生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及能够随意调节骨再生相关生长因子的传递速度，尤其能够应用于牙科用或整形外科用骨填充材料的骨组织再生用生长因子的传递体。在本发明中，用于调节生长因子的传递速度的传递体由形成相互连接的气孔分布的透明质酸水凝胶和分布于上述透明质酸水凝胶的气孔之间的磷酸钙微球形成。具有符合生长因子的传递的气孔度的磷酸钙微球进入并位于交联的透明质酸水凝胶的空隙，由此形成传递体。
【专利说明】生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体及其制备方法，更详细的涉 及，起到能够随意调节骨再生相关生长因子的传递速度，尤其能够应用于牙科用或整形外 科用骨填充材料的骨组织再生用生长因子的传递体的作用的透明质酸-磷酸钙复合体及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 至今，已通过多篇专利以及非专利文献提出了针对用于传递生长因子的传递体的 很多研究结果。
[0003] 例如，韩国特许申请第10-2008-0100315号公开多孔性磷酸三钙类颗粒的制备方 法及利用该多孔性磷酸三钙类颗粒的制备方法的功能性骨移植材料的制备方法。
[0004] 但是，该技术中，由于利用单纯吸附方式来负载（loading)生长因子，因此不存在 将骨形成蛋白捆扎在支撑体的物质，从而骨形成蛋白在短时间内释放（速放），难以实现 缓释传递，而在组织再生过程中，与正常情况相比，引起组织过度生长等的副作用的概率高 [Yeh，T. T.，S. S. Wu，et al.，Osteoarthritis Cartilage 15 (12) : 1357-1366. 2007]。并且， 该技术采用吸附蛋白来进行冷冻干燥的方法，这种方法会使骨形成蛋白的结构变形的可能 性较高，且还具有在骨形成蛋白吸附于骨移植材料的状态下难以进行灭菌的缺点。
[0005] 由于生长因子的传递体为注入于人体的制材，因此适用作为在医疗设备的制造 过程中已验证的灭菌方法的Y射线灭菌、电子束灭菌、高压蒸汽灭菌、环氧乙烷（E.0， Ethylene Oxide)气体灭菌，但是这种灭菌方法伴随热和放射线的照射，因此对蛋白质的结 构有影响。因此，经过灭菌过程的骨形成蛋白难以充分发挥本来的效果，而且被认知为在人 体内变性的蛋白质，从而引起副作用的可能性也高[Chen，J. B. et. al. J Biomed Mater Res A, 80(2) :435-443. 2007] 〇
[0006] 另一方面，国际申请第PCT/EP2008/005340号公开了关于包括多孔性框型陶瓷支 撑体和配置于上述支撑体的内部的稳定化聚合物的可粉碎的复合骨复原物质的技术。
[0007] 上述陶瓷支撑体形成可包含生理活性物质的骨复原物质，上述骨复原物质浸渍 于包含甲状旁腺激素 （Parathyroid hormone，PTH)、骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP)以及釉基质衍生物（E namel matrix derivative，EMD)等的生理活性物质的 聚乙二醇硫醇（P olyethylene glycol thiol, PEG-thiol)的水溶液和多叉分支聚乙二醇 丙烯酸酯（polyarm-Polyethylene glycol acrylate，polyarm PEG-acrylate)的聚合物混 合物。但是，在该方法中所使用的高分子聚乙二醇硫醇的水溶液和多叉分支聚乙二醇丙烯 酸酯没有用于将生理活性物质捆扎于支撑体的部分，因此，如上所述，不能进行缓释。参照 该文献提出的甲状旁腺激素释放试验，示出不到5. 8日就结束生长因子的释放。将这种释 放档案适用于作为骨形成生长因子蛋白的骨形成蛋白的情况下，引起过快的释放（速放）， 从而对骨形成和骨再生会引起在不是骨组织的位置生成骨，或在损伤骨组织中再生慢等的 副作用。
[0008] 并且，国际申请第PCT/IB2009/005235号公开了包含生长因子/两亲性聚合体复 合体、可溶性阳离子盐以及有机支撑体的骨形成组合物，该组合物混合骨形成生长因子/ 两亲性阴离子多糖复合体和一个以上的2价以上的阳离子的可溶性盐，来得到冷冻干燥物 形态的开放移植物。该文献公开为了提高生长因子的效果，而使用透明质酸，但是未公开对 于生长因子的传递速度的调节方法的任何方案。
[0009] 并且，韩国特许申请第10-2008-0038777号公开了如下的透明质酸骨填充复合体 及其制备方法，上述透明质酸骨填充复合体将磷酸钙类衍生物添加到包含透明质酸的基 质，并借助透明质酸的骨诱导（osteoc onductive)作用，来诱导骨再生。
