射）、舌下施用或吸入施用的药剂或组合物。
[0173] 在涉及通过疗法治疗人体的方法中使用根据上文所述的脂质体制剂、悬液或药物 组合物时，其合适剂量取决几个参数，包括施用方法和待治疗的对象。在一个优选的实施 方式中，其用于对人体施用。在一个其优选的实施方式中，以包括1-1000,优选3-250的 剂量进行施用。在一个具体的实施方式中，本发明所述的药剂或药物组合物的每剂量施用 200μg或更少，优选每剂量约5-50μgFCMtb，例如最优选每剂量25μgFCMtb。
[0174] 在一个具体的实施方式中，本发明所述的药剂或药物组合物被用于预防变态反 应。预防医学或预防护理指的是所采取的用于预防疾病，而非治愈疾病或治疗疾病的症状 的措施。预防护理可包括根据个体的年龄、健康状况和家族史定制的检查和筛选试验。可 施用预防性治疗。预防是目的为预防疾病，而非治疗或治愈疾病的任何过程。预防措施可 被细分为初级预防（以避免疾病发生）和次级预防（其中疾病已经发生，使患者免受该过 程的恶化）。有时，预防被细分为普遍性预防、选择性预防和指向性预防。普遍性预防涉及 整个群体（国家、本地社区、学校、地区），其目的是预防病症。普遍性预防的目的是使所有 的个体都接受治疗。选择性预防涉及出现变态反应（像变应性哮喘）的风险高于平均水平 的群组。可以通过性状例如年龄（例如儿童）或家族史辨别所述群组。指向性预防涉及筛 选过程，其目的是鉴定显示变态反应的早期征兆的个体。本发明包括所有类型的预防/治 疗，尽管其中的一些实施方式中可以选择子集。
[0175] 在一个具体的替代性实施方式中，本发明所述的药剂或药物组合物被用于治疗变 态反应。治疗或治愈性护理通常指对显示出变态反应症状的个体的治疗。因此，治愈性护 理不同于旨在预防病症出现的预防性护理和重点在于降低疾病症状（例如疼痛）的严重程 度的姑息护理。
[0176] 发明人已提供了预防药剂对治疗目的和预防目的都具有高效力的证据（参加实 施例）。
[0177] 可以施用一次或几次根据本发明所述的药剂，在预防的情况下，优选施用至少两 次，优选地多于两次。可提供本发明药剂或药物组合物用于重复施用，优选地以一周或者更 久为间隔，更优选地以两周或者四周为间隔。
[0178] 在一个具体的实施方式中，本发明所述的药剂或药物组合物是用于施用给患有或 倾向于发生各变态反应（包括哮喘）的个体和/或用于具有各倾向性（predisposition)或 被怀疑具有各倾向性的个体。被怀疑具有各倾向性的个体可以是例如来自己知患变态反应 的家族（例如来自父母之一或父母双方，或者来自（年长的）兄弟姐妹）的家庭成员，尤其 是儿童。倾向于患变态反应的任何家庭的目标都是预防他们的孩子出现变态反应。为此， 可以施用本发明的药剂作为预防性措施。
[0179] 本公开进一步提供于2010年12月3日保藏在伦敦的NCTC的MTB-C菌株NCTC 13536。该菌株具有低遗传多态性。因为遗传多态性低，所以包含NCTC13536片断的药剂 具有重复性极高的优势。
[0180] 实施发明的优诜樽型
[0181] 在一个具体的实施方式中，优选地，本文所述的制剂A是根据本发明施用的具体 药剂。制剂A被表征如下。当剂量为50μgFCMtb时，表1中给出了存在于一小瓶（vial) 制剂中的量/物质：
[0182]
【权利要求】
1. 用于预防或治疗人或动物的变态反应的药剂，其包含有毒力的结核分枝杆菌复合群 (MTB-C)菌株的片断。
2. 用于预防或治疗人或动物的变态反应的药剂，其包含结核分枝杆菌复合群（MTB-C) 菌株的片断， 其中所述药剂能够通过包括以下步骤的方法获得： a. 培养MTB-C菌株等于或大于3周的时间，然后， b. 在非离子型表面活性剂的存在下均化细胞培养物。
3. 用于预防或治疗人或动物的变态反应的药剂，其为脂质体制剂，其包含： (a) 来源于结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株的片断， (b) 脂质体形成剂， (c) 1-20 %的蔗糖，优选2-12 (重量/体积）％的蔗糖，更优选3-8 (重量/体积）％的 蔗糖，以及最优选4-6 (重量/体积）％的蔗糖。
