一种疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明关于一种疫苗组合物，其含有猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原和疫苗佐剂。本发明还提供一种制备疫苗组合物的方法，采用水溶性疫苗佐剂配制含猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原的混合物，将所述混合物作为稀释剂稀释猪瘟病毒抗原。本发明的疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，仅免疫1次就能够同时预防或治疗猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体三种病原感染，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。
【专利说明】一种疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明关于一种联合疫苗组合物，特别关于一种猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体三联混合疫苗组合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]猪瘟是猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。早年又称猪霍乱，对猪危害极为严重，给养猪业造成重大损失，但由于混合感染以及一些免疫抑制病原体的影响，造成了单用猪瘟疫苗防治效果的下降，猪瘟总有零星爆发。
[0003]猪圆环病毒2型(Porcine circovirus,缩写:PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCVl和PCV2。PCVl为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原，最早发现于加拿大(1991 )，很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，除PMWS外，TONS (猪皮炎与肾病综合征)、PNP (增生性坏死性肺炎)、PRDC (猪呼吸道疾病综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2及其相关的猪病，死亡率10%~30%不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。猪圆环病毒产生免疫抑制，容易发生烈性传染病。
[0004]猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体引发的一种慢性肺炎，又称猪地方流行性肺炎。长期以来，本病一直被认为是对养猪业造成重大经济损失、最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。本病虽为老病，但近年来由于经常和PRRSV、圆环病毒、猪瘟病毒等其它病原混合感染，造成重大的经济损失而突显出了其重要性。猪肺炎支原体是条件性致病菌，可使机体抵抗力降低，极易继发感染链球菌病等，使病情加重和病死率升高，极易继发感染猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等，使病情加重和病死率升高。
[0005]本领域需要能产生保护性免疫应答以同时抵抗猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型及猪瘟病毒感染的疫苗，减少所述混合感染的发生率和/或减轻所述感染的严重性，或预防与所述感染有关的临床表现，并且减少注射次数，降低动物的应激反应，有效控制猪瘟。
【发明内容】
[0006]本发明的目的正是要发明一种安全且有效的疫苗组合物，用于同时预防猪瘟、猪圆环病毒2型病及猪支原体肺炎三种病原的混合感染引起的猪瘟防治效果下降，具体来说，本发明提供一种猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的三联疫苗组合物，其包含猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原。
[0007]优选地，所述三联疫苗组合物，包含猪瘟活病毒抗原、猪圆环病毒2型灭活抗原和猪肺炎支原体灭活抗原。[0008]猪 瘟活病毒抗原是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪瘟病毒感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪瘟病毒为减毒形式的全病毒抗原，可以是选自细胞源猪瘟病毒、兔源猪瘟病毒、脾淋源猪瘟病毒中的一种或几种。
[0009]优选所述猪瘟病毒抗原为猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒抗原。所述猪瘟兔化弱毒株由中国兽医药品监察所保藏，保藏号AV1412。
[0010]优选地，本发明疫苗组合物中，所述的猪瘟病毒的含量为104_°~IO6 tlTCID5c/头份，更优选地IO5 tlTCID5ci/头份。
[0011]猪圆环病毒2型灭活抗原为选自猪圆环病毒2型全病毒抗原，含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何至少含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分中一种或几种。优选所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成份。
[0012]本发明中，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，本发明疫苗组合物中，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式的全病毒抗原，可以是江苏南农高科猪圆环病毒2型灭活疫苗的SH株、成都天邦和福州大北农猪圆环病毒2型灭活疫苗的DBN-SX07株、哈尔滨维科猪圆环病毒2型灭活疫苗的LG株、武汉科前猪圆环病毒2型灭活疫苗的WH株中的一种或几种。