[0010] 但是，该文献中所公开的技术涉及用于填充骨缺损部分的骨填充材料本 身，未公开用于促进骨形成的生长因子传递体的任何技术。进而，用作由羟磷灰石 (hydroxyapatite)和β-磷酸三I丐（β-TCP)形成的骨再生衍生物的磷酸I丐化合物借助化 学沉淀反应而制备，因此不能随意调节气孔度，将该磷酸钙化合物使用为生长因子的传递 体的情况下，不能调节气孔度，且这些气孔不是相互连接（interconnectivity)的，因此， 不能在内部负载生长因子，且不能随意调节生长因子的释放速度，而且存在速放的忧虑，从 而不适合用作生长因子的传递体。
[0011] 即，由于骨组织再生用生长因子传递体应注入于人体内，因此应能够灭菌，且诱发 毒性的可能性低。并且，应能够生物降解，随意调节生长因子的传递速度，来以符合骨缺损 的大小或程度来适用，应能够减少在生长因子快速释放的情况下会发生的副作用。最重要 的是，生长因子应根据损伤组织的再生速度释放，且限定损伤组织的部位释放，由此能够发 生有效的再生。但是，如上所述的现有技术未提出对于具有这种特征的骨组织再生用生长 因子传递体的解决方案，因此，仍然需要对此的研究。
【发明内容】
[0012] 技术问题
[0013] 本发明为在这种背景下提出的，本发明的目的在于提供如下的传递体及其制备方 法，上述传递体尤其在牙科或整形外科领域，例如，以能够调节释放速度的状态负载骨组织 再生用生长因子，上述骨组织再生用生长因子助于因牙周骨损失部分、种植牙周边骨、骨质 疏松症、外科手术或外伤性骨损伤等而发生的骨的再生。
[0014] 解决问题的手段
[0015] 为了达成上述目的，本发明提供生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体，上述 生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体包含：透明质酸水凝胶，形成相互连接的气孔分 布，并借助交联剂来交联；以及磷酸钙微球，分布于上述透明质酸水凝胶的上述气孔的内 部，上述磷酸I丐微球的大小为45 μ m?75 μ m。
[0016] 并且，本发明提供生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体的制备方法，包括：在 1050°C?1250°C温度下，对磷酸钙粉末进行烧结，来得到大小为45 μ m?75 μ m范围的球形 的磷酸钙微球的步骤；以及混合由交联剂交联的透明质酸水凝胶和上述磷酸钙微球，来得 到生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体的步骤。
[0017] 发明的效果
[0018] 根据本发明，由于使用存在于天然状态的骨组织的钙和磷酸以及存在于天然状态 的细胞外基质的透明质酸来制备透明质酸-磷酸钙复合体，因而适合骨再生相关生长因子 的传递，从而具有促进骨再生的有用的优点。
[0019] 并且，还具有如下的优点，以能够注入于病变部位，且能够根据适用部位的伤痕的 程度来通过不同的释放速度，传递生长因子，从而能够有效诱导周边骨再生及增强。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为根据生长因子的等电点和周边环境的pH的生长因子的总电荷（net charge)的说明图。
[0021] 图2为根据β -磷酸三钙微球的烧结温度的扫描显微镜图像。
[0022] 图3为根据本发明利用透明质酸水凝胶和磷酸钙微球的，能够调节生长因子的传 递速度的传递体的说明图。
[0023] 图4为根据本发明利用能够调节生长因子的传递速度的传递体的骨再生相关生 长因子的释放结果。
[0024] 图5为根据交联度而表示不同的气孔大小的透明质酸水凝胶的扫描显微镜图像 (A :20%交联度，B :10%交联度）。
【具体实施方式】
[0025] 以下，对本发明进行更详细的说明。
[0026] 在本发明中，提供能够调节生长因子传递速度的传递体，该传递体由形成相互连 接的气孔分布的透明质酸水凝胶以及分布于这种透明质酸水凝胶的气孔之间的磷酸钙微 球形成。气孔度相互不同的磷酸钙微球进入并位于交联程度相互不同的透明质酸水凝胶的 空隙，从而形成传递体。
[0027] 在本发明中，调节生长因子的传递速度的原理之第一为生长因子和传递体间的电 引力（attraction)。与骨再生相关的骨形成生长因子的等电点（iso-electric point)大 约为8?10,在生物体内的环境的pH为7左右的环境下带阳电（参照图I) [T. Boix et.al. Journal of Inorgan ic Biochemistry 99(2005)，Atsushi Iwakura et. al. J Thorac Cardi ovasc Surg 126:(2003), Jeroen J. J.P et. al. Tissue Engineering, V olume 13, Number 4,（2007)]。
