caspase重组酶原及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了caspase重组酶原及其编码基因与应用。所述caspase重组酶原氨基酸序列由组成具蛋白酶活性的caspase的蛋白质亚基序列及连接所述蛋白质亚基序列的连接肽序列组成；所述连接肽序列中的至少一个序列为包含3C蛋白酶裂解蛋白质的氨基酸识别序列。本发明所提供的蛋白质具有被3C蛋白酶特异性识别并激活的特性，使感染病毒的细胞发生凋亡并终止感染。本发明为抑制编码3C蛋白酶的病毒的复制和增殖及治疗和预防编码3C蛋白酶的病毒的感染提供了一种新的途径，具有十分广阔的应用前景。
【专利说明】caspase重组酶原及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及caspase重组酶原及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]3C蛋白酶是参与病毒组装中的一种裂解酶，是集丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶特性为一体的特殊酶类，3C蛋白酶的识别位点为Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro，切割位点在Gln-Gly之间，称为Q-G位点，而且其宿主细胞内无同源性位点存在。病毒感染宿主细胞，病毒RNA进入宿主细胞的细胞质后，病毒RNA立即作为mRNA指导合成出一个多聚蛋白，这一多聚蛋白在3C蛋白酶的作用下最终裂解成独立的结构蛋白，结构蛋白与病毒RNA进一步自组装成病毒颗粒。因此，3C蛋白酶在病毒各蛋白的成熟和子代病毒在宿主细胞体内的大量扩增中发挥着重要作用。
[0003]天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteine-containingaspartate-specificproteases, caspase)是与细胞凋亡有关的一类蛋白酶，在细胞凋亡的过程中起着关键性作用。caspase的成员较多，在人类已经鉴定了 14种不同的caspase。各种caspase都富含半胱氨酸，它们被激活后，能够在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割。在正常的细胞内，这些酶以休眠的酶原状态存在，在特定的条件下经过处理变为有催化活性的成熟酶。基于底物特异性和细胞功能，caspase可被分为3组:1炎症组:Caspase-1、_4、_5、_11、_12、_13、_14。II 调亡启始组:caspase_6、_8、_9、_10。III调亡效应组:caspase_2、_3、_7。 [0004]细胞凋亡的发生是一个复杂的caspase家族引导的蛋白酶级联反应过程，尽管对于不同的细胞或不同信号传导途径诱发的凋亡过程中参与的caspase有所不同，但caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也是凋亡的关键酶和执行者。caspase-3通常以单一的蛋白酶原前体形式存在，当无活性的caspase-3酶原前体接受到凋亡启动类caspase传递的死亡信号后，在Asp28和Aspl75处经蛋白水解成为P17(Ser29-Aspl75)和P12 (Serl76_Asp277)两个亚基。大、小亚基释放出来形成异源二聚体。两个异源二聚体组装成α2β 2四聚体后形成活性酶，通过其上含有的两个独立行使功能的催化位点 Hisl21 和 Glnl61-Alal62-Cysl63Argl64-Glyl65 (QACRG)将底物在 Asp位点切断，从而执行细胞凋亡功能，同时也能通过这种方式进行酶原前体的自我活化。研究表明，caspase-3可以导致所有类型的细胞发生染色质浓缩和形成DNA片段化。此外，caspase-3可以抑制白细胞介素18的生物学活性，caspase-3在细胞凋亡和炎症反应中起到关键的作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种蛋白质，该蛋白质具有如下作用:抑制编码3C蛋白酶的病毒在宿主细胞中的复制和/或增殖及预防和/或治疗编码3C蛋白酶的病毒的感染。
[0006]所述蛋白质的氨基酸序列为由组成具蛋白酶活性的caspase (天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)的蛋白质亚基序列及连接所述蛋白质亚基序列的连接肽序列组成；所述连接肽序列中的至少一个序列为包含3C蛋白酶裂解蛋白质的氨基酸识别序列；
[0007]所述具蛋白酶活性的caspase的蛋白质亚基应至少为2个。
