专利名称：骨髓间充质干细胞来源的微泡在制备治疗肾损伤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于干细胞微泡技术领域，具体涉及骨髓间充质干细胞来源的微泡在制备治疗肾损伤药物中的应用。
背景技术：
慢性肾衰竭自然人群年发病率为9. 8 19. 8人/10万人口，且每年以8%左右的速度递增。尽管人们不懈努力探索慢性肾脏纤维化的机制，但至今仍无非常有效的延缓慢性肾脏病进展的方法。因此，迫切需要寻找肾损伤修复和有效防治慢性肾衰竭的新途径。干细胞是未分化的细胞，是一类具有自我更新、多向分化和高度增殖功能的细胞。现今干细胞与再生医学研究前景广阔，干细胞治疗的研究受到广泛关注。由于间充质干细胞(MSC)易获取、免疫原性低，并具有免疫调节功能等特征，已成为干细胞研究的主要热点。截止到2011年3月，美国FDA已批准应用骨髓间充质干细胞进行临床研究的试验方案共154项，其中已完成I期临床安全性试验109项，III期临床试验2项。我国政府每年投入该方面的科研经费已超过50亿。国内外学者将MSC应用于急性心肌梗死、脑梗死、肝功能衰竭、大面积烧伤等组织创伤修复上，取得了良好的效果。在心血管领域，研究者通过将MSC移植到动物心梗模型，促使心梗面积缩小，梗死缺血边缘区毛细血管增多，心功能得到改善，动物死亡率下降，并已尝试用于临床治疗。除了将MSC作为细胞移植治疗心肌梗死之外，对其它心肌疾病，如糖尿病心肌病、扩张型心肌病的治疗也有报道。也有学者研究证实MSC能够在移植肝组织内定居存活，在肝移植等肝脏损伤的状况下，正常肝细胞增殖受到抑制，肝脏大量分泌促进肝细胞生长的细胞因子，为移植的MSC提供定居所需的微环境，增加干细胞存活几率，从而进一步发挥组织修复作用。MSC修复损伤肾组织的研究起步相对较晚。有研究表明MSC具有极强的可塑性，在适宜条件下可跨胚层分化为多种组织细胞，不仅可分化为骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等；还具有向肾实质细胞分化的潜能，可分化为上皮细胞、系膜细胞、足细胞等多种肾脏细胞类型，从而参与肾脏损伤的修复和再生。Morigi等在针对骨髓来源的干细胞参与肾脏组织修复的研究中发现，间充质干细胞的移植能够明显改善肾脏功能，它是参与肾小管修复和肾功能恢复的主要细胞群体。继之，Togel等移植荧光标记的MSC至动物体内，发现仅在移植后l-2d内在肾脏的微血管部位检测到移植的MSC，在移植24h后，检测到炎症因子白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、Y-干扰素表达减少，抗炎因子白细胞介素10、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子a、Bcl-2则表达增加，但并未检测到移植MSC分化为肾小管上皮细胞、系膜细胞或足细胞等肾脏固有细胞。近年来，新近的研究表明MSC并未转化 为肾脏固有细胞，而是通过旁分泌作用减轻肾损害。MSC分泌一系列生长因子、细胞因子和趋化因子，这些因子能够防止损伤组织细胞的凋亡，刺激血管生成，改善局部环境，促进肾损伤修复，阻断肾脏纤维化的过程。
微泡是从细胞表面脱落或细胞区室释放的小圆形膜片(直径IOOnm-1 μ m)，微泡的生物学意义一直在很大程度上被忽视。新近的研究表明，微泡的分泌或脱落是由正常细胞而非凋亡细胞完成，它比凋亡小体的体积更小。微泡包含大量结构蛋白(如受体、粘附分子)，也含有来源于细胞膜上的脂类。微泡在细胞膜起泡过程中吞噬一些细胞质，因而富含来源于原始细胞的蛋白质、酶、mRNA和miRNA，随后微泡将这些物质运送至靶细胞。在mRNA、miRNA、蛋白质等的转运过程中，微泡扮演着“自然工程脂质体”的角色。研究发现人干细胞来源的微泡可以在体内将人的mRNA转运到小鼠细胞中，并导致蛋白的翻译。除了 mRNA，微泡还可将miRNA转运到靶细胞中；miRNA是天然的蛋白翻译调节因子，因此有可能通过微泡在邻近细胞间转运miRNA，从而实现干细胞调节基因的表达。新近，有学者通过对miRNA的分级聚类和相似性分析，证明在MSC来源的微泡穿梭运载miRNA的过程中，微泡对miRNA的分泌和区室化都是高度调控的过程。进一步的研究显示，MSC来源的微泡高表达miRNA，可能参与多种器官的发育、细胞的存活、分化以及免疫调节。