[0028] 考虑此现象，在本发明中，作为用于传递骨再生相关生长因子的传递体的组成物 质选择了在生物体pH中带阴电荷的透明质酸和磷酸钙。在透明质酸存在羟基（-0H)或羧 基（-C00H)之类的带很多阴电的官能团，借助磷酸钙的磷酸基（-P0 4)，表面电荷也带阴电。 借助电结合，在这种具有阴电荷的传递体的官能团负载骨再生生长因子，并根据透明质酸 水凝胶和磷酸钙微球的结构，来能够调节生长因子从传递体释放的速度。
[0029] 并且，在本发明中，调节生长因子的传递速度的第二原理与生长因子传递体的气 孔度相关。用于传递生长因子的传递体由分布有相互连接的气孔的磷酸钙微球以及具有所 需的气孔度的透明质酸水凝胶形成。若磷酸钙微球的气孔度大，则生长因子以又深又宽的 方式位于微球的中央部分和气孔之间，从而慢慢释放。并且，随着透明质酸水凝胶的交联度 的增加，水凝胶的气孔度减低，且强度变大，分解速度变小，因此，位于透明质酸水凝胶之间 的磷酸钙微球的露出速度减少，由此与传递体相结合的生长因子慢慢释放。
[0030] 在本发明中，交联度（degree of cross-linking)意味着个别透明质酸聚合体分 子或单体链相连接的永久结构。进而，为了本发明的目的，交联度定义为基于透明质酸的组 合物的交联的部分内的对于透明质酸单体单位的交联剂的％重量比。用对于交联剂的透明 质酸单体的重量比（透明质酸单体：交联剂）来测定该％重量比。
[0031] 本发明中所使用的透明质酸没有特别的限制，通常可以使用天然物质，优选地 使用来源于脊椎动物或微生物的天然物质。通常，生产透明质酸的分子量为600000至 7000000的透明质酸，本发明中所使用的透明质酸考虑粘度和分解度等来使用分子量为 1000000至5000000范围的透明质酸。
[0032] 透明质酸可以从组织提取或进行生物合成，已公知与此相关的很多现有文件（韩 国特许登录第1993-0001320号（1993年02月25日）、以及韩国特许登录第1987-0001815 号（1987年10月13日））。例如，从组织提取的情况下，可以从鸡冠、关节的滑液、人的 脐带组织、牛的支气管提取，从微生物得到的情况下，可以培养属于非溶血性链球菌属 (Streptococcus)的微生物来得到。
[0033] 形成本发明的生长因子传递体的透明质酸水凝胶进行交联。调节交联的程度来 调节水凝胶内的气孔率和气孔大小，来使水凝胶的结构变化，由此调节水凝胶内的生长因 子维持比率和亲和度，并控制水凝胶的分解速度，从而调节因大量侵蚀的生长因子的释放 速度。透明质酸水凝胶可以借助聚氧乙烯双缩水甘油醚（Polyoxyethylene bis(glyci dyl ether))、1，2, 3, 4-二环氧丁烧（1，2, 3, 4-Diepoxybutane)、1，2, 7, 8-二环氧辛烧 (1，2,7, 8-Diepoxyoctane)、二乙二醇二缩水甘油醚（Diethylene glycol diglycidyl ether)、1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚（1,4-Butanediol di glycidyl ether)等来进行交联， 优选地，利用聚氧乙烯双缩水甘油醚（P olyoxyethylene bis(glycidyl ether))或1,4-丁 二醇二缩水甘油醚（1,4-Butanediol diglycidyl ether)。
[0034] 在本发明中，优选起到生长因子传递体的作用的透明质酸水凝胶的交联度范围为 40%以下。这是为了使透明质酸水凝胶的分解速度对准通常的骨初期再生期间。通常，骨初 期再生期间为2个月左右。为了对准这种骨再生速度，优选地，在两个月左右支撑体分解， 且如果三个月以上支撑体不分解，则反而会妨碍骨再生以及新生骨形成，因此，需要具有适 当的分解速度的传递体。
[0035] 本发明的传递体另一组成成分为磷酸钙。在本发明中，为了调节生长因子的传递 速度，使用具有气孔的微球形态的磷酸钙。在制备过程中，随意调节磷酸钙微球的气孔度， 由此能够调节负载于微球的生长因子的亲和度。在本发明中，利用这种原理来调节生长因 子的传递速度。磷酸钙微球的气孔度能够通过调节烧结温度的过程来得到控制，优选地，在 1050°C?1250°C的温度范围进行烧结。