[0008]在上述蛋白质中，所述连接肽序列可为序列表序列I的第148位至第155位序列或序列表序列2的第148位至第153位序列；
[0009]在上述蛋白质中，所述caspase具体可为caspase-3 ；
[0010]在上述蛋白质中，当所述caspase为caspase-3时,所述蛋白质亚基为大亚基和小亚基；所述大亚基的氨基酸序列具体可为序列表序列I的第I位至第147位序列；
[0011]和/或，所述小亚基的氨基酸序列具体可为序列表序列I的第156位至第257位序列。
[0012]上述蛋白质具体可为如下(a)或(b)的蛋白质:
[0013](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0014](b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0015]本发明保护上述任一所述蛋白质的编码基因。
[0016]所述基因为如下I) —4)中任一所述基因:
[0017]I)序列表序列3所示的DNA分子；
[0018]2 )序列表序列4所示的DNA分子；
[0019]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有caspase酶原功能的蛋白质的DNA分子；
[0020]4)与I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有caspase酶原功能的蛋白质的的DNA分子。
[0021 ] 本发明保护含有上述任一所述基因的表达盒、重组载体、重组细胞系或重组病毒。
[0022]所述重组载体具体可为在载体pcDNA3.1 (+)的多克隆位点处(如BamH I和Xho I酶切位点间)插入上述任一所述基因的重组载体。
[0023]本发明保护上述任一所述蛋白质、基因、表达盒、重组载体、重组细胞系和/或重组病毒在制备具有如下A)和B)中至少一种作用的产品(药物)中的应用:
[0024]A)抑制编码3C蛋白酶的病毒在宿主细胞中的复制和/或增殖；
[0025]B)预防和/或治疗编码3C蛋白酶的病毒的感染。
[0026]本发明还提供了具有上述A)和B)中至少一种作用的产品(药物)，其活性成分为上述任一所述蛋白质、基因、表达盒、重组表达载体、重组细胞系和/或重组病毒。
[0027]上述编码3C蛋白酶的病毒可为小RNA病毒，具体为柯萨奇病毒，在本发明的实施例中，所述柯萨奇病毒为美国典型菌种保藏中心(AmericanTissue Culture Colection(ATCC),网址:http://www.atcc.0rg/)的编号为VR-30的病毒,该病毒编码的3C蛋白酶的氨基酸序列如序列表序列6所示。
[0028]实验证明，用编码3C蛋白酶的病毒感染含有caspase-3重组酶原的重组细胞A和B及不含caspase-3重组酶原的重组细胞CK后，与CK相比，重组细胞A和B中病毒的复制和增殖减弱，病毒对细胞的毒性作用减弱，且细胞活性明显恢复。本发明所提供的蛋白质具有被3C蛋白酶特异性识别并激活的特性，使感染病毒的细胞发生凋亡并终止感染。本发明为抑制编码3C蛋白酶的病毒的复制和增殖及治疗和预防编码3C蛋白酶的病毒的感染提供了一种新的途径，具有十分广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为重组细胞内caspase-3的活性检测结果。
[0030]图2为柯萨奇病毒(CVB病毒)感染的重组细胞在不同培养时间下的caspase-3活性变化。
[0031]图3为实时荧光定量PCR检测经CVB病毒感染后6、7和8小时时重组细胞内CVB病毒保守基因在RNA水平的相对表达量。
[0032]图4为实施例6中CVB病毒感染后重组细胞的活性。
[0033]图5为实施例7中CVB病毒感染后重组细胞在不同培养时间下的活性变化。
【具体实施方式】[0034]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0035]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036]下述实施例中所用的生物材料的信息如下:
[0037]载体pcDNA3.1 (+):1nvitrogen，产品目录编号为 V790-20 ;
[0038]柯萨奇病毒(以下简称CVB病毒):美国典型菌种保藏中心(AmericanTissueCulture Colection (ATCC),网址:http://www.atcc.0rg/)的编号为 VR-30,该病毒编码的3C蛋白酶序列如序列表序列6所示；
[0039]293T/17 细胞:美国典型菌种保藏中心(AmericanTissue Culture Colection(ATCC),网址:http://www.atcc.0rg/)的编号为 CRL-11268?