已有证据表明微泡通过多种方式影响靶细胞的行为，如直接刺激靶细胞，或通过细胞间的受体传递，或向靶细胞传递某种受体蛋白，或横向传递遗传信息。但目前认为，微泡的主要作用是在靶细胞间传递信号和传送遗传信息。然而，现今尚未十分明确，微泡转运基因信息的功能是否在干细胞重塑和组织再生中发挥重要作用，它是否有助于干细胞通过旁分泌作用修复受损组织，这是非常有意义而值得深入探讨的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供骨髓间充质干细胞来源的微泡在制备治疗肾损伤药物中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下骨髓间充质干细胞来源的微泡在制备治疗肾损伤药物中的应用。其中，所述 的骨髓间充质干细胞来源于C57雄性小鼠，由南京医科大学实验动物中心提供。其中，本发明采用全骨髓法分离提取骨髓间充质干细胞，并通过以下方法进行MSC鉴定①成骨诱导，茜素红染色观察细胞钙盐沉积。②成脂肪诱导，油红O染色鉴定脂肪细胞。③流式细胞术MSC 表达 CD105、CD73 和 CD90，不表达 CD45、CD34、CD14、CDllb、CD79a、CD19和HLA-DR表面分子。其中，所述微泡按如下方法提取，采用全骨髓发分离提取骨髓间充质干细胞，待干细胞贴壁，生长良好，每次细胞换液前，收集培养液，随即将收集的培养液离心3000rpm，25min，吸取上清，保存于-80° c备用；待收集一定量的培养液上清后，集中进行高速冰冻离心，具体方法为将收集来的无细胞碎片上清培养液经100000g，4° C，离心lh，弃去上清，用含HEPES的无血清培养基-199冲洗，再经相同条件离心后，弃去上清，加入含有HEPES的无血清培养基-199吹打均匀，即得到MV悬液。间充质干细胞(MSC)来源的微泡(MV)能传递多种遗传信息和生物活性物质，可能在肾修复中起关键作用。MV治疗有望成为干细胞治疗的新方向,可能成为细胞治疗新的一族。我们的研究探讨了 MSC-MV的肾修复作用，发现MSC-MV能够显著改善受损肾脏的功能和形态。本成果在慢性肾脏纤维化的治疗方面有所突破，为慢性肾衰竭干细胞治疗提供了新途径。有益效果本发明通过体内、外实验分别验证MV在肾脏纤维化过程中的修复作用。在体外试验中，通过TGF-β I引起肾小管上皮细胞(ΗΚ2)纤维化，研究发现，在MV组中，很快细胞纤维化病变和细胞损伤程度明显减轻；在体内试验中，建立单侧输尿管梗阻(UUO)动物模型，研究发现，在UUO小鼠模型中，注射MV的UUO小鼠血肌酐(SCr )、血尿酸(UA)、尿蛋白水平均显著下降；进一步病理观察发现其肾脏组织损伤程度明显得到改善，肾脏间质纤维化、淋巴细胞浸润及肾小管肿胀坏死程度均有明显减轻，肾脏组织病理学评分显著下降。初步证明MSC、MSC-MV对体内、体外受损肾脏细胞均具有损伤修复作用。由此可以推测MV的肾损伤修复作用，将为间充质干细胞治疗提供新的途径，充满前景。
图1全骨髓法提取骨髓间充质干细胞形态及成骨、成脂培养。图2透射电镜(加速电压80KV)下观察微泡形态。图3倒置显微镜下观察各组HK2细胞形态。图4RT-PCR结果显示各组HK2细胞E-钙粘蛋白、α -平滑肌肌动蛋白的基因表达量。图5WeStern-Bl0t结果显示各组HK2细胞E-钙粘蛋白、α -平滑肌肌动蛋白的表达量。
图6各组小鼠肾脏病理切片结果(HE染色、MT染色)。图7各组小鼠肾功能、尿蛋白检测结果。图8MSC、MV锁核酸micor-RNA表达谱分析结果。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 :一、体外实验1、人近端肾小管上皮细胞(HK2)培养HK2购自美国ATCC公司。以含5%新生胎牛血清、青/链霉素(100 μ g/L)的M199培养液，置37° C孵箱(5%C02)内培养，每2天换液一次。待细胞密度达80% -90%，用含O. 25%胰酶(含lmmol/L EDTA)消化后1:2_3传代，记为P1。按上述方法继续传代培养，并按检测所需的细胞浓度接种，换无血清培养液，同步化24h后，换新鲜含血清培养液。按相应组别分别加入TGF-β I (6ng/ml)、MV(30l·! g/ml)，MSC (I X IO5)分别经48h、72h后，进行观察。2、分组(1)ΗΚ-2 对照组(2)HK-2+TGF_3 I
(3) HK-2+TGF-β I+MSC