[0013]优选地，本发明疫苗组合物，猪圆环病毒2型抗原为灭活形式的猪圆环病毒2型SH株全病毒。所述猪圆环病毒2型SH株(Porcine Circovirus Type2, strain SH),在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏号为CGMCC N0.2389。
[0014]优选地，本发明疫苗组合物中，所述的灭活的猪圆环病毒2型灭活前含量为IO4 0 ~IO6.0TCID50/ 头份，更优选地 IO5.0TCID50/ 头份。
[0015]猪肺炎支原体抗原是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的抗原的任何组合物。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是猪肺炎支原体全细胞菌苗，优选灭活形式的猪肺炎支原体细菌，含有至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分。优选地猪肺炎支原体抗原是灭活形式的J株或猪肺炎支原体HN0613株全细胞菌体。最优选地，猪肺炎支原体抗原是灭活形式的猪肺炎支原体HN0613株全细胞菌体。所述猪肺炎支原体 HN0613 (Mycoplasma hyopneumoniae strain HN0613)的保藏编号为:CCTCC NO:M2012230，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称=CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)。保藏日期为2012年6月13日。
[0016]猪支原体肺炎抗原还可以包含以下疫苗组合物中的任一种抗原如勃林格殷格翰公司的猪支原体肺炎灭活疫苗和西班牙海博莱生物大药厂的喜可舒的J株、美国先灵葆雅公司的猪支原体肺炎灭活疫苗(Myco Silcnccr")、美国普泰克公司的MycoGard、美国辉瑞公司的RespiFend的MH P-5722-3株、梅里亚动物保健公司的猪克喘的BQ14株、南京天邦猪肺炎支原体的168株、普莱柯猪肺炎支原体HN0613株中的一种或几种。
[0017]优选地，本发明疫苗组合物中，所述的灭活的猪肺炎支原体灭活前含量为107_°~110 0MHDCE/头份，更优选地108_°~IO9 ciMHDCE/头份，更优选地IO9 ciMHDCE/头份。[0018]优选地，所述疫苗组合物还包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂为GelOl (法国SEPPIC)、氢氧化招胶、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、蜂胶、ISA206 (法国SEPPIC)或ISA760VG (法国SEPPIC)中的一种或几种的组合。本发明所用的疫苗佐剂优选水溶性疫苗佐剂，例如Ge IOI佐剂。
[0019]优选地，所述疫苗组合物还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂优选为2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例混合所得的混合物。
[0020]本发明提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，包括如下步骤:采用疫苗佐剂配制含猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原的混合物，将猪瘟病毒抗原与冻干保护剂混合制备含猪瘟病毒抗原的组合物，然后用所述混合物稀释所述含猪瘟病毒抗原的组合物，得含猪圆环病毒2型抗原、猪肺炎支原体抗原和猪瘟病毒抗原的三联疫苗组合物。
[0021]优选地，先将猪肺炎支原体菌液和猪圆环病毒2型病毒液分别进行灭活，然后将灭活检验合格的猪肺炎支原体抗原和猪圆环病毒2型抗原分别进行浓缩，配苗，制备得到灭活苗部分；猪瘟病毒液加入冻干保护剂，制备得到活苗部分，用所述灭活苗部分稀释所述活苗部分，即得所述含有圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原和猪瘟病毒抗原的三联疫苗组合物。
[0022]优选地，所述灭活苗部分包含猪圆环病毒抗原、猪肺炎支原体抗原和GelOl佐剂，猪圆环病毒抗原含量为104_°~IO6 tlTCID5c/头份，猪肺炎支原体抗原含量为107_°~110 0MHDCE/头份，GelOl佐剂，基于所述灭活苗部分含量为12%(V/V);所述活苗部分中猪瘟病毒含量为104_°~IO6 tlTCID5ci/头份，用所述灭活苗部分稀释所述猪瘟活苗部分，优选1:1(头份/头份)，制成三联混合疫苗。
[0023]本发明还提供一种所述疫苗组合物在制备预防或治疗猪瘟、猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎的药品中的用途。
[0024]本发明提供的三联用疫苗组合物与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。
[0025]本发明的猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体感染三联疫苗，不会产生抗原成份的相互免疫干扰或影响。预防和治疗猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体感染的三联疫苗与猪瘟、猪圆环病毒2型或猪肺炎支原体的单疫苗的效力相比，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此，本发明的三联疫苗安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。
[0026] 此外，本发明提供的三联疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上三种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫I次就能够预防猪瘟、猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体三种病原感染，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。