[0040]实施例1、caspase-3重组酶原及其编码基因
[0041]将组成caspase-3 的两个亚基大亚基 P17 (Ser29Asp175)和小亚基 P12 (Ser176Asp277)用连接肽LEVLFQGP或VLFQGP连接(该连接肽能够被3C蛋白酶特异性识别并切割，使切割后形成的caspase-3具有活性且能启动细胞凋亡)，分别获得如序列表序列I所示的重组蛋白A和如序列表序列2所示的重组蛋白B，重组蛋白A和B即为caspase-3重组酶原。
[0042]合成序列表序列3所不的DNA分子A,该DNA分子编码重组蛋白A ；
[0043]合成序列表序列4所示的DNA分子B，该DNA分子编码重组蛋白B。
[0044]实施例2、重组表达载体的构建
[0045]将实施例1的DNA分子A或DNA分子B连入真核表达载体pcDNA3.1 (+)的多克隆位点上的BamH I和Xho I酶切位点间，获得重组载体pcDNA3.1⑴-A和pcDNA3.1⑴-B。经测序证实，所述重组载体pcDNA3.1(+)-Α是在pcDNA3.1(+)的多克隆位点上的BamH I和Xho I酶切位点间插入了序列表序列3所示的DNA分子A ;所述重组载体pcDNA3.1 (+) -B是在pcDNA3.1 (+)的多克隆位点上的BamH I和Xho I酶切位点间插入了序列表序列4所示的DNA分子B。
[0046]实施例3、重组细胞的获得
[0047]将实施例2获得重组载体pcDNA3.1 (+) -A和pcDNA3.1 (+) -B及空载体pcDNA3.1 (+)分别转染293T/17细胞，分别获得含重组载体pcDNA3.1(+)-Α的重组细胞A和含重组载体pcDNA3.1 (+) -B的重组细胞B及含空载体pcDNA3.1 (+)的重组细胞CK (对照)，具体转染方法如下:
[0048]I)转染用细胞的培养:转染前24h，用含10%胎牛血清的培养基RPMI1640(Hyclone公司，产品目录编号为SH30809.01B)，在37°C、5%C02条件下培养293T/17细胞，贴壁率达80%时进行转染；
[0049]2)转染:取96孔板，每孔加入(λ 1μ g的重组载体pcDNA3.1 (+)A或pcDNA3.1(+)-B或pcDNA3.1 (+)，用Opt 1-MEM?无血清培养基稀释至9.8 μ L ;每孔加入0.2 μ LThermoScientific TurboFect Tranfection Reagent转染试剂(Thermo Scientific公司，产品目录编号为#R0531)，涡旋混匀，室温静置15min ;获得10 μ L溶液加入到步骤I)获得的细胞培养液中混匀，37°C，5%C02条件下培养24h后获得重组细胞A、B和CK的培养液，用于实施例4一7的病毒感染。
[0050]实施例4、重组细胞中caspase-3重组酶原能被病毒3C蛋白酶特异性激活
[0051]1、构建含有3C蛋白酶编码序列的重组表达载体P⑶NA3.l_3c (即在载体pcDNA3.1 (+)的BamH I和Xho I酶切位点间插入序列表序列5所示的DNA片段，该片段编码3C蛋白酶)。将该重组表达载体pCDNA3.l-3c与重组载体pcDNA3.l(+)A、pcDNA3.1(+)-Β或pcDNA3.1(+)共转染293T/17细胞(方法与实施例3相同)，转染时在96孔板的每孔中加入 0.05 μ g 的重组载体 pcDNA3.1 (+)A、pcDNA3.1 (+) -B 或 pcDNA3.1 (+)，及 0.05 μ g 的重组载体pCDNA3.l-3c，转染后培养30h，获得含重组载体pcDNA3.1 (+) -A和pCDNA3.l_3c的重组细胞Al，含重组载体pcDNA3.1 (+) -B和p⑶NA3.l_3c的重组细胞BI和含重组载体pcDNA3.1 (+)和pCDNA3.l_3c的重组细胞CK1，分别测定同条件下培养的未转染的293T/17细胞(WT)及重组细胞Al、BI和CKl内caspase-3的活性。 [0052]结果:如图1所示，重组细胞Al和BI的caspase-3活性明显高于WT和CK1，说明重组质粒pcDNA3.1 (+) -A和pcDNA3.1 (+) -B能够编码caspase-3重组酶原并被载体PCDNA3.l-3c编码的3C蛋白酶特异性激活。
[0053]2、用编码3C蛋白酶的病毒-柯萨奇病毒(以下简称CVB病毒)对实施例3获得的重组细胞A、B和CK分别进行感染，并检测感染后重组细胞内caspase-3的活性。
[0054]结果:如图2所示，重组细胞A和B经CVB病毒感染后，细胞内的caspase-3活性较重组细胞CK显著升高，且在培养I一7小时内随感染时间的延长，caspase-3活性增加。结果表明:重组细胞A和B中表达了 caspase-3重组酶原，且caspase-3重组酶原能够被CVB病毒的3C蛋白酶特异性激活。