4. 用于预防或治疗人或动物的变态反应的药剂，其为脂质体制剂，其包含： (a) 来源于结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株的片断（FCMtb)， (b) 脂质体形成剂，以及 其中微粒的z-平均粒径为150nm或更小。
5. 用于根据权利要求1或2所述的用途的根据权利要求1或2所述的药剂，其中药剂 是脂质体的形式。
6. 用于权利要求3或5所述的用途的根据权利要求3或5所述的药剂，其中脂质体微 粒的z-平均粒径为150nm或更小。
7. 用于权利要求5或6所述的用途的根据权利要求5或6所述的药剂，其中微粒的 z-平均粒径为40-135nm，更优选55-125nm。
8. 用于权利要求5或6所述的用途的根据权利要求5或6所述的药剂，其中所述脂质 体制剂是乳剂，而且其中微粒的z-平均粒径优选地小于40nm。
9. 用于根据权利要求3-8中任一项所述的用途的根据权利要求3-8中任一项所述的药 齐U，其中所述微粒的多分散指数是〇. 4或更小，优选0. 3或更小。
10. 用于权利要求2-9中任一项所述的用途的根据权利要求2-9中任一项所述的药剂， 其中所述结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株是有毒力的结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌 株。
11. 用于根据前述任一项权利要求所述的用途的根据前述任一项权利要求所述的药 齐U，其中所述结核分枝杆菌复合群（MTB-C)菌株是于2010年保藏在伦敦NCTC的MTB-C菌 株 NCTC 13536。
12. 用于根据前述任一项权利要求所述的用途的根据前述任一项权利要求所述的药 齐U，其额外地包含 (d) 表面张力活性剂。
13. 用于根据权利要求1或3-12中任一项所述的用途的根据权利要求1或3-12中任 一项所述的药剂，其额外地包含 (d) -种或更多种非离子型表面活性剂， 并且其中所述非离子型表面活性剂优选地选自烷基酚乙氧基化物、山梨醇酐酯乙氧基 化物，更优选地为辛基酚乙氧基化物。
14. 用于根据前述任一项权利要求所述的用途的根据前述任一项权利要求所述的药 齐U，其中所述MTB-C细胞的片断是或包含细胞壁片断。
15. 用于根据权利要求3-14中任一项所述的用途的根据权利要求3-14中任一项所述 的药剂，其中所述脂质体形成剂是氢化的、部分氢化的或未氢化的磷脂，优选卵磷脂，最优 选大豆卵磷脂。
16. 用于根据权利要求12-15中任一项所述的用途的根据权利要求12-15中任一项所 述的药剂，其中所述表面张力活性剂选自胆酸盐/酯、脱氧胆酸盐/酯、胆固醇和胆固醇半 琥珀酸酯。
17. 用于根据前述任一项权利要求所述的用途的根据前述任一项权利要求所述的药 齐U，其包含至少两种，优选三种，更优选四种，最优选所有的下述物质： (i) 通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为70kDa的第一 多肽，其中所述第一多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌HSP70蛋白（Rv 0350)的质量指 纹图谱相似， (ii) 通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为38kDa的第二 多肽，其中所述第二多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌38kDa蛋白（Rv 0934)的质量指 纹图谱相似， (iii) 通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为30kDa的第 三多肽，其中所述第三多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌Ag85B蛋白（Rv 1866c)的质量 指纹图谱相似， (iv) 通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为10kDa的第四 多肽，其中所述第四多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌CFP10蛋白（Rv 3874)的质量指 纹图谱相似，和 (v) 通过十二烷基硫酸钠（SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳测量的分子量约为6kDa的第五多 肽，其中所述第五多肽的质量指纹图谱与结核分枝杆菌ESAT-6蛋白（Rv 3875)的质量指纹 图谱相似。