(4) HK-2+TGF- β I+MV
3、观察内容(I)电镜下观察MSC胞吐MV的过程以及MV的形态；(2)48h、72h后，光镜下观察细胞形态；(3)48h、72h 后，western、RT-PCR 检测 a_SMA、E-cadherin 的表达；二、体内实验1、动物模型建立单侧输尿管梗阻模型(UUO)C57小鼠吸入麻醉后，于小鼠左侧中腹部切开皮肤，打开腹腔，钝性游离左侧输尿管，于中上1/3处以4-0线双重结扎，分层缝合关闭腹腔，逐层缝合皮肤。2、干细胞、微泡的提取(I)干细胞分离、培养和鉴定采用全骨髓法进行MSC分离培养。并通过以下方法进行MSC鉴定①成骨诱导，茜素红染色观察细胞钙盐沉积。②成脂肪诱导，油红O染色鉴定脂肪细胞。③流式细胞术MSC 表达 CD105、CD73 和 CD90，不表达 CD45、CD34、CD14、CDllb、CD79a、CD19 和 HLA-DR 表面分子。(2)微泡提取待干细胞贴壁，生长良好，每次细胞换液前，收集培养液，每次将收集的培养液离心3000rpm，25min ，保存于-80° c备用。待收集一定量的培养液后，集中进行高速冰冻离心，具体方法为将收集来的无细胞碎片上清培养液经100000g，4° C，离心lh，弃去上清，用含HEPES的无血清培养基-199冲洗，再经相同情况(IOOOOOg, 4° C，Ih,)离心后，弃去上清，加入含有HEPES的无血清培养基-199冲洗吹打，即得到MV悬液，过程中注意无菌操作3、实验分组(I)对照组10只，第7、14天各处死5只；(2 ) UUO组10只，第7、14天各处死5只；(3) UU0+MSC组，10只，第7天、14天各处死5只；(4) UU0+MV组，10只，第7天、14天各处死5只；4、观察内容小鼠一般情况、肾脏病理改变，免疫组织化学、尿量、体重、肾功能、尿生化、尿蛋白定量等，检测肾脏纤维化相关蛋白的表达情况。三、实验结果图1是电镜照片，其中，A.分离培养的MSCX 100，B. MSC成骨分化X100，C.MSC成脂肪分化X 100。图2，透射电镜(加速电压80KV)下观察到A. MSC胞吐MV的图像X 50，000 ；B MV呈圆形或椭圆形囊泡，直径约IOOnmX20，000 ；C MV内可见包含颗粒样物质X60，000。图3，倒置显微镜下观察各组细胞形态，A、B :对照组呈正常肾小管上皮细胞形态，细胞成多边形或卵圆形，排列规律，有典型的上皮细胞铺路石样的形态学特征。C、DiTGF-β I组加入TGF-β 16ng/ml分别培养48、72小时，即可见融合的HK2细胞间失去连接，铺路石样形态消失，代之以肥大、长梭形的成纤维细胞样外观，细胞生长排列紊乱，漂浮细胞增多，细胞发生分化，且72小时组纤维化损伤更加明显。E-H = MSC组、MV组可见，MSC、MV可在一定程度上抑制由TGF- β I诱导的ΗΚ2细胞形态改变，在光镜下，大多数细胞形态正常，排列紧密，细胞纤维化程度和范围减轻。
图4，RT-PCR结果显示，对照组HK2细胞高表达E-钙粘蛋白(E_cadherin)，低表达α -平滑肌肌动蛋白(α -SM);加入TGF- β I (6ng/ml)分别刺激48、72小时后，HK2细胞纤维化程度明显，a -SMA表达增加，E-cadherin表达减少，具有统计学差异，且刺激72小时后表现更为显著；同时可见，MSC、MV能够修复由TGF-β I刺激引起的纤维化，同TGF-β I组相比，E-cadherin 表达增加，a -SMA 表达减少。* HK2+TGF-^ I vs HK2、HK2+TGF- β I+MSC、HK2+TGF- β I+MV, P<0. 01 ；# HK2+TGF- β Ivs HK2、HK2+TGF- β I+MSC, HK2+TGF- β I+MV,Ρ〈0·05。图5, Western-Blot结果显示，ΗΚ2细胞正常高表达E-1丐粘蛋白(E-cadherin),低表达α -平滑肌肌动蛋白(α -SM);予TGF-β I (4ng/ml)刺激48、72小时后，HK2细胞纤维化程度明显，a -SMA表达增加，E-cadherin表达减少，且刺激72小时表现更为显著；MSC,MV能够修复由TGF-β I刺激引起的纤维化，同TGF-β I组相比，E-cadherin表达增加，a -SMA 表达减少。* HK2+TGF-^ I vs HK2、HK2+TGF_ β 1+MSC、HK2+TGF_ β I+MV, Ρ<0. 