[0055]步骤2中用病毒对重组细胞进行感染的方法如下:将实施例3转染后培养24h的重组细胞A、B或CK的培养上清液吸出，与CVB病毒悬液混合(M0I=10000:1，即感染时病毒与细胞数量的比值为10000:1 )，4°C静置lh，用PBS洗去未结合的病毒，再加入新鲜含2%胎牛血清的RPMI1640 (Hyclone公司，产品目录编号为SH30809.01B)，置于37°C下分别培养1、2、5、7、8小时时进行caspase-3活性测定。
[0056]步骤I和2中的caspas-3活性测定方法具体如下:使用试剂盒caspase_Glo?3/7Assay(Promega)按照使用说明进行caspase-3活性测定，具体操作为:将试剂盒中的caspase-GloR3/7Reagent检测试剂平衡到室温，向每孔待测细胞培养液中加入IOOul该检测试剂，300—500rpm离心30s，使体系混合均匀，室温避光放置40min，取出IOOul于检测板中，利用单通道多标记检测仪(Perkin Elmer, EnVi sionTM2103Mulilabel Reader)中的荧光发光检测程序进行发光强度测定。
[0057]实施例5、重组细胞中caspase-3重组酶原减弱病毒在细胞内的复制
[0058]用CVB病毒对实施例3获得的重组细胞A、B和CK分别进行感染，并对感染后6h、7h和8h重组细胞中的CVB病毒基因组拷贝数进行实时荧光定量PCR。结果如图3所示，含有caspase-3重组酶原的重组细胞A和B在CVB感染6h后，细胞内CVB基因组拷贝数较重组细胞CK (对照)显著降低。结果表明，含有caspase-3重组酶原的细胞在CVB感染后，细胞内的caspase-3重组酶原被病毒的3C蛋白酶特异性激活，启动细胞凋亡，抑制病毒在细胞内的复制，从而减弱病毒的感染。
[0059]本实施例用病毒对重组细胞进行感染的方法如下:将实施例3转染后培养24h的重组细胞A、B或CK的培养上清液吸出，与CVB病毒悬液混合(MOI=1000: 1，即感染时病毒与细胞数量的比值为1000:1)，4°C静置lh，用PBS洗去未结合的病毒，再加入新鲜含2%胎牛血清的RPMI1640，置于37°C下分别培养6、7和8小时时提取重组细胞的总RNA。
[0060]本实施例实时荧光定量PCR分析的方法如下:将重组细胞的总RNA进行反转录，获得cDNA，以该cDNA为模板，用CVB保守基因的特异引物CVBF和CVBR进行实时荧光定量PCR扩增，以GAPDH为内参，引物为GAPDH-F和GAPDH-R。实时荧光定量PCR在B10_RadIQ5实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD (2001)报道的方法，即2_Λ Δετ计算相对表达量。 [0061 ] Δ Δ Cj (C^.Target ^T.Actin^ Timex ^ ^T.Target ^T.Actin^ TimeO
[0062]Time x表示任意时间点，Time0表示经GAPDH校正后I倍量的目标基因表达。
[0063]上述引物的序列(5’ 一3’)如下:
[0064]CVBF:5，-TCACAGAATACGGCTTCC-3，；
[0065]CVBR:5，-TTCACCTTGCTCATCATTG-3，；
[0066]GAPDH-F:5，-TGAGTATGTCGTGGAGTC-3，；
[0067]GAPDH-R: 5，-CAATCTTGAGTGAGTTGTCAT-3，。
[0068]实施例6、含有caspase-3重组酶原的重组细胞能够减弱病毒对细胞的毒性作用
[0069]用CVB病毒对实施例3获得的重组细胞A、B和CK分别进行感染，感染后12小时将培养上清吸出，加入到正常培养的293T/17细胞上，继续培养12小时，进行细胞活性测定。结果如图4所示，与重组细胞CK相比,含有caspase-3重组酶原的重组细胞A和B能够减弱病毒的感染，再感染后的细胞活性显著高于对照组。
[0070]本实施例用病毒对重组细胞进行感染的方法如下:将实施例3转染后培养24h的重组细胞A、B或CK的培养上清液吸出，与CVB病毒悬液混合(MOI=IOO: 1，即感染时病毒与细胞数量的比值为100:1)，4°C静置lh，用PBS洗去未结合的病毒，再加入新鲜含2%胎牛血清的RPMI1640，置于37°C下分别培养12小时后将培养上清吸出，加入到正常培养的293T/17细胞上，继续培养12小时，进行细胞活性测定。