[0036] 并且，在本发明中，为了有效执行生长因子的传递作用，需要调节磷酸钙微球的直 径，尤其，在免疫初期反应中，防止基于巨噬细胞的吞噬作用（Phagocytosis)，来防止短期 间内分解，且起到生长因子的传递作用，而将磷酸钙微球的最小直径限定为45um，考虑人体 的松质骨的气孔的大小根据人体的部位而不同，但直径大致为100?300um，从而将磷酸钙 微球的最大直径限定为75 μ m。
[0037] 憐酸 I丐微球可以由憐酸一I丐（Monocalcium phosphate，Ca (H2PO4) 2)、憐酸二 ?丐(Dicalcium phosphate, CaHPO4)、憐酸二氢?丐(Ca lcium dihydrogen phosphate, Ca(H2PO4)2)、憐酸三?丐（Tricalcium phosphate, Ca3(PO4)2)、憐酸十?丐（Octacalcium phosphate, Ca8H2(PO4)6 · 5H20)等制备，在本发明中制备的磷酸I丐微球优选使用β型磷酸 三隹丐（β-tricalcium phosphate, β-TCP, Ca3 (PO4)2)作为移植于生物体的生长因子的传递 体，上述β型磷酸三钙具有能够生物分解，且被骨吸收细胞（osteoclast)吸收，以骨组成 成分吸收而能够有用地使用为骨再生的优点。
[0038] 并且，作为与骨再生相关的生长因子的通常的例有转化生长因子群 (Transforming growth factor family, TGF family)、上皮细胞生长因子（Epidermal growth factor，EGF)、成纤维细胞生长因子（Fibrob last growth factor，FGF)、血管内皮 细胞生长因子（Vascular endothel ial growth factor，VEGF)等。其中，转化生长因子 群（TGF family)中，作为骨再生的重要因素的骨形成蛋白（Bone morphogenetic protein, BMP)系列，具体地，可以列举骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-3、骨形成蛋白-3b、骨形成蛋 白-4、骨形成蛋白-5、骨形成蛋白-6、骨形成蛋白-7、骨形成蛋白-8、骨形成蛋白-9、骨形 成蛋白-10、骨形成蛋白-11、骨形成蛋白-12、骨形成蛋白-13、骨形成蛋白-14、骨形成蛋 白-15、骨形成蛋白-16、骨形成蛋白-17、骨形成蛋白-18等。
[0039] 图1为根据生长因子的等电点和周边环境的pH的生长因子的总电荷（net charge)的说明图。如图1所示，由于与等电点（iso-electric point)为8?10的骨再生 相关的生长因子在PH为7左右的生物体内带阳电，因此，借助电结合而负载于带透明质酸 的羟基（-0H)和羧基（-C00H)、磷酸钙的磷酸基（-P04)等的阴性电荷的传递体的官能团，并 根据透明质酸水凝胶和磷酸钙微球的结构来在传递体控制生长因子的释放速度。
[0040] 作为本发明的调节生长因子的传递速度的传递体的组成成分的透明质酸水 凝胶具有相互连接的气孔分布，例如，将IOOOOOODa以上的高分子量的透明质酸溶解 于pH为7. 0左右的蒸馏水，使其成为1重量百分比至20重量百分比后，添加聚氧乙 烯双缩水甘油醚（Polyoxyethy Iene bis (glycidyl ether))、1,2, 3,4-二环氧丁烧 (1，2, 3, 4-Diepoxybutane)、1，2, 7, 8-二环氧辛烧（1，2, 7, 8-Diepoxyoctane)、二乙二醇 二缩水甘油醚（D iethylene glycol diglycidyl ether)或 1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚 (1，4-Bu tanediol diglycidyl ether)之类的交联剂1重量百分比至40重量百分比，来充 分进行反应，由此得到具有1%至40%范围的交联度的透明质酸水凝胶。
[0041] 由于交联度不同的透明质酸水凝胶具有不同的气孔率，且根据其物性，分解速度 不同，因此，所结合的生长因子的释放速度表现为不同。如示出根据交联度的透明质酸水凝 胶的分解速度（degradation rate)的表1所示，可以确认到根据交联度，透明质酸水凝胶 的分解速度显著不同。
[0042] 表 1
[0043] 根据本发明来调节交联度的透明质酸水凝胶在透明质酸分解酶IOOunits的条件 下的分解度
[0044]
【权利要求】
