专利名称：用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肉毒毒素的制剂，具体涉及ー种穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物及其制备方法和其应用，应用于经皮给药系统和化妆品领域。
背景技术：
穿膜肽是ー些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽，长度一般不超过30个氨基酸，可携帯比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞，毒副作用小。穿膜肽可以通过共价键或非共价键等方式携帯生物大分子物质透过细胞膜，如将蛋白质类、多肽类等大分子生物活性物质递送进入细胞内从而发挥治疗作用。肉毒毒素是肉毒杆菌产生的毒素，具有強烈的神经毒性，其生物学作用是在神经肌接头处阻滞神经末梢释放こ酰胆碱，从而治疗痉挛、強直等疾病。自1992年报道肉毒毒素在治疗眼肌痉挛时，同`时具有消除皱纹的作用，从此开创了肉毒毒素在美容领域的应用。2002年4月FDA批准肉毒毒素可以用于化妆品中，其效果显著、安全性高的特点受到广泛关注。目前肉毒毒素的主要给药途径为皮下注射或肌肉注射，肉毒毒素注射剂通过在面部肌肉内注射起到去除皱纹的治疗效果，面部肌肉包括皱眉肌、降眉肌、眼轮匝肌、颞肌等，目前对于注射用肉毒毒素在临床的使用的安全性和耐受性存在一定问题，且存在患者使用的顺应性不好等问题。因此，急需将肉毒毒素开发为新型的经皮给药制剂，基于穿膜肽的经皮转运作用，能促进肉毒毒素穿过皮肤屏障，达到作用部位，用于治疗包括眉间皱纹、鼻唇线、鱼尾纹、嘴角纹和抬头纹等，提高药物使用的安全性和顺应性，降低药物的毒副作用及耐受性。现有研究通过将A型肉毒毒素与HIV-TAT穿膜肽进行组合，用于A型肉毒毒素的局部施用和透皮递送，但是任然存在透皮吸收率差，应用范围较差等缺点。因此，为了进ー步地提高肉毒毒素的透皮吸收率，很有必要在现有技术的基础上设计研发一种透皮吸收率更高的肉毒毒素的外用经皮给药制剂。
发明内容
发明目的:本发明的目的是解决现有技术的不足，通过大量实验筛选，提供ー种高效透过率的穿膜肽与肉毒毒素进行组合，或将穿膜肽与肉毒毒素形成融合蛋白的方式，获得高透过率的穿膜肽介导的肉毒毒素外用经皮给药制剂。技术方案:为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为:
一种用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，所述穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在或者穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在时，所述的穿膜肽的氨基酸序列为精氨酸的直链聚合物Rn，其中n = 3 16。本发明通过大量实验，筛选了大量不同的氨基酸序列，实验结果表明，当肉毒毒素与精氨酸的直链聚合物Rn (其中n = 3 16)组合时，肉毒毒素的透皮转运速率与透过率显著高于现有技术的肉毒毒素经皮给药系统。作为另ー优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在时，所述的穿膜肽的序列为精氨酸的直链聚合物Rn，其中n = 3 16。作为另一更优选方案，穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在时，所述的穿膜肽的序列为具有HIV-1转录激活因子Tat蛋白转导结构域Tat_PTD49_57 序列片段。 作为优选方案，穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得的融合蛋白质，具体方法为:采用PCR方法扩增出穿膜肽与A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法连接后将扩增产物和大肠杆菌表达质粒pET-22b用限制性内切酶EcoR I以及Xho I双酶切后连接，并转化至大肠杆菌DH5ci中，用氨苄青霉素筛选阳性克隆，抽提经测序鉴定正确的重组质粒，转化至大肠杆菌BL21中，利用氨苄青霉素抗性筛选出构建成功的转化子，在37°C经IPTG诱导4小时后，收获融合蛋白并使用Ni亲和层析柱进行分离纯化，获得穿膜肽与A型肉毒毒素的融合蛋白。穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得的融合蛋白质，其中所述肉毒毒素融合蛋白质以约5単位到约为3000単位的量存在于所述的外用经皮给药制剂中。为了更好的促进肉毒毒素的透皮转运与透过，本发明通过大量实验筛选研究，结果表明，当穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得的融合蛋白质时，其透皮转运速率与透过率得到明显提高，取得了非常好的技术效果。作为优选方案，所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，所述的肉毒毒素未A、B、C、D、E、F或G型肉毒毒素。