[0071]本实施例细胞活性的测定方法如下:使用试剂盒Celltiter-GloilLuminescent (Promega)进行细胞活性测定，按照使用说明进行，具体操作为:将Celltiter-Glo~检测试剂平衡到室温，向含待测细胞培养液的每孔中加入IOOul检测试剂，在一个定轨振荡器上混合内容物2分钟，诱导细胞裂解；室温避光放置lOmin，取出IOOul于检测板中，利用单通道多标记检测仪(Perkin Elmer, EnVisionTM2103MulilabelReader)中的荧光发光检测程序进行发光强度测定，根据公式:相对细胞活性=实验组细胞活性测定值/对照组(同条件培养的未感染病毒的细胞)细胞活性测定值X 100%。
[0072]实施例7、含有caspase-3重组酶原的重组细胞受病毒感染后细胞活性的恢复
[0073]用CVB病毒对实施例3获得的重组细胞A、B和CK分别进行感染，并对感染后第
12、24、36和48小时的重组细胞进行细胞活性测定，其中，在感染后第24小时，将细胞培养上清换成新鲜的培养基继续培养。结果如图5所示，与重组细胞CK相比，含有caspase-3重组酶原的重组细胞A和B在更换培养液后第12 — 24小时，细胞活性有恢复的趋势。结果表明，caspase-3重组酶原对细胞内的CVB病毒有清除能力。
[0074]本实施例用病毒对重组细胞进行感染的方法如下:将实施例3转染后培养24h的重组细胞A、B或CK的培养上清液吸出，与CVB病毒悬液混合(MOI=IO: 1，即感染时病毒与细胞数量的比值为10:1)，4°C静置lh，用PBS洗去未结合的病毒，再加入新鲜含2%胎牛血清的RPMI1640，置于37°C下分别培养12、24、36和48小时，测定细胞活性，其中，在感染后第24小时，将细胞培养上清换成新鲜的含2%胎牛血清的RPMI1640继续培养。
[0075]本实施例 细胞活性的测定方法与实施例6的相同。
【权利要求】
1.一种蛋白质，其氨基酸序列为由组成具蛋白酶活性的caspase的蛋白质亚基序列及连接所述蛋白质亚基序列的连接肽序列组成；所述连接所述蛋白质亚基序列的连接肽序列中的至少一个序列为包含3C蛋白酶裂解蛋白质的氨基酸识别序列。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于:所述连接肽序列为序列表序列I的第148位至第155位序列或序列表序列2的第148位至第153位序列。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质,其特征在于:所述caspase为caspase_3； 所述蛋白质亚基为大亚基和小亚基； 所述大亚基的氨基酸序列具体可为序列表序列I的第I位至第147位序列； 和/或，所述小亚基的氨基酸序列具体可为序列表序列I的第156位至第257位序列。
4.根据权利要求1-3中任一所述的蛋白质，其特征在于:所述蛋白质是如下(a)或(b)的蛋白质: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
5.权利要求1一4中任一所述蛋白质的编码基因。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于:所述基因为如下1)一4)中任一所述基因: 1)序列表序列3所不的DNA分子； 2)序列表序列4所不的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有caspase酶原功能的蛋白质的DNA分子； 4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有caspase酶原功能的蛋白质的DNA分子。
7.含有权利要求5或6所述基因的表达盒、重组载体、重组细胞系或重组病毒。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为在载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点处插入权利要求5或6所述基因得到的重组载体。
9.权利要求1一8中任一所述蛋白质、基因、表达盒、重组载体、重组细胞系和/或重组病毒在制备具有如下A)和B)中至少一种作用的产品中的应用: A)抑制编码3C蛋白酶的病毒在宿主细胞中的复制和/或增殖； B)预防和/或治疗编码3C蛋白酶的病毒的感染。
10.具有权利要求9中A)和B)中至少一种作用的产品，其特征在于:所述产品的活性成分为权利要求1一8中任一所述蛋白质、基因、表达盒、重组表达载体、重组细胞系和/或重组病毒。
【文档编号】A61P31/14GK103923897SQ201310010109
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月11日 优先权日:2013年1月11日
【发明者】凌焱, 陈惠鹏, 李玉霞, 李炳娟, 孙芳, 毛艳, 李伟东, 刘刚, 岳俊杰, 张景海, 吴逊, 白东梅, 梁龙, 周围, 李北平, 高原 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所