1. 一种生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体，其特征在于，包含： 透明质酸水凝胶，形成相互连接的气孔分布，并借助交联剂来交联；以及 磷酸钙微球，分布于上述透明质酸水凝胶的上述气孔的内部，上述磷酸钙微球的大小 3 45 y m ~ 75 y m。
2. 根据权利要求1所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体，其特征在于，上述 透明质酸的分子量在1000000至5000000的范围。
3. 根据权利要求1所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体，其特征在于，上述 透明质酸的交联度为40%以下。
4. 根据权利要求1所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体，其特征在于，上述 透明质酸的交联剂选自聚氧乙烯双缩水甘油醚、1，2, 3, 4-二环氧丁烷、1，2, 7, 8-二环氧辛 烷、二乙二醇二缩水甘油醚、1，4-丁二醇二缩水甘油醚中。
5. 根据权利要求1所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体，其特征在于，形成 上述磷酸钙微球的磷酸钙选自磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸二氢钙、磷酸三钙、磷酸十钙中。
6. 根据权利要求1所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体，其特征在于，上述 生长因子为选自上皮细胞生长因子、肝素结合性表皮生长因子样生长因子、成纤维细胞生 长因子、血管内皮细胞生长因子、骨形成蛋白系列中的骨形成蛋白-2、骨形成蛋白-3、骨形 成蛋白-3b、骨形成蛋白-4、骨形成蛋白-5、骨形成蛋白-6、骨形成蛋白-7、骨形成蛋白-8、 骨形成蛋白-9、骨形成蛋白-10、骨形成蛋白-11、骨形成蛋白-12、骨形成蛋白-13、骨形成 蛋白-14、骨形成蛋白-15、骨形成蛋白-16、骨形成蛋白-17、骨形成蛋白-18的至少一种。
7. -种生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体的制备方法，其特征在于，包括： 在1050°C?1250°C温度下，对磷酸钙粉末进行烧结，来得到大小为45iim?75iim范 围的球形的磷酸钙微球的步骤；以及 混合利用交联剂交联的透明质酸水凝胶和上述磷酸钙微球，来得到生长因子负载用透 明质酸-磷酸钙复合体的步骤。
8. 根据权利要求7所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体的制备方法，其特 征在于，上述透明质酸的分子量在1000000至5000000的范围。
9. 根据权利要求7所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体的制备方法，其特 征在于，上述透明质酸的交联度为40%以下。
10. 根据权利要求7所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体的制备方法， 其特征在于，上述透明质酸的交联剂选自聚氧乙烯双缩水甘油醚、1，2, 3, 4-二环氧丁烷、 1，2, 7, 8-二环氧辛烷、二乙二醇二缩水甘油醚、1，4- 丁二醇二缩水甘油醚中。
11. 根据权利要求7所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体的制备方法，其特 征在于，形成上述磷酸钙微球的磷酸钙选自磷酸一钙、磷酸二钙、磷酸二氢钙、磷酸三钙、磷 酸十钙中。
12. 根据权利要求7所述的生长因子负载用透明质酸-磷酸钙复合体的制备方法，其 特征在于，上述生长因子为选自上皮细胞生长因子、肝素结合性表皮生长因子样生长因子、 成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、骨形成蛋白系列中的骨形成蛋白-2、骨形成 蛋白-3、骨形成蛋白-3b、骨形成蛋白-4、骨形成蛋白-5、骨形成蛋白-6、骨形成蛋白-7、骨 形成蛋白-8、骨形成蛋白-9、骨形成蛋白-10、骨形成蛋白-11、骨形成蛋白-12、骨形成蛋 白-13、骨形成蛋白-14、骨形成蛋白-15、骨形成蛋白-16、骨形成蛋白-17、骨形成蛋白-18 的至少一种。
【文档编号】A61L27/52GK104334200SQ201280071922
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2012年3月29日
【发明者】金正婤, 郑洙贤, 柳眩丞, 徐晙赫 申请人:阿尔法生物有限公司