18. 用于根据前述任一项权利要求所述的用途的根据前述任一项权利要求所述的药 齐U，其中存在下列结核分枝杆菌抗原或其片段中的至少一种：HSP70、38kDa蛋白和Ag85B。
19. 用于根据前述任一项权利要求所述的用途的根据前述任一项权利要求所述的药 齐IJ，其包含一种或更多种霉菌酸和/或缀合糖的霉菌酸酯，优选海藻糖二霉菌酸酯和/或糖 月旨，优选脂阿拉伯甘露聚糖。
20. 用于根据前述任一项权利要求所述的用途的根据前述任一项权利要求所述的药 齐IJ，其额外地包含一种或更多种盐或其溶液，其中所述盐优选地是氯化钠。
21. 用于根据权利要求2或5-20中任一项所述的用途的根据权利要求2或5-20中任 一项所述的药剂，其特征在于能够获得所述药剂的方法进一步包括下述步骤： c. 通过离心的方式分离未片断化的细胞和溶解的组分， d. 使细胞壁片断的级分经受化学处理或物理处理以使其最终所含的最终有毒力的菌 株细胞失活，和 e. 通过冷冻干燥干燥所述药剂。
22. 用于根据权利要求3-21中任一项所述的用途的根据权利要求3-21中任一项所述 的药剂，其中所述脂质体制剂是冻干的。
23. 用于预防或治疗人或动物的变态反应的药物组合物，其包含前述权利要求中任一 项所述的药剂和药物学上可接受的载体。
24. 用于根据前述权利要求中任一项所述的用途的根据前述权利要求中任一项所述的 药剂或药物组合物，其中所述变态反应是由IgE介导的。
25. 用于根据前述权利要求中任一项所述的用途的根据前述权利要求中任一项所述的 药剂或药物组合物，其中所述反应是特应性。
26. 用于根据前述权利要求中任一项所述的用途的根据前述权利要求中任一项所述的 药剂或药物组合物，其中所述变态反应是呼吸功能障碍和/或支气管炎症。
27. 用于根据前述权利要求中任一项所述的用途的根据前述权利要求中任一项所述的 药剂或药物组合物，其中所述反应选自哮喘、花粉热、鼻炎和湿疫。
28. 用于根据前述权利要求中任一项所述的用途的根据前述权利要求中任一项所述的 药剂或药物组合物，其中所述反应是哮喘，优选变应性哮喘。
29. 用于权利要求27所述的用途的根据权利要求27所述的药剂或药物组合物，其中所 述哮喘是支气管哮喘。
30. 用于根据前述权利要求中任一项所述的用途的根据前述权利要求中任一项所述的 药剂或药物组合物，其用于注射，优选皮下注射或肌内注射，或者用于舌下施用，或者用于 通过吸入施用。
31. 根据前述权利要求中任一项所述的药剂或药物组合物，其每剂量施用200 yg或更 少，优选每剂量施用约25 y g。
32. 根据前述权利要求中任一项所述的药剂或药物组合物，其用于预防前述权利要求 中任一项所述的反应。
33. 用于根据权利要求31所述的用途的根据权利要求31所述的药剂，其中施用所述药 剂至少2次，优选多于2次。
34. 根据前述权利要求中任一项所述的药剂或药物组合物，其用于治疗前述权利要求 中任一项所述的反应。
35. 根据前述权利要求中任一项所述的药剂或药物组合物，其用于重复施用，优选以一 周或更长时间为间隔，更优选以两周或四周为间隔。
【文档编号】A61K39/04GK104411326SQ201280071390
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2012年1月12日 优先权日:2012年1月12日
【发明者】佩·雷琼·卡尔多纳·伊格莱西亚斯, 伊莎贝尔·艾玛特·里拉, 布兰卡·雷耶斯·莫雷诺, 玛利亚·梅尔斯·艾玛特·法布瑞喀特 申请人:阿尔西维尔法尔玛公司