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，将穿膜肽与肉毒毒素的组合物或者穿膜肽与肉毒毒素形成的融合蛋白采用天然或合成的磷脂包裹制备成脂质体。实验结果表明，穿膜肽介导的肉毒毒素包裹制备成脂质体时，较未被脂质体包裹的肉毒毒素相比，其透皮转运速率与透过率得到明显提高，因此本发明可以将穿膜肽介导的肉毒毒素包裹制备成脂质体，方便用于经皮给药系统。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，所述的外用制剂为溶液剂、软膏剂、凝胶剂、乳剂、霜剂、气雾剂或贴剂。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，穿膜肽与肉毒毒素形成的组合物，外用制剂中含有肉毒毒素5単位到3000単位，外用制剂中穿膜肽的重量百分含量为0.01% 40%。作为优选方案，以上所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物在制备治疗眉间皱纹、鼻唇线、鱼尾纹、嘴角纹或抬头纹医学或美容病症中的应用。有益效果:本发明提供的组合物和现有技术相比具有以下优点:
本发明通过大量实验筛选，优选出最佳的氨基酸序列与肉毒毒素进行组合，另外本发明还通过大量实验将穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得融合蛋白质，通过经皮扩散实验研究表明，本发明提供的基于穿膜肽介导下的肉毒毒素转运速率与透过率明显高于现有技术的肉毒毒素外用给药制剂，具有很好的应用前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例进ー步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例1 R8 (8聚精氨酸)介导的肉毒毒素凝胶剂的制备
取I g卡波姆940，加蒸馏水适量，搅拌均匀后放置充分溶胀，得卡波姆凝胶溶液，然后取10单位的A型肉毒毒素,加入2 mL PBS缓冲液中，得到A型肉毒毒素溶液,然后采用固相合成法合成穿膜肽R8 (8聚精氨酸)，取I g R8 (8聚精氨酸)穿膜肽，溶解于2 mL PBS缓冲液中，得R8 (8聚精氨酸)穿膜肽溶液。将5 g丙ニ醇、10 gこ醇加入至上述卡波姆凝胶中，边加边搅拌，以三こ醇胺调pH至6.(T7.0，再以蒸馏水加至约90 g吋，将A型肉毒毒素PBS溶液和R8穿膜肽PBS溶液加入至凝胶中，充分搅拌混匀后，以蒸馏水加至100 g，即得A型肉毒毒素凝胶剂。实施例2 Tat_PTD49_57与肉毒毒素融合蛋白的制备
表达和纯化含有Tat-PTD49_57蛋白转导结构域(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)与A型肉毒毒素的融合蛋白质。采用PCR方法扩增出穿膜肽与A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法连接后将扩增产物和大肠杆菌表达质粒pET_22b (Novagen, c0.Ltd.，USA)用限制性内切酶EcoR I以及Xho I双酶切后连接，并转化至大肠杆菌DH5 a(Novagen, c0.Ltd.，USA)中，用氨苄青霉素筛选阳性克隆，抽提经测序鉴定正确的重组质粒，转化至大肠杆菌BL21中，利用氨苄青霉素抗性筛选出构建成功的转化子，在37°C经IPTG诱导4小时后，收获融合蛋白并使用Ni亲和层析柱进行分离纯化，最終获得纯度高于98%的Tat与A型肉毒毒素的融合蛋白。将此融合蛋白加入冻干保护剂后冻干得到冻干粉，用于经皮给药系统。
实施例3 Tat_PTD49_57与肉毒毒素融合蛋白气雾剂的制备
按实施例2所述方法，合成穿膜肽Tat-PTD49_57，然后与C型肉毒毒素形成融合蛋白。取30单位的穿膜肽与C型肉毒毒素融合蛋白，加入20 mL PBS缓冲液中，得融合蛋白溶液，灌装，即得Tat-PTD49_57与肉毒毒素融合蛋白气雾剂。实施例4穿膜肽R16 (16聚精氨酸)与肉毒毒素融合蛋白贴剂的制备
按实施例2所述方法，采用固相合成法合成穿膜肽R16，将R16与D型肉毒毒素重组表达获得融合蛋白，取10单位的R16与D型肉毒毒素融合蛋白，加入2 mL PBS缓冲液中，得融合蛋白溶液。取PVA，PVP，CMC-Na充分溶胀过夜，加入适量甘油与月桂氮酮，水浴溶解，得贴剂基质，将R16与D型肉毒毒素融合蛋白溶液加入贴剂基质中，搅拌溶解，形成透明的粘稠胶液，涂布于背衬层上，自然晾干至表面固化，得到D型肉毒毒素贴剂。实施例5 R8 (8聚精氨酸)与肉毒毒素融合蛋白脂质体的制备
按实施例2所述方法，合成穿膜肽R8与A型肉毒毒素融合蛋白，取10单位的R8与A肉毒毒素融合蛋白，加入2 mL PBS缓冲液中，得融合蛋白溶液。将磷脂与胆固醇混匀后，加无水こ醇溶解得到脂质溶液，蒸发，制成脂质薄膜。将脂质薄膜与水溶液水合，震荡，制成脂质分散水溶液，将脂质分散水溶液经过超声、乳化、过滤，调节PH至6.8，与R8与A型肉毒毒素融合蛋白溶液混合孵育，滤膜过滤，得到R8与A型肉毒毒素融合蛋白脂质体。实施例6 R8 (8聚精氨酸)与肉毒毒素融合蛋白脂质体凝胶制剂的制备将实施例1中的卡波姆凝胶溶液与实施例5制备得到的R8与C型肉毒毒素融合蛋白脂质体混合，缓慢搅拌均匀，制成R8 (8聚精氨酸)与肉毒毒素融合蛋白脂质体凝胶制剂。实施例7 穿膜肽介导的肉毒毒素的经皮扩散研究