【具体实施方式】[0027]以下配合本发明的优选实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。
[0028]本发明所述“每头份”或“/头份”是指每头猪每次用疫苗量。未作特别说明之处，在本发明的实施方式中所述“每头份”或“/头份”为2ml。本发明所述疫苗佐剂包括但不限于:Gel01 (法国SEPPIC)、氢氧化招胶、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、蜂胶、ISA206 (法国SEPPIC)或ISA760VG (法国SEPPIC)，优选水溶性疫苗佐剂，例如GelOl (法国 SEPPIC)。
[0029]本发明所述冻干保护剂的例子，包括但不限于:明胶水溶液、乳糖水溶液及其混合物，优选2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例混合所得的混合物。
[0030]实施例1猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原的制备
[0031]I菌株来源
[0032]制造及检验本品用的猪圆环病毒2型毒株为PCV-2毒株SH株，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏号为CGMCCN0.2389 。
[0033]制造及检验本品用的猪肺炎支原体囷株为HN0613株，在中国典型培养物保减中心(简称:CCTCC ;地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学)进行保藏，保藏日期:2012 年 6 月 13 日，保藏编号:CCTCC N0.M2012230。
[0034]制造及检验本品用的猪瘟病毒毒株为猪瘟兔化弱毒株(中国兽医药品监察所保藏，保藏号AV1412)。
[0035]2疫苗半成品的制备及检验
[0036]2.1生产用种子的制备
[0037]2.1.1猪肺炎支原体:
[0038]一级种子的繁殖:冻干菌种(HN0613株，保藏编号为CCTCC N0.M2012230)，用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37°C培养7d，选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37°C培养7d，作为一级种子。
[0039]二级种子的繁殖:取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37°C培养7d，经检验纯粹后作为二级种子。
[0040]2.1.2猪圆环病毒2型:将毒种用MEM液体培养基作1:9稀释，然后按细胞培养液体积的5% (V/V)接种于PK15细胞(购自中国兽药监察所)培养，37°C吸附30分钟，加入含4% (V/V)体积犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37°C培养4曰，冻融2~3次,收获病毒,作为生产用毒种。
[0041]2.1.3猪瘟病毒:用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3% (V/V)~0.5% (V/V)的病毒悬液，接种生长良好的ST细胞，置36~37°C继续培养。每隔4~5天收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液，经安全性、纯净性和特异性检验合格后，作为生产用毒种。在_15°C以下保存，不超过6个月。
[0042]2.2制苗用菌液和病毒液的制备
[0043]2.2.1猪肺炎支原体菌液的制备:将液体培养基培养的猪肺炎支原体二级种子液以1:10 (v/v)接种于液体培养基中。37°C下培养3飞日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养(继代次不超过6代)。培养结束后，取样，进行纯粹检验应纯粹。
[0044]2.2.2猪圆环病毒2型液的制备:用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞(购自ATCC)，倒去细胞培养液，将毒种液按细胞培养液体积5%的接种量接种于PK15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37°C吸附30分钟，加入细胞维持液，置37°C旋转(10-12转/小时)培养。每日观察广2次，细胞生长良好，37°C培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20°C以下保存，应不超过2个月。
[0045]2.2.3猪瘟病毒液的制备:取已形成良好单层的ST细胞培养瓶，弃去营养液，接种含3% (V/V)~5% (V/V)生产用细胞毒种的维持液，置36~37°C后继续培养。接毒后5天作第一次收获换液，以后每隔4天收获换液I次。各收次病毒培养液分别取样检验，应符合无菌检验和外源病毒检验标准规定。收获的病毒液置_15°C以下保存，应不超过3个月。
[0046]2.3含量测定
[0047]2.3.1猪肺炎支原体菌体含量测定:用PCR方法对培养物进行计数。10倍系列稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检出的最低限量为3Χ10_3μ8 (相当于1000个左右的菌体)，按稀释的倍数计数菌体数(沈青春，谭青松，王琴等人，PCR方法测定Mhp培养物菌数[J]，中国预防兽医学报,2006,28(1):55~57)。培养物含量应为I~2X 109MHDCE/ml。(MHDCE=猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即IMHDCE相当于I个猪肺炎支原体)。
[0048]2.3.2猪圆环病毒2型含量测定:将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取10_5、10_6、10_73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml,同时设立阴性对照，在37°C含5% (V/V) CO2的温箱中继续培养24小时，换含2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)测定每个稀释度含有PCV-2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病Μ TCID500 每 ml 病毒含量应≥ IO5 5TCID5tltj