01 ；# HK2+TGF-β I vs HK2、HK2+TGF-P 1+MSC、HK2+TGF-β I+MV,Ρ<0.05。图6，对照组镜下未见明显结构改变，在UUO组7天、14天标本中，肾脏结构表现出明显的肾脏间质纤维化改变，小管上皮细胞水肿、变性、坏死，细胞脱落及脂肪或空泡样变性，基底膜裸露且不完整，肾小管官腔狭窄，部分可见红细胞阻塞，肾脏间质纤维化程度随时间进展而加重，伴大量单核及淋巴细胞浸润，且上述病变于14天时更加明显。在MSC、MV干预的UUO小鼠中，也可见部分小管扩张及官腔形成、坏死物质吸收，但肾小管上皮细胞核固缩、碎裂和溶解等细胞坏死和变性征象明显减轻，胶原成份聚积减少，小管轮廓尚清晰可见，基底膜较完整，间质红细胞数量减少，总体损伤程度减轻，肾脏组织学病理评分均显著下降(P〈0. 05)。A-B、a-b 为 HE 染色，D_H、d_h 为 Masson 染色。Control :对照组，UUO :单侧输尿管结扎组，UU0+MSC:单侧输尿管结扎+MSC组，UU0+MV:单侧输尿管结扎+MV组。图7，尾静脉 注射MSC或MV对单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾功能和蛋白尿的影响。UUO组小鼠注射MCS或MV后，A.各组尿素氮水平均呈下降趋势，仅UU014天组与MV注射14天组相比，未达统计学差异；B.血肌酐值明显下降，仅UU07天组与MSC注射组相t匕，未出现统计学差异；C.尿酸水平显著下降；D.蛋白尿显著降低。Control :对照组，UUO :单侧输尿管结扎组，UU0+MSC:单侧输尿管结扎+MSC组，UU0+MV:单侧输尿管结扎+MV组。*:UU0 vs Control, UU0+MSC, UU0+MV, P<0. 01 ;**:UU0 vs Control, UU0+MSC, P<0. 01;#:UU0vs Control, UU0+MV, P<0. 05 ;UUOvs Control, UU0+MSC, UU0+MV, P<0. 05;$:UU0 vsControl, UU0+MV, P<0. 01;$$:UU0 vs Control, P〈0. 05。图8，锁核酸micor-RNA表达谱分析结果显示MSC、MV中共检测到542种m1-RNA有荧光信号的表达，其中MSC为266种，MV为276种，进一步分析显示，MV中荧光表达强度超过MSC2倍的，共有81种。A、B :MSV、MV锁核酸micor-RNA基因芯片原始荧光信号图；C:MSV、MV锁核酸micor-RNA基因芯片表达谱；D :MSV、MV-micor-RNA表达差异分析。
权利要求
1.骨髓间充质干细胞来源的微泡在制备治疗肾损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述的微泡按如下方法提取，采用全骨髓发分离提取骨髓间充质干细胞，待干细胞贴壁，生长良好，每次细胞换液前，收集培养液，随即将收集的培养液离心3000rpm，25min，吸取上清，保存于-80° c备用；待收集一定量的培养液上清后，集中进行高速冰冻离心，具体方法为将收集来的无细胞碎片上清培养液经lOOOOOg，4° C，离心lh，弃去上清，用含HEPES的无血清培养基-199冲洗，再经相同条件离心后，弃去上清，加入含有HEPES的无血清培养基-199吹打均匀，即得到MV悬液。
全文摘要
本发明公开了骨髓间充质干细胞来源的微泡在制备治疗肾损伤药物中的应用。本发明通过体内、外实验分别验证MV在肾脏纤维化过程中的修复作用。在体外试验中，通过TGF-β1引起肾小管上皮细胞纤维化，研究发现，在MV组中，很快细胞纤维化病变和细胞损伤程度明显减轻；在体内试验中，建立单侧输尿管梗阻动物模型，研究发现，在UUO小鼠模型中，注射MV的UUO小鼠SCr、血UA、尿蛋白水平均显著下降；进一步病理观察发现其肾脏组织损伤程度明显得到改善，肾脏间质纤维化、淋巴细胞浸润及肾小管肿胀坏死程度均有明显减轻，肾脏组织病理学评分显著下降。初步证明MSC-MV对单侧输尿管梗阻小鼠具有肾损伤修复作用。
文档编号A61K35/28GK103040867SQ201310002968
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者赵卫红, 吴剑卿, 何娟, 朱蓓, 孙姝, 裴小华 申请人:江苏省人民医院