1.实验动物
ICR小鼠，体重18 22g，雌雄各半，由南京医科大学实验动物中心提供，合格证编号:0011898 ;实验动物生产许可证号:SCXK (苏)2008-0004。2.实验分组
小鼠随即分组，每组8只，分别为生理盐水组，空白基质组，A型肉毒毒素溶液组(10U)，实施例1制备得到的R8与A型肉毒毒素组合物组(10U),实施例5制备得到的R8与A型肉毒毒素融合蛋白组(10U)，实施例2制备得到的Tat-PTD49_57与A肉毒毒素融合蛋白组。3.实验内容
剪去小鼠腹部鼠毛，面积为6 cm X 6 cm，将药物涂抹于去毛表面，开始计吋，8 h后麻醉处死，剥离腹部去毛皮肤，去除皮下组织和脂肪，生理盐水冲洗干净，获得完整的小鼠腹部皮肤。剪取有效扩散面积以内的皮肤称重，剪碎，匀浆后离心(5000 rpm)，用生理盐水反复冲洗沉淀后离心，将上清 液合井。以ELISA方法分别测定各组动物皮肤组织上清液中A型肉毒毒素含量。 4.实验结果
权利要求
1.一种用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，所述穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在或者穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。
2.根据权利要求1所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在干，穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在时，所述的穿膜肽的氨基酸序列为精氨酸的直链聚合物Rn，其中n = 3 16。
3.根据权利要求1所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在时，所述的穿膜肽的序列为精氨酸的直链聚合物Rn，其中n = 3 16。
4.根据权利要求1所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在时，所述的穿膜肽的序列为具有HIV-1转录激活因子Tat蛋白转导结构域Tat_PTD49_57序列片段。
5.根据权利要求1所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，通过基因重组的方式获得穿膜肽与肉毒毒素的融合蛋白，具体方法为:采用PCR方法扩增出穿膜肽与A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法连接后将扩增产物和大肠杆菌表达质粒pET-22b用限制性内切酶EcoR I以及Xho I双酶切后连接，并转化至大肠杆菌DH5a中，用氨苄青霉素筛选 阳性克隆，抽提经测序鉴定正确的重组质粒，转化至大肠杆菌BL21中，利用氨苄青霉素抗性筛选出构建成功的转化子，在37°C经IPTG诱导4小时后，收获融合蛋白并使用Ni亲和层析柱进行分离纯化，获得穿膜肽与A型肉毒毒素的融合蛋白。
6.根据权利要求1至4任一项所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，所述的肉毒毒素未A、B、C、D、E、F或G型肉毒毒素。
7.根据权利要求1所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，将穿膜肽与肉毒毒素的组合物或者穿膜肽与肉毒毒素形成的融合蛋白采用天然或合成的磷脂包裹制备成脂质体。
8.根据权利要求1至4任一项所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，所述的外用制剂为溶液剂、软膏剂、凝胶剂、乳剂、霜剂、气雾剂或贴剂。
9.根据权利要求2所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物，其特征在于，穿膜肽与肉毒毒素形成的组合物，外用制剂中含有肉毒毒素5単位到3000単位，外用制剂中穿膜肽的重量百分含量为0.01% 40%。
10.权利要求1至4任一项所述的用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物在制备治疗眉间皱纹、鼻唇线、鱼尾纹、嘴角纹或抬头纹医学或美容病症中的应用。
全文摘要
本发明公开了用于外用制剂的穿膜肽介导的肉毒毒素的组合物及其制备方法和应用，所述穿膜肽通过与肉毒毒素组合的形式存在或者穿膜肽通过与肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。本发明通过大量实验筛选，优选出最佳的氨基酸序列与肉毒毒素进行组合，另外本发明还通过大量实验将穿膜肽与肉毒毒素通过基因重组方式获得融合蛋白质，通过经皮扩散实验研究表明，本发明提供的基于穿膜肽介导下的肉毒毒素转运速率与透过率明显高于现有技术的肉毒毒素外用给药制剂，具有很好的应用前景。
文档编号A61K47/48GK103083651SQ20131002166
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者刘睿, 吴皓, 程建明, 卞慧敏, 王令充 申请人:南京中医药大学