[0049]2.3.3猪瘟病毒含量测定:各收次病毒培养液分别采用间接免疫荧光法进行TCID5tl测定。每ml病毒含量应≥IO6-5TCID500
[0050]2.4 灭活
[0051]2.4.1猪圆环病毒2型液的灭活:将检验合格病毒液，按病毒液总量加入终浓度为0.2%的甲醛溶液(V/V)，随即充分摇匀升温，当温度升至37°C时开始计时，保持18小时灭活完毕，加入0.2wt%的焦亚硫酸钠终止灭活,取样进行灭活检验。
[0052]2.4.2猪肺炎支原体菌液的灭活:将检验合格的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2%的甲醛溶液(V/V)，放37°C灭活，其间每隔4小时搅拌一次，24小时后取出，进行灭活检验。
[0053]2.5 浓缩
[0054]将灭活检验合格的猪肺炎支原体菌液和猪圆环病毒2型液分别采用超滤浓缩技术进行浓缩，浓缩后抗原含量分别为10nMHDCE/ml，107 0TCID50/mL.[0055]实施例2猪瘟、猪圆环和猪肺炎支原体三联混合疫苗组合物的制备
[0056]I猪圆环和猪肺炎支原体二联灭活疫苗制备
[0057]1.1防腐剂的配制
[0058]1% (w/v)的硫柳萊水溶液:lg硫柳萊溶解于100mL纯化水，121°C高压灭菌30min备用。[0059]1.2稀释剂的配制
[0060]无菌的PBS缓冲溶液:在900ml纯化水内溶解8g氯化钠、0.25g氯化钾、3.63g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，然后定容至1L，121°C高压灭菌30min备用。
[0061]1.3疫苗佐剂处理
[0062]GelOl (法国SEPPIC)佐剂灭菌:将GelOl (法国SEPPIC)佐剂转入可灭菌容器内，121 °C高压灭菌30min备用。
[0063]1.4 配苗
[0064]通过无菌操作，将实施例1中制备的浓缩猪圆环和猪肺炎支原体抗原与佐剂、稀释剂等按照不同配比混合后，用乳化机低速，例如在转速为10-12转/h下搅拌30min。灭活疫苗部分猪圆环病毒抗原含量为104_°~IO6 tlTCID5ci/头份，猪肺炎支原体抗原含量为IO7 0~IOici ciMHDCE/头份，GelOl佐剂，基于所述灭活苗部分含量为12% (V/V)。
[0065]2猪瘟疫苗的制备
[0066]将检验合格的猪瘟各收次病毒液，混合于同一容器，分别取适量混匀的病毒液进行浓缩和稀释，加入冻干保护剂(2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以l:l(v/v)比例配制)以1:1 (v/v)比例混合后充分混匀，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥，制成每头份病毒含量分别为 104_°TCID5(1、IO5 tlTCID5ci 和 IO6 tlTCID5ci 的活疫苗部分。
[0067]3三联苗的制备
[0068]将实施例1中所制备的浓缩抗原按照表1的配比进行疫苗配制。使用前取灭活苗部分稀释活苗部分。
[0069]表1疫苗配比具体实施案例
[0070]
【权利要求】
1.一种疫苗组合物，其特征在于，含有猪瘟病毒抗原、猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪瘟病毒抗原为猪瘟活病毒抗原，优选为猪瘟病毒兔化弱毒株全病毒。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原和/或含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成份。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪肺炎支原体抗原为猪肺炎支原体灭活抗原，优选为灭活的全细胞菌体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述猪瘟病毒含量为IO4-0~IO6 tlTCID5ci/头份，所述猪肺炎支原体含量为107_°~IOici ciMHDCE/头份，所述猪圆环病毒2型含量为IO4 0~IO6 0TCID50/头份。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂为GelOl (法国SEPPIC)、氢氧化招胶、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol )、蜂胶、ISA206 (法国SEPPIC)或ISA760VG (法国SEPPIC)中的一种或几种的组合。
7.根据权利要求1所述 的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为2wt%明胶水溶液与15wt%乳糖水溶液以l:l(v/v)比例混合所得的混合物。
8.一种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤:采用疫苗佐剂配制含猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原的混合物，将猪瘟病毒抗原与冻干保护剂混合制备含猪瘟病毒抗原的组合物，然后用所述混合物稀释所述含猪瘟病毒抗原的组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述猪圆环病毒2型抗原和猪肺炎支原体抗原的混合物为二联灭活疫苗，所述含猪瘟病毒抗原的组合物为冻干活疫苗。
10.权利要求1~7中任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或控制猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体混合感染的药品中的应用。
【文档编号】A61K39/02GK103908665SQ201310001446
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年1月5日 优先权日:2013年1月5日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司